Name: a hydrophobic tissue clearing method for rat brain tissue
Uploaded: 2020-12-23T15:00:00
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Ce travail a été financé par des subventions des NIH: NS100624, DA013137, HD043680, MH106392 et par T32 Training Grant 5T32GM081740

Tous les protocoles animaux ont été examinés et approuvés par le Comité de soins et d’utilisation des animaux de l’Université de Caroline du Sud.
1. Préparation de la solution d’élevage
<ol><li>Solution 1 (1 L) : À 900 mL de H2O désionisé, ajouter 100 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) et 2 mL de Triton X-100.</li>
	<li>Solution 2 (1 L) : À 900 mL de H2O désionisé, ajouter 100 mL de 10x PBS, 2mL de Tween-20 et 1 mL de solution mère ...

<ol>
	<li>Chung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+molecular+interrogation+of+intact+biological+systems.">Structural and molecular interrogation of intact biological systems.</a> Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).</li><li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-brain+imaging+with+single-cell+resolution+using+chemical+cocktails+and+computational+analysis.">Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis.</a> Cell. 157 (3), 726-739 (2014).</li><li>Ueda, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+clearing+and+its+applications+in+neuroscience.">Tissue clearing and its applications in neuroscience.</a> Nature Reviews Neuroscienc. 21, 298 (2020).</li><li>Renier, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iDISCO:+a+simple,+rapid+method+to+immunolabel+large+tissue+samples+for+volume+imaging.">iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging.</a> Cell. 159 (4), 896-910 (2014).</li><li>Renier, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+of+brain+activity+by+automated+volume+analysis+of+immediate+early+genes.">Mapping of brain activity by automated volume analysis of immediate early genes.</a> Cell. 165 (7), 1789-1802 (2016).</li><li>Reid, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+HIV-1+transgenic+rat+that+develops+HIV-related+pathology+and+immunologic+dysfunction.">An HIV-1 transgenic rat that develops HIV-related pathology and immunologic dysfunction.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 98, 9271-9276 (2001).</li><li>Vigorito, M., Connaghan, K. P., Chang, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+HIV-1+transgenic+rat+model+of+neuroHIV.">The HIV-1 transgenic rat model of neuroHIV.</a> Brain, Behavior, and Immunity. 48, 336-349 (2015).</li><li>McLaurin, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+connectivity+in+medium+spiny+neurons+of+the+nucleus+accumbens:+A+sex-dependent+mechanism+underlying+apathy+in+the+HIV-1+transgenic+rat.">Synaptic connectivity in medium spiny neurons of the nucleus accumbens: A sex-dependent mechanism underlying apathy in the HIV-1 transgenic rat.</a> Frontiers in Behavior Neurosciences. 12, 285 (2018).</li><li>Fitting, S., Booze, R. M., Mactutus, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+proteins,+Tat+and+gp120,+target+the+developing+dopamine+system.">HIV-1 proteins, Tat and gp120, target the developing dopamine system.</a> Current HIV Research. 13, 135-137 (2015).</li><li>Javadi-Paydar, M., Roscoe, R. F., Denton, A. R., Mactutus, C. F., Booze, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+and+cocaine+disrupt+dopamine+reuptake+and+medium+spiny+neurons+in+female+rat+striatum.">HIV-1 and cocaine disrupt dopamine reuptake and medium spiny neurons in female rat striatum.</a> PLos One. 12 (11), 0188404 (2017).</li><li>Bertrand, S. J., Mactutus, C. F., Harrod, S. B., Moran, L. M., Booze, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+proteins+dysregulate+motivational+processes+and+dopamine+circuitry.">HIV-1 proteins dysregulate motivational processes and dopamine circuitry.</a> Science Report. 8, 6152 (2018).</li><li>Denton, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+monoaminergic+and+histaminergic+circuit+dysregulation+following+long-term+HIV-1+protein+exposure.">Selective monoaminergic and histaminergic circuit dysregulation following long-term HIV-1 protein exposure.</a> Journal of neurovirology. 25 (4), 540-550 (2019).</li><li>Berendse, H. W., Groenewegen, H. J., Lohman, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartmental+distribution+of+ventral+striatal+neurons+projecting+to+the+mesencephalon+in+the+rat.">Compartmental distribution of ventral striatal neurons projecting to the mesencephalon in the rat.</a> Journal of Neuroscienc. 12 (6), 2079-2103 (1992).</li><li>Peyron, C., Petit, J. M., Rampon, C., Jouvet, M., Luppi, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forebrain+afferents+to+the+rat+dorsal+raphe+nucleus+demonstrated+by+retrograde+and+anterograde+tracing+methods.">Forebrain afferents to the rat dorsal raphe nucleus demonstrated by retrograde and anterograde tracing methods.</a> Neuroscience. 82 (2), 443-468 (1998).</li><li>Barrot, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Braking+dopamine+systems:+a+new+GABA+master+structure+for+mesolimbic+and+nigrostriatal+functions.">Braking dopamine systems: a new GABA master structure for mesolimbic and nigrostriatal functions.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscienc. 32 (41), 14094-14101 (2012).</li><li>Roostalu, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+whole-brain+3D+imaging+of+tyrosine+hydroxylase-labeled+neuron+architecture+in+the+mouse+MPTP+model+of+Parkinson's+disease.">Quantitative whole-brain 3D imaging of tyrosine hydroxylase-labeled neuron architecture in the mouse MPTP model of Parkinson's disease.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 12 (11), (2019).</li><li>Ransohoff, R., Cardona, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+myeloid+cells+of+the+central+nervous+system+parenchyma.">The myeloid cells of the central nervous system parenchyma.</a> Nature. 468, 253-262 (2010).</li><li>Rocha, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+Clearing+and+Light+Sheet+Microscopy:+Imaging+the+Unsectioned+Adult+Zebra+Finch+Brain+at+Cellular+Resolution.">Tissue Clearing and Light Sheet Microscopy: Imaging the Unsectioned Adult Zebra Finch Brain at Cellular Resolution.</a> Frontiers in Neuroanatomy. 13, 13 (2019).</li><li>Richardson, D. S., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clarifying+tissue+clearing.">Clarifying tissue clearing.</a> Cell. 162 (2), 246-257 (2015).</li></ol>

L’élimination des tissus offre une solution aux limites du protocole IHC traditionnel. Un échantillon transparent minimise la diffusion et l’absorption de la lumière, ce qui fournit un accès optique au niveau cellulaire aux tissus intacts18,19. Les techniques de nettoyage des tissus transforment un tissu transparent par délipidation, décoloration et décalcification avec l’administration de solvants. Une fois que l’indice de réfraction de l’écha...

Plusieurs techniques de nettoyage des tissus ont été validées pour une utilisation dans le cerveau : hydrogel, hydrophile et hydrophobe. Ces techniques visent à rendre un tissu transparent par délipidation, décoloration et décalcification via l’administration de solvants. Une fois que l’indice de réfraction de l’échantillon de tissu correspond à l’indice de réfraction du milieu d’imagerie choisi, une image claire de l’échantillon peut être obtenue. Les techniques à base d’hydrogel, telles que CLARITY, sécurisent les biomolécules dans les tissus en les reliant à des hydrogels à base d’acryl, ce qui empêche les dommages structurels et la perte de protéines1. Cependant, les techniques d’hydrogel utilisent des produits chimiques agressifs qui ont le potentiel d’endommager des tissus plus fragiles, et des échantillons de tissus plus denses peuvent ne pas être compatibles avec le protocole d’hydrogel. Certaines techniques d’hydrogel peuvent nécessiter un équipement coûteux ou entraîner une expansion des tissus. Les techniques hydrophiles, comme CUBIC, préservent la structure 3D par la formation de liaisons hydrogène dans le tissu2. L’expansion tissulaire peut également se produire dans certains protocoles hydrophiles. La capacité de nettoyage des techniques hydrophiles ne correspond souvent pas à la capacité des techniques hydrophobes, ce qui est important pour les tissus plus denses et plus épais3.
Les techniques hydrophobes sont généralement rapides, ne nécessitent pas d’équipement spécial et produisent un échantillon facile à manipuler et à stocker. iDISCO est une technique hydrophobe qui élimine le retrait qui peut se produire dans d’autres protocoles hydrophobes. À l’origine, la technique de nettoyage des tissus iDISCO a été décrite par Renier et al.4 pour les embryons et les organes adultes denses de souris. Cette technique élimine l’eau du tissu lors de l’étape initiale de déshydratation, réduisant ainsi la diffusion de la lumière. Le tissu est perméabilisé pendant le prétraitement pour permettre une pénétration profonde des anticorps. Les colorants Alexa Fluor dans le spectre rouge lointain sont utilisés pour l’immunomarquage afin d’éviter l’autofluorescence du tissu à des longueurs d’onde inférieures5. Les tissus qui ont subi des protocoles de nettoyage hydrophobes peuvent être manipulés facilement et peuvent être imagés plusieurs fois en raison de la longévité des colorants Alexa Fluor. S’ils sont correctement stockés, les tissus peuvent fournir des images pendant des mois à un an après le traitement initial.
Dans le présent protocole, l’anticorps tyrosine hydroxylase (TH), l’anticorps Iba1 et la sous-unité B de la toxine cholérique (CTB) ont été utilisés sur les cerveaux de rats témoins masculins et féminins et transgéniques (Tg) du VIH-1. Le rat HIV-1 Tg possède sept des neuf gènes qui composent le génome viral du VIH-1, ce qui conduit à un modèle non infectieux d’exposition à long terme à la protéine VIH-16,7,8. Des altérations dopaminergiques ont déjà été démontrées chez le rat Tg VIH-1, et le VIH-1 lui-même est une maladie inflammatoire, de sorte que le choix de l’anticorps était pertinent pour le plan expérimental9,10,11,12. CTB est un traceur qui se fixe aux neurones via la liaison ganglioside et peut être utilisé pour tracer les projections afférentes dans le cerveau. CTB a déjà été utilisé pour étudier les projections du noyau accumbens à la zone substantia nigra, deux zones du cerveau fortement impliquées dans les voies dopaminergiques13,14,15.
Dans ce protocole, TH servira de marqueur pour la production de dopamine, et Iba1 marquera la microglie activée. L’anticorps TH utilisé marque sélectivement une seule bande à environ 62 kDa qui correspond à la tyrosine hydroxylase. L’anticorps Iba1 correspond à la séquence carboxy-terminale Iba1. Les deux anticorps ont été élevés chez le lapin et étaient polyclonaux. Le CTB sera utilisé pour le traçage rétrograde des neurones de la zone du noyau accumbens à la zone de la substantia nigra. Le protocole actuel offre également une ligne directrice pour l’ajustement du protocole iDISCO original de deux manières distinctes: 1) réduction globale de la coloration de fond en modifiant les réactifs sériques dans les étapes de blocage, et 2) mise à l’échelle du temps d’incubation pour convenir à des échantillons de tissus plus importants. Dans l’ensemble, le présent protocole fournit des preuves continues que les techniques de clairage hydrophobe sont réalisables dans les tissus cérébraux du rat, n’ont aucune interaction néfaste perceptible avec les protéines virales du VIH-1 et sont compatibles avec les anticorps TH, les anticorps Iba1 et le CTB.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cholera Toxin Subunit B (Recombinant), Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C34775</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DBE</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>108014-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DCM</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>270997-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>472301-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>G46-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit Alexa Fluor Plus 647</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A32733</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>G9023-10mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>41121-0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iba1 primary antibody</td>
			<td>FUJIFILM Wako</td>
			<td>019-19741</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kwik-sil epoxy</td>
			<td>VWR</td>
			<td>70730-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34860-1l-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP2944-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion machine</td>
			<td>VWR</td>
			<td>70730-062</td>
			<td>mini pump variable flow</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PFA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>158127-3KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TH primary antibody</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>AB152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TritonX-100</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP151-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP337-500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a hydrophobic tissue clearing method for rat brain tissue

Les méthodes de nettoyage des tissus hydrophobes sont des procédures facilement ajustables, rapides et peu coûteuses qui permettent l’étude d’une molécule d’intérêt dans des échantillons de tissus non inaltérables. Les procédures traditionnelles d’immunomarquage nécessitent de couper l’échantillon en sections minces, ce qui limite la capacité d’étiqueter et d’examiner les structures intactes. Cependant, si le tissu cérébral peut rester intact pendant le traitement, les structures et les circuits peuvent rester intacts pour l’analyse. Les méthodes de nettoyage précédemment établies prennent beaucoup de temps pour nettoyer complètement le tissu, et les produits chimiques agressifs peuvent souvent endommager les anticorps sensibles. La méthode iDISCO élimine rapidement et complètement les tissus, est compatible avec de nombreux anticorps et ne nécessite aucun équipement de laboratoire spécial. Cette technique a été initialement validée pour l’utilisation dans les tissus de souris, mais le protocole actuel adapte cette méthode à l’imagerie des hémisphères de contrôle et des cerveaux de rats transgéniques. En plus de cela, le protocole actuel apporte également plusieurs ajustements au protocole préexistant pour fournir des images plus claires avec moins de taches d’arrière-plan. Les anticorps dirigés contre l’Iba-1 et la tyrosine hydroxylase ont été validés chez le rat transgénique VIH-1 et chez les rats témoins F344/N en utilisant la méthode actuelle de nettoyage des tissus hydrophobes. Le cerveau est un réseau entrelacé, où les structures travaillent ensemble plus souvent que séparément les unes des autres. L’analyse du cerveau en tant que système entier par opposition à une combinaison de pièces individuelles est le plus grand avantage de cette méthode d’éclaircissement du cerveau entier.

L’élimination complète de grandes sections de tissu cérébral de rat F344/N et VIH-1 a été réalisée à l’aide de ce protocole modifié de nettoyage des tissus hydrophobes. La figure 1 montre une image confocale typique de TH dans la région de substantia nigra. La figure 1A représente une coloration dense et positive. Les zones denses comme celles-ci peuvent être analysées en se concentrant à travers le plan « Z » pour confirmer une coloration...

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A Hydrophobic Tissue Clearing Method for Rat Brain Tissue

Nous présentons ici une méthode de nettoyage des tissus hydrophobes qui permet de visualiser les molécules cibles dans le cadre de structures cérébrales intactes. Cette technique a maintenant été validée pour les rats transgéniques F344/N et le VIH-1 des deux sexes.

Une méthode de nettoyage des tissus hydrophobes pour le tissu cérébral de rat

Hydrophobic tissue clearing methods are easily adjustable, fast, and low-cost procedures that allows for the study of a molecule of interest in unaltered ...

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