Name: a hydrophobic tissue clearing method for rat brain tissue
Uploaded: 2020-12-23T15:00:00
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이 작품은 NIH 보조금에 의해 지원되었다: NS100624, DA013137, HD043680, MH106392 및 T32 교육 보조금 5T32GM081740

모든 동물 프로토콜은 사우스 캐롤라이나 대학의 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 검토되고 승인되었습니다.
1. 주식 솔루션 준비
<ol><li>용액 1 (1 L): 900 mL의 탈이온화 H2O는 10배 인산완충식식염(PBS)과 트리톤 X-1002mL의 100mL를 추가한다.</li>
	<li>솔루션 2 (1 L): 900 mL의 deionized H2O, 10x PBS의 100 mL, 20 tween-20의 2mL 및 10 mg / mL Heparin 재고 용액의 1 mL을 추가하십시오.</li>
...

<ol>
	<li>Chung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+molecular+interrogation+of+intact+biological+systems.">Structural and molecular interrogation of intact biological systems.</a> Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).</li><li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-brain+imaging+with+single-cell+resolution+using+chemical+cocktails+and+computational+analysis.">Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis.</a> Cell. 157 (3), 726-739 (2014).</li><li>Ueda, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+clearing+and+its+applications+in+neuroscience.">Tissue clearing and its applications in neuroscience.</a> Nature Reviews Neuroscienc. 21, 298 (2020).</li><li>Renier, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iDISCO:+a+simple,+rapid+method+to+immunolabel+large+tissue+samples+for+volume+imaging.">iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging.</a> Cell. 159 (4), 896-910 (2014).</li><li>Renier, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+of+brain+activity+by+automated+volume+analysis+of+immediate+early+genes.">Mapping of brain activity by automated volume analysis of immediate early genes.</a> Cell. 165 (7), 1789-1802 (2016).</li><li>Reid, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+HIV-1+transgenic+rat+that+develops+HIV-related+pathology+and+immunologic+dysfunction.">An HIV-1 transgenic rat that develops HIV-related pathology and immunologic dysfunction.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 98, 9271-9276 (2001).</li><li>Vigorito, M., Connaghan, K. P., Chang, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+HIV-1+transgenic+rat+model+of+neuroHIV.">The HIV-1 transgenic rat model of neuroHIV.</a> Brain, Behavior, and Immunity. 48, 336-349 (2015).</li><li>McLaurin, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+connectivity+in+medium+spiny+neurons+of+the+nucleus+accumbens:+A+sex-dependent+mechanism+underlying+apathy+in+the+HIV-1+transgenic+rat.">Synaptic connectivity in medium spiny neurons of the nucleus accumbens: A sex-dependent mechanism underlying apathy in the HIV-1 transgenic rat.</a> Frontiers in Behavior Neurosciences. 12, 285 (2018).</li><li>Fitting, S., Booze, R. M., Mactutus, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+proteins,+Tat+and+gp120,+target+the+developing+dopamine+system.">HIV-1 proteins, Tat and gp120, target the developing dopamine system.</a> Current HIV Research. 13, 135-137 (2015).</li><li>Javadi-Paydar, M., Roscoe, R. F., Denton, A. R., Mactutus, C. F., Booze, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+and+cocaine+disrupt+dopamine+reuptake+and+medium+spiny+neurons+in+female+rat+striatum.">HIV-1 and cocaine disrupt dopamine reuptake and medium spiny neurons in female rat striatum.</a> PLos One. 12 (11), 0188404 (2017).</li><li>Bertrand, S. J., Mactutus, C. F., Harrod, S. B., Moran, L. M., Booze, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+proteins+dysregulate+motivational+processes+and+dopamine+circuitry.">HIV-1 proteins dysregulate motivational processes and dopamine circuitry.</a> Science Report. 8, 6152 (2018).</li><li>Denton, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+monoaminergic+and+histaminergic+circuit+dysregulation+following+long-term+HIV-1+protein+exposure.">Selective monoaminergic and histaminergic circuit dysregulation following long-term HIV-1 protein exposure.</a> Journal of neurovirology. 25 (4), 540-550 (2019).</li><li>Berendse, H. W., Groenewegen, H. J., Lohman, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartmental+distribution+of+ventral+striatal+neurons+projecting+to+the+mesencephalon+in+the+rat.">Compartmental distribution of ventral striatal neurons projecting to the mesencephalon in the rat.</a> Journal of Neuroscienc. 12 (6), 2079-2103 (1992).</li><li>Peyron, C., Petit, J. M., Rampon, C., Jouvet, M., Luppi, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forebrain+afferents+to+the+rat+dorsal+raphe+nucleus+demonstrated+by+retrograde+and+anterograde+tracing+methods.">Forebrain afferents to the rat dorsal raphe nucleus demonstrated by retrograde and anterograde tracing methods.</a> Neuroscience. 82 (2), 443-468 (1998).</li><li>Barrot, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Braking+dopamine+systems:+a+new+GABA+master+structure+for+mesolimbic+and+nigrostriatal+functions.">Braking dopamine systems: a new GABA master structure for mesolimbic and nigrostriatal functions.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscienc. 32 (41), 14094-14101 (2012).</li><li>Roostalu, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+whole-brain+3D+imaging+of+tyrosine+hydroxylase-labeled+neuron+architecture+in+the+mouse+MPTP+model+of+Parkinson's+disease.">Quantitative whole-brain 3D imaging of tyrosine hydroxylase-labeled neuron architecture in the mouse MPTP model of Parkinson's disease.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 12 (11), (2019).</li><li>Ransohoff, R., Cardona, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+myeloid+cells+of+the+central+nervous+system+parenchyma.">The myeloid cells of the central nervous system parenchyma.</a> Nature. 468, 253-262 (2010).</li><li>Rocha, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+Clearing+and+Light+Sheet+Microscopy:+Imaging+the+Unsectioned+Adult+Zebra+Finch+Brain+at+Cellular+Resolution.">Tissue Clearing and Light Sheet Microscopy: Imaging the Unsectioned Adult Zebra Finch Brain at Cellular Resolution.</a> Frontiers in Neuroanatomy. 13, 13 (2019).</li><li>Richardson, D. S., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clarifying+tissue+clearing.">Clarifying tissue clearing.</a> Cell. 162 (2), 246-257 (2015).</li></ol>

조직 정리는 기존의 IHC 프로토콜의 한계에 대한 해결책을 제공합니다. 투명한 시료는 빛의 산란과 흡수를 최소화하여,18,19의그대로 조직에 대한 세포 수준 광학 액세스를 제공한다. 조직 클리어링 기술은 용매의 투여와 함께 탈색, 탈색 및 탈화를 통해 조직을 투명하게 돌립니다. 조직 샘플의 굴절률이 선택한 이미징 매체의 굴절률과 일치하면 샘플이 ?...

여러 조직 클리어링 기술은 뇌의 사용을 위해 검증되었습니다: 소수겔, 친수성 및 소수성. 이러한 기술은 용매의 투여를 통해 탈색, 탈색 및 탈화를 통해 조직을 투명하게 전환하는 것을 목표로 합니다. 조직 샘플의 굴절률이 선택한 이미징 매체의 굴절률과 일치하면 시료의 명확한 이미지를 얻을 수 있습니다. CLARITY와 같은 하이드로겔 기반 기술은 아크릴 기반 하이드로겔에 연결하여 조직 내 생체 분자를 확보하여 단백질1의구조적 손상 과 손실을 방지합니다. 그러나 하이드로겔 기술은 더 연약한 조직을 손상시킬 수 있는 가능성이 있는 것보다 가혹한 화학 물질을 이용하며, 조밀한 조직 샘플은 하이드로겔 프로토콜과 호환되지 않을 수 있습니다. 특정 하이드로겔 기술은 고가의 장비가 필요하거나 조직 팽창으로 이어질 수 있습니다. 큐빅과 같은 친수성 기술은 조직2내의 수소 결합 형성을 통해 3D 구조를 보존한다. 조직 확장은 또한 특정 친수성 프로토콜에서 발생할 수 있습니다. 친성 기종의 청산 능력은 종종 소수성 기술이 가지고있는 능력과 일치하지 않으며, 이는 조밀하고 두꺼운 조직에 중요하다3.
소수성 기술은 일반적으로 빠르며 특수 장비가 필요하지 않으며 취급 및 보관이 쉬운 샘플을 생성합니다. iDISCO는 다른 소수성 프로토콜에서 발생할 수 있는 수축을 제거하는 소수성 기술입니다. 원래, iDISCO 조직 청산 기술은 쥐의 배아 및 조밀한, 성인 장기에 대한 Renier 외4에 의해 설명되었다. 이 기술은 초기 탈수 단계에서 조직에서 물을 제거하여 빛 산란을 줄입니다. 조직은 깊은 항체 침투를 허용하기 위하여 전처리 도중 permeabilized됩니다. 극한 스펙트럼에서 알렉사 플루오 염료는 낮은 파장5에서조직의 자가 불화를 피하기 위해 면역 라벨링에 사용된다. 소수성 청산 프로토콜을 거친 조직은 쉽게 처리될 수 있으며 Alexa Fluor 염료의 수명으로 인해 여러 번 이미지화될 수 있습니다. 제대로 저장하면 조직은 초기 처리 후 몇 달에서 1 년 동안 이미지를 제공 할 수 있습니다.
본 프로토콜에서 티로신 하이드록실라제(TH) 항체, 이바1 항체 및 콜레라 톡신 서브유닛 B(CTB)는 남성과 여성 제어 및 HIV-1 형질(Tg) 쥐 뇌 모두에 사용되었다. HIV-1 Tg 랫트는 HIV-1 바이러스 게놈을 구성하는 9개의 유전자 중 7개를 가지고 있으며, 이는 장기 HIV-1 단백질 노출6,7,8의비감염성 모델로 이어진다. 도파민성 변화는 이전에 HIV-1 Tg 랫트에서 입증되었으며, HIV-1 자체는 염증성 질환이므로 항체 선택은 실험 설계9,10,11,12와관련이 있었다. CTB는 신경질 옆 바인딩을 통해 뉴런에 부착하고 뇌의 포퍼런트 프로젝션을 추적하는 데 사용할 수있는 추적자입니다. CTB는 이전에 핵 accumbens에서 실질적인 니그라 영역, 도파민 경로와 크게 관련된 뇌의 두영역(13,14,15)에대한 투영을 연구하는 데 사용되었습니다.
이 프로토콜에서 TH는 도파민 생산을 위한 마커 역할을 하며, Iba1은 활성화된 마이크로글리아를 표시합니다. TH 항체는 티로신 하이드록실라제에 해당하는 약 62kDa에서 단일 대역에 선택적으로 라벨을 부착하는 데 사용되었습니다. Iba1 항체는 Iba1 카복시-말단 서열에 해당한다. 두 항체는 토끼에서 자랐고 폴리클론이었다. CTB는 핵 accumbens 영역에서 실질적인 니그라 영역까지 뉴런의 역행 추적에 사용됩니다. 현재 프로토콜은 또한 두 가지 방법으로 원래 iDISCO 프로토콜의 조정을 위한 지침을 제공합니다: 1) 차단 단계에서 혈청 시약을 변경하여 배경 염색의 전반적인 감소, 그리고 2) 큰 조직 샘플에 적합 하도록 인큐베이션 시간의 스케일링. 전반적으로, 본 프로토콜은 소수성 청산 기술이 쥐의 뇌 조직에서 실현 가능하고, HIV-1 바이러스 성 단백질과 눈에 띄는 해로운 상호 작용이 없으며, TH 항체, Iba1 항체 및 CTB와 호환된다는 지속적인 증거를 제공합니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cholera Toxin Subunit B (Recombinant), Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C34775</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DBE</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>108014-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DCM</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>270997-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>472301-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>G46-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit Alexa Fluor Plus 647</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A32733</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>G9023-10mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>41121-0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iba1 primary antibody</td>
			<td>FUJIFILM Wako</td>
			<td>019-19741</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kwik-sil epoxy</td>
			<td>VWR</td>
			<td>70730-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34860-1l-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP2944-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion machine</td>
			<td>VWR</td>
			<td>70730-062</td>
			<td>mini pump variable flow</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PFA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>158127-3KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TH primary antibody</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>AB152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TritonX-100</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP151-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP337-500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a hydrophobic tissue clearing method for rat brain tissue

소수성 조직 청산 방법은 변경되지 않은 조직 샘플에 대한 관심 분자의 연구를 허용하는 쉽게 조절 가능하고 빠르며 저렴한 절차입니다. 기존의 면역 라벨링 절차는 샘플을 얇은 섹션으로 절단해야 하므로 손상되지 않은 구조물에 라벨을 부착하고 검사하는 기능이 제한됩니다. 그러나, 뇌 조직이 처리 하는 동안 그대로 남아 있는 경우, 구조 및 회로 분석을 위해 그대로 남아 있습니다. 이전에 확립 된 클리어링 방법은 조직을 완전히 지우는 데 상당한 시간이 걸리며 가혹한 화학 물질은 종종 민감한 항체를 손상시킬 수 있습니다. iDISCO 방법은 조직을 신속하고 완전히 지우고 많은 항체와 호환되며 특별한 실험실 장비가 필요하지 않습니다. 이 기술은 마우스 조직에서 사용하기 위해 처음에 검증되었지만 현재 프로토콜은 이 방법을 제어 및 형질 전환 쥐 뇌의 이미지 반구에 적응시합니다. 이 외에도 현재 프로토콜은 기존 프로토콜을 여러 번 조정하여 배경 염색이 적은 선명한 이미지를 제공합니다. 이바-1 및 티로신 하이드록실라제에 대한 항체는 HIV-1 형질전환 쥐및 F344/N 대조군 쥐에서 현재소수성 조직 청산 방법을 사용하여 검증되었다. 뇌는 서로 분리된 것보다 구조가 더 자주 함께 작동하는 얽힌 네트워크입니다. 개별 조각의 조합반대로 전체 시스템으로 뇌를 분석하는 것은이 전체 뇌 청산 방법의 가장 큰 이점입니다.

F344/N 과 HIV-1 쥐 뇌 조직의 큰 부분을 완전히 지우는 이 변형된 소수성 조직 청산 프로토콜을 사용하여 달성되었다. 도 1은 실질적인 니그라 영역에서 TH에 대한 일반적인 공초점 이미지를 표시한다. 도 1A는 조밀하고 양적인 염색을 나타냅니다. 이와 같은 조밀한 영역은 "Z" 평면을 통해 초점을 맞추어 양성 염색 및 적절한 세포 형태를 확인함으로써 구문...

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A Hydrophobic Tissue Clearing Method for Rat Brain Tissue

여기서 우리는 손상되지 않은 뇌 구조의 일환으로 표적 분자의 보기를 허용하는 소수성 조직 청산 방법을 제시합니다. 이 기술은 지금 F344/N 통제 및 두 남녀의 HIV-1 형질전환 쥐를 위해 검증되었습니다.

쥐 뇌 조직을 위한 소수성 조직 청산 방법

Hydrophobic tissue clearing methods are easily adjustable, fast, and low-cost procedures that allows for the study of a molecule of interest in unaltered ...

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