Name: a hydrophobic tissue clearing method for rat brain tissue
Uploaded: 2020-12-23T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Hydrophobic Tissue Clearing Method for Rat Brain Tissue at JoVE.com

Dette arbeidet ble finansiert av NIH-tilskudd: NS100624, DA013137, HD043680, MH106392 & by T32 Training Grant 5T32GM081740

Alle dyreprotokoller ble gjennomgått og godkjent av Animal Care and Use Committee ved University of South Carolina.
1. Klargjøring av lagerløsning
<ol><li>Løsning 1 (1 L): Til 900 ml deionisert H2O tilsett 100 ml 10x fosfatbufret saltvann (PBS) og 2 ml Triton X-100.</li>
	<li>Oppløsning 2 (1 L): Til 900 ml deionisert H2O, tilsett 100 ml 10x PBS, 2 ml Tween-20 og 1 ml 10 mg/ml Heparin lagerløsning.</li>
	<li>Løsning 3 (500 ml): Til 400 ml oppløsning 1 tilsettes 1...

<ol>
	<li>Chung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+molecular+interrogation+of+intact+biological+systems.">Structural and molecular interrogation of intact biological systems.</a> Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).</li><li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-brain+imaging+with+single-cell+resolution+using+chemical+cocktails+and+computational+analysis.">Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis.</a> Cell. 157 (3), 726-739 (2014).</li><li>Ueda, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+clearing+and+its+applications+in+neuroscience.">Tissue clearing and its applications in neuroscience.</a> Nature Reviews Neuroscienc. 21, 298 (2020).</li><li>Renier, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iDISCO:+a+simple,+rapid+method+to+immunolabel+large+tissue+samples+for+volume+imaging.">iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging.</a> Cell. 159 (4), 896-910 (2014).</li><li>Renier, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+of+brain+activity+by+automated+volume+analysis+of+immediate+early+genes.">Mapping of brain activity by automated volume analysis of immediate early genes.</a> Cell. 165 (7), 1789-1802 (2016).</li><li>Reid, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+HIV-1+transgenic+rat+that+develops+HIV-related+pathology+and+immunologic+dysfunction.">An HIV-1 transgenic rat that develops HIV-related pathology and immunologic dysfunction.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 98, 9271-9276 (2001).</li><li>Vigorito, M., Connaghan, K. P., Chang, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+HIV-1+transgenic+rat+model+of+neuroHIV.">The HIV-1 transgenic rat model of neuroHIV.</a> Brain, Behavior, and Immunity. 48, 336-349 (2015).</li><li>McLaurin, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+connectivity+in+medium+spiny+neurons+of+the+nucleus+accumbens:+A+sex-dependent+mechanism+underlying+apathy+in+the+HIV-1+transgenic+rat.">Synaptic connectivity in medium spiny neurons of the nucleus accumbens: A sex-dependent mechanism underlying apathy in the HIV-1 transgenic rat.</a> Frontiers in Behavior Neurosciences. 12, 285 (2018).</li><li>Fitting, S., Booze, R. M., Mactutus, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+proteins,+Tat+and+gp120,+target+the+developing+dopamine+system.">HIV-1 proteins, Tat and gp120, target the developing dopamine system.</a> Current HIV Research. 13, 135-137 (2015).</li><li>Javadi-Paydar, M., Roscoe, R. F., Denton, A. R., Mactutus, C. F., Booze, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+and+cocaine+disrupt+dopamine+reuptake+and+medium+spiny+neurons+in+female+rat+striatum.">HIV-1 and cocaine disrupt dopamine reuptake and medium spiny neurons in female rat striatum.</a> PLos One. 12 (11), 0188404 (2017).</li><li>Bertrand, S. J., Mactutus, C. F., Harrod, S. B., Moran, L. M., Booze, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+proteins+dysregulate+motivational+processes+and+dopamine+circuitry.">HIV-1 proteins dysregulate motivational processes and dopamine circuitry.</a> Science Report. 8, 6152 (2018).</li><li>Denton, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+monoaminergic+and+histaminergic+circuit+dysregulation+following+long-term+HIV-1+protein+exposure.">Selective monoaminergic and histaminergic circuit dysregulation following long-term HIV-1 protein exposure.</a> Journal of neurovirology. 25 (4), 540-550 (2019).</li><li>Berendse, H. W., Groenewegen, H. J., Lohman, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartmental+distribution+of+ventral+striatal+neurons+projecting+to+the+mesencephalon+in+the+rat.">Compartmental distribution of ventral striatal neurons projecting to the mesencephalon in the rat.</a> Journal of Neuroscienc. 12 (6), 2079-2103 (1992).</li><li>Peyron, C., Petit, J. M., Rampon, C., Jouvet, M., Luppi, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forebrain+afferents+to+the+rat+dorsal+raphe+nucleus+demonstrated+by+retrograde+and+anterograde+tracing+methods.">Forebrain afferents to the rat dorsal raphe nucleus demonstrated by retrograde and anterograde tracing methods.</a> Neuroscience. 82 (2), 443-468 (1998).</li><li>Barrot, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Braking+dopamine+systems:+a+new+GABA+master+structure+for+mesolimbic+and+nigrostriatal+functions.">Braking dopamine systems: a new GABA master structure for mesolimbic and nigrostriatal functions.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscienc. 32 (41), 14094-14101 (2012).</li><li>Roostalu, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+whole-brain+3D+imaging+of+tyrosine+hydroxylase-labeled+neuron+architecture+in+the+mouse+MPTP+model+of+Parkinson's+disease.">Quantitative whole-brain 3D imaging of tyrosine hydroxylase-labeled neuron architecture in the mouse MPTP model of Parkinson's disease.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 12 (11), (2019).</li><li>Ransohoff, R., Cardona, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+myeloid+cells+of+the+central+nervous+system+parenchyma.">The myeloid cells of the central nervous system parenchyma.</a> Nature. 468, 253-262 (2010).</li><li>Rocha, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+Clearing+and+Light+Sheet+Microscopy:+Imaging+the+Unsectioned+Adult+Zebra+Finch+Brain+at+Cellular+Resolution.">Tissue Clearing and Light Sheet Microscopy: Imaging the Unsectioned Adult Zebra Finch Brain at Cellular Resolution.</a> Frontiers in Neuroanatomy. 13, 13 (2019).</li><li>Richardson, D. S., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clarifying+tissue+clearing.">Clarifying tissue clearing.</a> Cell. 162 (2), 246-257 (2015).</li></ol>

Vevsrydding tilbyr en løsning på begrensningene i tradisjonell IHC-protokoll. En gjennomsiktig prøve minimerer spredning og absorpsjon av lys, noe som gir optisk tilgang på cellenivå til intakt vev18,19. Vevsryddingsteknikker gjør et vev gjennomsiktig gjennom delipidasjon, decolorization og avkalking med administrering av løsningsmidler. Når brytningsindeksen i vevsprøven samsvarer med brytningsindeksen til det valgte bildemediet, vil prøven se helt gje...

Flere vevsryddingsteknikker er validert for bruk i hjernen: hydrogel, hydrofil og hydrofob. Disse teknikkene tar sikte på å gjøre et vev gjennomsiktig gjennom delipidasjon, decolorization og dekalcification via administrering av løsningsmidler. Når brytningsindeksen til vevsprøven samsvarer med brytningsindeksen til det valgte bildemediet, kan et klart bilde av prøven oppnås. Hydrogelbaserte teknikker, som CLARITY, sikrer biomolekyler i vevet ved å koble dem til akrylbaserte hydrogeler, noe som forhindrer strukturell skade og tap av proteiner1. Hydrogelteknikker bruker imidlertid sterke kjemikalier enn potensialet til å skade mer skjøre vev, og tettere vevsprøver er kanskje ikke kompatible med hydrogelprotokoll. Visse hydrogelteknikker kan kreve dyrt utstyr eller føre til vevsutvidelse. Hydrofile teknikker, som CUBIC, bevarer 3D-struktur gjennom dannelsen av hydrogenbindinger i vevet2. Vevsutvidelse kan også forekomme i visse hydrofile protokoller. Clearing evnen til hydrofile teknikker samsvarer ofte ikke med evnen som hydrofobe teknikker har, noe som er viktig for tettere og tykkere vev3.
Hydrofobe teknikker er vanligvis raske, krever ikke spesialutstyr og produserer en prøve som er lett å håndtere og lagre. iDISCO er en hydrofob teknikk som eliminerer krympingen som kan forekomme i andre hydrofobe protokoller. Opprinnelig ble iDISCO vevsryddingsteknikken beskrevet av Renier et al.4 for embryoer og tette, voksne organer av mus. Denne teknikken fjerner vann fra vevet i det første dehydreringstrinnet, og reduserer dermed lysspredningen. Vev permeabiliseres under forbehandling for å tillate dyp antistoff penetrasjon. Alexa Fluor fargestoffer i det fjerne røde spekteret brukes til immunisolering for å unngå autofluorescence av vevet ved lavere bølgelengder5. Vev som har gjennomgått hydrofobe clearingprotokoller, kan håndteres enkelt og kan avbildes flere ganger på grunn av levetiden til Alexa Fluor-fargestoffene. Hvis det er riktig lagret, kan vev gi bilder i måneder til et år etter første behandling.
I den nåværende protokollen ble tyrosinhydroksylase (TH) antistoff, Iba1 antistoff og Cholera Toxin Subunit B (CTB) brukt på både mannlig og kvinnelig kontroll og HIV-1 transgene (Tg) rottehjerner. HIV-1 Tg-rotten har syv av de ni genene som utgjør HIV-1-virusgenomet, noe som fører til en ikke-smittsom modell av langsiktig HIV-1 proteineksponering6,7,8. Dopaminerge endringer har tidligere blitt demonstrert i HIV-1 Tg-rotten, og HIV-1 selv er en inflammatorisk sykdom, så antistoffvalget var relevant for eksperimentell design9,10,11,12. CTB er en tracer som festes til nevroner via ganglioside binding og kan brukes til å spore afferent projeksjoner i hjernen. CTB har tidligere blitt brukt til å studere projeksjoner fra kjernen accumbens til substantia nigra området, to områder av hjernen tungt involvert med dopaminerge veier13,14,15.
I denne protokollen vil TH fungere som en markør for dopaminproduksjon, og Iba1 vil markere aktivert mikroglia. TH-antistoffet som brukes selektivt, merker et enkelt bånd på ca. 62 kDa som tilsvarer tyrosinhydroksylase. Iba1-antistoffet tilsvarer Iba1 karboksy-terminalsekvensen. Begge antistoffene ble oppdratt hos kanin og var polyklonale. CTB vil bli brukt til retrograd sporing av nevroner fra kjernen accumbens området til substantia nigra området. Den nåværende protokollen tilbyr også en retningslinje for justering av den opprinnelige iDISCO-protokollen på to forskjellige måter: 1) total reduksjon av bakgrunnsfargingen ved å endre serumreagensene i blokkeringstrinnene, og 2) skalering av inkubasjonstiden for å være egnet for større vevsprøver. Samlet sett gir den nåværende protokollen fortsatt bevis på at hydrofobe clearing teknikker er gjennomførbare i hjernen vev av rotte, har ingen merkbar skadelig interaksjon med HIV-1 virale proteiner, og er kompatible med TH antistoff, Iba1 antistoff, og CTB.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cholera Toxin Subunit B (Recombinant), Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C34775</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DBE</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>108014-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DCM</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>270997-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>472301-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>G46-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit Alexa Fluor Plus 647</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A32733</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>G9023-10mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>41121-0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iba1 primary antibody</td>
			<td>FUJIFILM Wako</td>
			<td>019-19741</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kwik-sil epoxy</td>
			<td>VWR</td>
			<td>70730-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34860-1l-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP2944-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion machine</td>
			<td>VWR</td>
			<td>70730-062</td>
			<td>mini pump variable flow</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PFA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>158127-3KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TH primary antibody</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>AB152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TritonX-100</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP151-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP337-500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a hydrophobic tissue clearing method for rat brain tissue

Hydrofobe vevsryddingsmetoder er lett justerbare, raske og rimelige prosedyrer som gjør det mulig å studere et molekyl av interesse for uendret vevsprøver. Tradisjonelle immunmerkende prosedyrer krever å kutte prøven i tynne seksjoner, noe som begrenser evnen til å merke og undersøke intakte strukturer. Men hvis hjernevev kan forbli intakt under behandling, kan strukturer og kretser forbli intakte for analysen. Tidligere etablerte clearingmetoder tar betydelig tid å fjerne vevet helt, og de harde kjemikaliene kan ofte skade følsomme antistoffer. iDISCO-metoden fjerner raskt og fullstendig vev, er kompatibel med mange antistoffer, og krever ikke noe spesielt laboratorieutstyr. Denne teknikken ble opprinnelig validert for bruk i musvev, men den nåværende protokollen tilpasser denne metoden til bildehalvdeler av kontroll og transgene rottehjerner. I tillegg til dette gjør den nåværende protokollen også flere justeringer i eksisterende protokoll for å gi klarere bilder med mindre bakgrunnsfarging. Antistoffer mot Iba-1 og tyrosinhydroksylase ble validert i HIV-1 transgen rotte og hos F344/N kontrollrotter ved hjelp av den nåværende hydrofobe vevsryddingsmetoden. Hjernen er et sammenvevd nettverk, hvor strukturer fungerer sammen oftere enn separat av hverandre. Å analysere hjernen som et helt system i motsetning til en kombinasjon av individuelle brikker er den største fordelen med hele denne hjerneryddingsmetoden.

Full rydding av store deler av både F344/N og HIV-1 rotte hjernevev ble oppnådd ved hjelp av denne modifiserte hydrofobe vevsryddingsprotokollen. Figur 1 viser et typisk konfokalt bilde for TH i substantia nigra-regionen. Figur 1A representerer tett, positiv farging. Tette områder som disse kan analyseres ved å fokusere gjennom "Z" -planet for å bekrefte positiv farging og riktig cellemorfologi. Figur 1B representerer sparsom p...

Watch this Scientific Journal Video about A Hydrophobic Tissue Clearing Method for Rat Brain Tissue at JoVE.com

A Hydrophobic Tissue Clearing Method for Rat Brain Tissue

Her presenterer vi en hydrofob vevsryddingsmetode som gjør det mulig å se på målmolekyler som en del av intakte hjernestrukturer. Denne teknikken er nå validert for F344/N-kontroll og HIV-1 transgene rotter av begge kjønn.

En hydrofob vevsryddingsmetode for rottehjernevev

Hydrophobic tissue clearing methods are easily adjustable, fast, and low-cost procedures that allows for the study of a molecule of interest in unaltered ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Preparation of Mouse Brain Tissue for Immunoelectron Microscopy

Transmission electron microscopy (TEM) is extremely useful for visualizing microglial, oligodendrocytic, astrocytic, and neuronal subcellular compartments ...

Intact Histological Characterization of Brain-implanted Microdevices and Surrounding Tissue

Intakt Histologisk Karakterisering av Brain-implantert Microdevices og omkringliggende vev

Research  into the design and utilization of brain-implanted microdevices, such as  microelectrode arrays, aims to produce clinically relevant devices ...

Immunohistochemical Analysis in the Rat Central Nervous System and Peripheral Lymph Node Tissue Sections

Immunhistokjemisk analyse i Rat sentralnervesystemet og perifer lymfeknute vevsdelene

Immunohistochemistry (IHC) provides highly specific, reliable and attractive protein visualization. Correct performance and interpretation of an IHC-based ...

Primer for Immunohistochemistry on Cryosectioned Rat Brain Tissue: Example Staining for Microglia and Neurons

Primer for Immunhistokjemi på Cryosectioned Rat hjernevev: Eksempel Farging for Microglia og Nevroner

Immunohistochemistry is a widely used technique for detecting the presence, location, and relative abundance of antigens in situ. This introductory level ...

Using Fluorescence Activated Cell Sorting to Examine Cell-Type-Specific Gene Expression in Rat Brain Tissue

Bruke fluorescensaktivert Cell Sorting å undersøke Cell-Type-Specific genuttrykk i Rat hjernevev

The brain is comprised of four primary cell types including neurons, astrocytes, microglia and oligodendrocytes. Though they are not the most abundant ...

Sublimation of DAN Matrix for the Detection and Visualization of Gangliosides in Rat Brain Tissue for MALDI Imaging Mass Spectrometry

Sublimering av DAN Matrix for søking og visualisering av gangliosider i Rat hjernevev for MALDI Imaging massespektrometri

Sample preparation is key for optimal detection and visualization of analytes in Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization (MALDI) Imaging Mass ...

A Rat Model of Mild Intrauterine Hypoperfusion with Microcoil Stenosis

En rotte modell av Mild Intrauterine Hypoperfusion med Microcoil stenose

Intrauterine hypoperfusion/ischemia is one of the major causes of intrauterine/fetal growth restriction, preterm birth, and low birth weight. Most studies ...

Novel Passive Clearing Methods for the Rapid Production of Optical Transparency in Whole CNS Tissue

Romanen passiv fjerne metoder for rask produksjon av optisk åpenhet i hele CNS vev

Since the development of CLARITY, a bioelectrochemical clearing technique that allows for three-dimensional phenotype mapping within transparent tissues, ...

Isolation of Cerebral Capillaries from Fresh Human Brain Tissue

Isolering av Cerebral kapillærer fra friske menneskelige hjernevev

Understanding blood-brain barrier function under physiological and pathophysiological conditions is critical for the development of new therapeutic ...