Name: a hydrophobic tissue clearing method for rat brain tissue
Uploaded: 2020-12-23T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Hydrophobic Tissue Clearing Method for Rat Brain Tissue at JoVE.com

Эта работа финансировалась грантами NIH: NS100624, DA013137, HD043680, MH106392 и грантом обучения T32 5T32GM081740

Все протоколы для животных были рассмотрены и одобрены Комитетом по уходу за животными и их использованию в Университете Южной Каролины.
1. Приготовление раствора на складе
<ol><li>Раствор 1 (1 л): К 900 мл деионизированногоH2O добавляют 100 мл 10x фосфатного буферного физиол...

<ol>
	<li>Chung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+molecular+interrogation+of+intact+biological+systems.">Structural and molecular interrogation of intact biological systems.</a> Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).</li><li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-brain+imaging+with+single-cell+resolution+using+chemical+cocktails+and+computational+analysis.">Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis.</a> Cell. 157 (3), 726-739 (2014).</li><li>Ueda, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+clearing+and+its+applications+in+neuroscience.">Tissue clearing and its applications in neuroscience.</a> Nature Reviews Neuroscienc. 21, 298 (2020).</li><li>Renier, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iDISCO:+a+simple,+rapid+method+to+immunolabel+large+tissue+samples+for+volume+imaging.">iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging.</a> Cell. 159 (4), 896-910 (2014).</li><li>Renier, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+of+brain+activity+by+automated+volume+analysis+of+immediate+early+genes.">Mapping of brain activity by automated volume analysis of immediate early genes.</a> Cell. 165 (7), 1789-1802 (2016).</li><li>Reid, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+HIV-1+transgenic+rat+that+develops+HIV-related+pathology+and+immunologic+dysfunction.">An HIV-1 transgenic rat that develops HIV-related pathology and immunologic dysfunction.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 98, 9271-9276 (2001).</li><li>Vigorito, M., Connaghan, K. P., Chang, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+HIV-1+transgenic+rat+model+of+neuroHIV.">The HIV-1 transgenic rat model of neuroHIV.</a> Brain, Behavior, and Immunity. 48, 336-349 (2015).</li><li>McLaurin, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+connectivity+in+medium+spiny+neurons+of+the+nucleus+accumbens:+A+sex-dependent+mechanism+underlying+apathy+in+the+HIV-1+transgenic+rat.">Synaptic connectivity in medium spiny neurons of the nucleus accumbens: A sex-dependent mechanism underlying apathy in the HIV-1 transgenic rat.</a> Frontiers in Behavior Neurosciences. 12, 285 (2018).</li><li>Fitting, S., Booze, R. M., Mactutus, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+proteins,+Tat+and+gp120,+target+the+developing+dopamine+system.">HIV-1 proteins, Tat and gp120, target the developing dopamine system.</a> Current HIV Research. 13, 135-137 (2015).</li><li>Javadi-Paydar, M., Roscoe, R. F., Denton, A. R., Mactutus, C. F., Booze, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+and+cocaine+disrupt+dopamine+reuptake+and+medium+spiny+neurons+in+female+rat+striatum.">HIV-1 and cocaine disrupt dopamine reuptake and medium spiny neurons in female rat striatum.</a> PLos One. 12 (11), 0188404 (2017).</li><li>Bertrand, S. J., Mactutus, C. F., Harrod, S. B., Moran, L. M., Booze, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+proteins+dysregulate+motivational+processes+and+dopamine+circuitry.">HIV-1 proteins dysregulate motivational processes and dopamine circuitry.</a> Science Report. 8, 6152 (2018).</li><li>Denton, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+monoaminergic+and+histaminergic+circuit+dysregulation+following+long-term+HIV-1+protein+exposure.">Selective monoaminergic and histaminergic circuit dysregulation following long-term HIV-1 protein exposure.</a> Journal of neurovirology. 25 (4), 540-550 (2019).</li><li>Berendse, H. W., Groenewegen, H. J., Lohman, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartmental+distribution+of+ventral+striatal+neurons+projecting+to+the+mesencephalon+in+the+rat.">Compartmental distribution of ventral striatal neurons projecting to the mesencephalon in the rat.</a> Journal of Neuroscienc. 12 (6), 2079-2103 (1992).</li><li>Peyron, C., Petit, J. M., Rampon, C., Jouvet, M., Luppi, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forebrain+afferents+to+the+rat+dorsal+raphe+nucleus+demonstrated+by+retrograde+and+anterograde+tracing+methods.">Forebrain afferents to the rat dorsal raphe nucleus demonstrated by retrograde and anterograde tracing methods.</a> Neuroscience. 82 (2), 443-468 (1998).</li><li>Barrot, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Braking+dopamine+systems:+a+new+GABA+master+structure+for+mesolimbic+and+nigrostriatal+functions.">Braking dopamine systems: a new GABA master structure for mesolimbic and nigrostriatal functions.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscienc. 32 (41), 14094-14101 (2012).</li><li>Roostalu, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+whole-brain+3D+imaging+of+tyrosine+hydroxylase-labeled+neuron+architecture+in+the+mouse+MPTP+model+of+Parkinson's+disease.">Quantitative whole-brain 3D imaging of tyrosine hydroxylase-labeled neuron architecture in the mouse MPTP model of Parkinson's disease.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 12 (11), (2019).</li><li>Ransohoff, R., Cardona, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+myeloid+cells+of+the+central+nervous+system+parenchyma.">The myeloid cells of the central nervous system parenchyma.</a> Nature. 468, 253-262 (2010).</li><li>Rocha, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+Clearing+and+Light+Sheet+Microscopy:+Imaging+the+Unsectioned+Adult+Zebra+Finch+Brain+at+Cellular+Resolution.">Tissue Clearing and Light Sheet Microscopy: Imaging the Unsectioned Adult Zebra Finch Brain at Cellular Resolution.</a> Frontiers in Neuroanatomy. 13, 13 (2019).</li><li>Richardson, D. S., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clarifying+tissue+clearing.">Clarifying tissue clearing.</a> Cell. 162 (2), 246-257 (2015).</li></ol>

Очистка тканей предлагает решение ограничений традиционного протокола IHC. Прозрачный образец минимизирует рассеяние и поглощение света, что обеспечивает оптический доступ на клеточном уровне к неповрежденным тканям18,19. Методы очистки тканей превращаю...

Несколько методов очистки тканей были проверены для использования в головном мозге: гидрогелевые, гидрофильные и гидрофобные. Эти методы направлены на то, чтобы сделать ткань прозрачной путем делипидации, обесцвечивания и декальцирования путем введения растворителей. Как только показатель преломления образца ткани соответствует индексу преломления выбранной среды визуализации, может быть получено четкое изображение образца. Методы на основе гидрогеля, такие как CLARITY, защищают биомолекулы в ткани, связывая их с гидрогелями на основе акрилов, что предотвращает структурное повреждение и потерю белков1. Тем не менее, методы гидрогеля используют агрессивные химические вещества, которые могут повредить более хрупкие ткани, и более плотные образцы тканей могут быть несовместимы с протоколом гидрогеля. Некоторые методы гидрогеля могут потребовать дорогостоящего оборудования или привести к расширению тканей. Гидрофильные методы, такие как CUBIC, сохраняют 3D-структуру путем образования водородных связей внутриткани 2. Расширение тканей также может происходить в определенном гидрофильном протоколе. Очищающая способность гидрофильных методов часто не соответствует способности, которой обладают гидрофобные методы, что важно для более плотных и толстых тканей3.
Гидрофобные методы, как правило, быстрые, не требуют специального оборудования и производят образец, который прост в обращении и хранении. iDISCO - это гидрофобный метод, который устраняет усадку, которая может возникнуть в другом гидрофобном протоколе. Первоначально метод очистки тканей iDISCO был описан Renier et al.4 для эмбрионов и плотных взрослых органов мышей. Этот метод удаляет воду из ткани на начальной ступени обезвоживания, тем самым уменьшая рассеяние света. Ткань проницаема во время предварительной обработки, чтобы обеспечить глубокое проникновение антител. Красители Alexa Fluor в дальне-красном спектре используются для иммуномаркировки, чтобы избежать автофлуоресценции ткани на более низких длинах волн5. Ткани, прошедшие гидрофобные протоколы очистки, могут легко обрабатываться и могут быть изображены несколько раз благодаря долговечности красителей Alexa Fluor. При правильном хранении ткани могут предоставлять изображения в течение нескольких месяцев до года после первоначальной обработки.
В настоящем протоколе антитело к тирозингидроксилазе (TH), антитело Iba1 и субъединица токсина холеры B (CTB) использовались как на мужском, так и на женском контроле и трансгенном (Tg) мозге крыс с ВИЧ-1. Крыса ВИЧ-1 Tg обладает семью из девяти генов, составляющих вирусный геном ВИЧ-1, что приводит к неинфекционной модели длительного воздействия белка ВИЧ-16,7,8. Дофаминергические изменения ранее были продемонстрированы у крысы с ВИЧ-1 Tg, а сам ПОИВ-ВИЧ-1 является воспалительным заболеванием, поэтому выбор антител был актуален для экспериментальной конструкции9,10,11,12. CTB - это индикатор, который прикрепляется к нейронам через связывание ганглиозидов и может быть использован для отслеживания афферентных проекций в мозге. CTB ранее использовался для изучения проекций от прилежания ядра к области нигры субстанции, двух областей мозга, сильно связанных с дофаминергическими путями13,14,15.
В этом протоколе TH будет служить маркером для выработки дофамина, а Iba1 будет маркивать активированную микроглию. Используемое антитело TH избирательно маркирует одну полосу при приблизительно 62 кДа, что соответствует тирозинде гидроксилазе. Антитело Iba1 соответствует карбокси-терминальной последовательности Iba1. Оба антитела были выращенные у кролика и были поликлональными. CTB будет использоваться для ретроградного отслеживания нейронов от области прилежащих ядер до области substantia nigra. Текущий протокол также предлагает руководство по корректировке оригинального протокола iDISCO двумя различными способами: 1) общее уменьшение фонового окрашивания путем изменения реагентов сыворотки на этапах блокировки и 2) масштабирование времени инкубации, чтобы быть пригодным для более крупных образцов тканей. В целом, настоящий протокол предоставляет постоянные доказательства того, что методы гидрофобной очистки возможны в тканях мозга крысы, не имеют заметных вредных взаимодействий с вирусными белками ВИЧ-1 и совместимы с антителами TH, антителами Iba1 и CTB.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cholera Toxin Subunit B (Recombinant), Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C34775</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DBE</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>108014-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DCM</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>270997-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>472301-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>G46-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit Alexa Fluor Plus 647</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A32733</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>G9023-10mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>41121-0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iba1 primary antibody</td>
			<td>FUJIFILM Wako</td>
			<td>019-19741</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kwik-sil epoxy</td>
			<td>VWR</td>
			<td>70730-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34860-1l-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP2944-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion machine</td>
			<td>VWR</td>
			<td>70730-062</td>
			<td>mini pump variable flow</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PFA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>158127-3KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TH primary antibody</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>AB152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TritonX-100</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP151-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP337-500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a hydrophobic tissue clearing method for rat brain tissue

Гидрофобные методы очистки тканей — это легко регулируемые, быстрые и недорогие процедуры, которые позволяют изучать интересующую молекулу в неизмененных образцах тканей. Традиционные процедуры иммуномаркировки требуют разрезания образца на тонкие срезы, что ограничивает возможность маркировки и изучения неповрежденных структур. Однако, если ткань мозга может оставаться неповрежденной во время обработки, структуры и схемы могут оставаться нетронутыми для анализа. Ранее установленные методы очистки занимают значительное время, чтобы полностью очистить ткани, а агрессивные химические вещества часто могут повредить чувствительные антитела. Метод iDISCO быстро и полностью очищает ткани, совместим со многими антителами и не требует специального лабораторного оборудования. Этот метод был первоначально одобрен для использования в тканях мышей, но текущий протокол адаптирует этот метод к изображению полушарий контроля и трансгенного мозга крыс. В дополнение к этому, настоящий протокол также вносит несколько корректировок в ранее существовавающий протокол, чтобы обеспечить более четкие изображения с меньшим фоновым окрашиванием. Антитела к Iba-1 и тирозингидрилазе были подтверждены у трансгенных крыс с ВИЧ-1 и у контрольных крыс F344/N с использованием настоящего гидрофобного метода очистки тканей. Мозг представляет собой переплетеную сеть, где структуры работают вместе чаще, чем по отдельности друг от друга. Анализ мозга как целой системы в отличие от комбинации отдельных частей является наибольшим преимуществом этого метода очистки всего мозга.

Полная очистка больших участков ткани мозга крыс f344/N и ВИЧ-1 была достигнута с использованием этого модифицированного протокола очистки гидрофобной ткани. На рисунке 1 показано типичное конфокальное изображение для TH в области черновой субстанции. Рисунок 1?...

Watch this Scientific Journal Video about A Hydrophobic Tissue Clearing Method for Rat Brain Tissue at JoVE.com

A Hydrophobic Tissue Clearing Method for Rat Brain Tissue

Здесь мы представляем гидрофобный метод очистки тканей, который позволяет рассматривать молекулы-мишени как часть неповрежденных структур мозга. Этот метод в настоящее время подтвержден для борьбы с F344/N и трансгенных крыс с ВИЧ-1 обоих полов.

Гидрофобный метод очистки тканей для ткани мозга крыс

Hydrophobic tissue clearing methods are easily adjustable, fast, and low-cost procedures that allows for the study of a molecule of interest in unaltered ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Preparation of Mouse Brain Tissue for Immunoelectron Microscopy

Подготовка ткани мозга мыши для иммуноэлектронной микроскопии

Transmission electron microscopy (TEM) is extremely useful for visualizing microglial, oligodendrocytic, astrocytic, and neuronal subcellular compartments ...

Intact Histological Characterization of Brain-implanted Microdevices and Surrounding Tissue

Гистологическая характеристика интактного мозга имплантированных Microdevices и окружающих тканей

Research  into the design and utilization of brain-implanted microdevices, such as  microelectrode arrays, aims to produce clinically relevant devices ...

Immunohistochemical Analysis in the Rat Central Nervous System and Peripheral Lymph Node Tissue Sections

Иммуногистохимического анализа в нервной системе крыс центральной и периферической ткани лимфатического узла Разделы

Immunohistochemistry (IHC) provides highly specific, reliable and attractive protein visualization. Correct performance and interpretation of an IHC-based ...

Primer for Immunohistochemistry on Cryosectioned Rat Brain Tissue: Example Staining for Microglia and Neurons

Грунтовка для иммуногистохимии Cryosectioned ткани мозга крыс: Пример окрашивания для микроглии и нейронов

Immunohistochemistry is a widely used technique for detecting the presence, location, and relative abundance of antigens in situ. This introductory level ...

Using Fluorescence Activated Cell Sorting to Examine Cell-Type-Specific Gene Expression in Rat Brain Tissue

The brain is comprised of four primary cell types including neurons, astrocytes, microglia and oligodendrocytes. Though they are not the most abundant ...

Sublimation of DAN Matrix for the Detection and Visualization of Gangliosides in Rat Brain Tissue for MALDI Imaging Mass Spectrometry

Сублимация DAN Матрицы для обнаружения и визуализации ганглиозидов в Rat ткани головного мозга для MALDI масс-спектрометрии изображений

Sample preparation is key for optimal detection and visualization of analytes in Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization (MALDI) Imaging Mass ...

A Rat Model of Mild Intrauterine Hypoperfusion with Microcoil Stenosis

Крыса модель мягкой внутриматочная гипоперфузии со стенозом Microcoil

Intrauterine hypoperfusion/ischemia is one of the major causes of intrauterine/fetal growth restriction, preterm birth, and low birth weight. Most studies ...

Novel Passive Clearing Methods for the Rapid Production of Optical Transparency in Whole CNS Tissue

Роман пассивной очистки методы для быстрого производства оптической прозрачности в целом тканях ЦНС

Since the development of CLARITY, a bioelectrochemical clearing technique that allows for three-dimensional phenotype mapping within transparent tissues, ...

Isolation of Cerebral Capillaries from Fresh Human Brain Tissue

Изоляция мозгового капилляров из ткани свежий человеческого мозга

Understanding blood-brain barrier function under physiological and pathophysiological conditions is critical for the development of new therapeutic ...