Name: a hydrophobic tissue clearing method for rat brain tissue
Uploaded: 2020-12-23T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Hydrophobic Tissue Clearing Method for Rat Brain Tissue at JoVE.com

Detta arbete finansierades av NIH-bidrag: NS100624, DA013137, HD043680, MH106392 & av T32 Training Grant 5T32GM081740

Alla djurprotokoll granskades och godkändes av Animal Care and Use Committee vid University of South Carolina.
1. Beredning av stamlösning
<ol><li>Lösning 1 (1 L): Till 900 ml avjoniserad H2O tillsätt 100 ml 10x fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och 2 ml Triton X-100.</li>
	<li>Lösning 2 (1 L): Till 900 ml avjoniserad H2O, tillsätt 100 ml 10x PBS, 2mL Tween-20 och 1 ml 10 mg/mL Heparin stamlösning.</li>
	<li>Lösning 3 (500 ml): Tillsätt 11,5 g glycin och 100 ml ...

<ol>
	<li>Chung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+molecular+interrogation+of+intact+biological+systems.">Structural and molecular interrogation of intact biological systems.</a> Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).</li><li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-brain+imaging+with+single-cell+resolution+using+chemical+cocktails+and+computational+analysis.">Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis.</a> Cell. 157 (3), 726-739 (2014).</li><li>Ueda, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+clearing+and+its+applications+in+neuroscience.">Tissue clearing and its applications in neuroscience.</a> Nature Reviews Neuroscienc. 21, 298 (2020).</li><li>Renier, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iDISCO:+a+simple,+rapid+method+to+immunolabel+large+tissue+samples+for+volume+imaging.">iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging.</a> Cell. 159 (4), 896-910 (2014).</li><li>Renier, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+of+brain+activity+by+automated+volume+analysis+of+immediate+early+genes.">Mapping of brain activity by automated volume analysis of immediate early genes.</a> Cell. 165 (7), 1789-1802 (2016).</li><li>Reid, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+HIV-1+transgenic+rat+that+develops+HIV-related+pathology+and+immunologic+dysfunction.">An HIV-1 transgenic rat that develops HIV-related pathology and immunologic dysfunction.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 98, 9271-9276 (2001).</li><li>Vigorito, M., Connaghan, K. P., Chang, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+HIV-1+transgenic+rat+model+of+neuroHIV.">The HIV-1 transgenic rat model of neuroHIV.</a> Brain, Behavior, and Immunity. 48, 336-349 (2015).</li><li>McLaurin, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+connectivity+in+medium+spiny+neurons+of+the+nucleus+accumbens:+A+sex-dependent+mechanism+underlying+apathy+in+the+HIV-1+transgenic+rat.">Synaptic connectivity in medium spiny neurons of the nucleus accumbens: A sex-dependent mechanism underlying apathy in the HIV-1 transgenic rat.</a> Frontiers in Behavior Neurosciences. 12, 285 (2018).</li><li>Fitting, S., Booze, R. M., Mactutus, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+proteins,+Tat+and+gp120,+target+the+developing+dopamine+system.">HIV-1 proteins, Tat and gp120, target the developing dopamine system.</a> Current HIV Research. 13, 135-137 (2015).</li><li>Javadi-Paydar, M., Roscoe, R. F., Denton, A. R., Mactutus, C. F., Booze, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+and+cocaine+disrupt+dopamine+reuptake+and+medium+spiny+neurons+in+female+rat+striatum.">HIV-1 and cocaine disrupt dopamine reuptake and medium spiny neurons in female rat striatum.</a> PLos One. 12 (11), 0188404 (2017).</li><li>Bertrand, S. J., Mactutus, C. F., Harrod, S. B., Moran, L. M., Booze, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+proteins+dysregulate+motivational+processes+and+dopamine+circuitry.">HIV-1 proteins dysregulate motivational processes and dopamine circuitry.</a> Science Report. 8, 6152 (2018).</li><li>Denton, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+monoaminergic+and+histaminergic+circuit+dysregulation+following+long-term+HIV-1+protein+exposure.">Selective monoaminergic and histaminergic circuit dysregulation following long-term HIV-1 protein exposure.</a> Journal of neurovirology. 25 (4), 540-550 (2019).</li><li>Berendse, H. W., Groenewegen, H. J., Lohman, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartmental+distribution+of+ventral+striatal+neurons+projecting+to+the+mesencephalon+in+the+rat.">Compartmental distribution of ventral striatal neurons projecting to the mesencephalon in the rat.</a> Journal of Neuroscienc. 12 (6), 2079-2103 (1992).</li><li>Peyron, C., Petit, J. M., Rampon, C., Jouvet, M., Luppi, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forebrain+afferents+to+the+rat+dorsal+raphe+nucleus+demonstrated+by+retrograde+and+anterograde+tracing+methods.">Forebrain afferents to the rat dorsal raphe nucleus demonstrated by retrograde and anterograde tracing methods.</a> Neuroscience. 82 (2), 443-468 (1998).</li><li>Barrot, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Braking+dopamine+systems:+a+new+GABA+master+structure+for+mesolimbic+and+nigrostriatal+functions.">Braking dopamine systems: a new GABA master structure for mesolimbic and nigrostriatal functions.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscienc. 32 (41), 14094-14101 (2012).</li><li>Roostalu, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+whole-brain+3D+imaging+of+tyrosine+hydroxylase-labeled+neuron+architecture+in+the+mouse+MPTP+model+of+Parkinson's+disease.">Quantitative whole-brain 3D imaging of tyrosine hydroxylase-labeled neuron architecture in the mouse MPTP model of Parkinson's disease.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 12 (11), (2019).</li><li>Ransohoff, R., Cardona, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+myeloid+cells+of+the+central+nervous+system+parenchyma.">The myeloid cells of the central nervous system parenchyma.</a> Nature. 468, 253-262 (2010).</li><li>Rocha, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+Clearing+and+Light+Sheet+Microscopy:+Imaging+the+Unsectioned+Adult+Zebra+Finch+Brain+at+Cellular+Resolution.">Tissue Clearing and Light Sheet Microscopy: Imaging the Unsectioned Adult Zebra Finch Brain at Cellular Resolution.</a> Frontiers in Neuroanatomy. 13, 13 (2019).</li><li>Richardson, D. S., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clarifying+tissue+clearing.">Clarifying tissue clearing.</a> Cell. 162 (2), 246-257 (2015).</li></ol>

Vävnadsrensning erbjuder en lösning på begränsningarna i det traditionella IHC-protokollet. Ett prov som är transparent minimerar spridning och absorption av ljus, vilket ger optisk åtkomst på cellnivå tillintakta vävnader 18,19. Vävnadsrensningstekniker gör en vävnad transparent genom delipidation, avfärgning och avkalkning med administrering av lösningsmedel. När brytningsindexet för vävnadsprovet matchar det valda bildmediets brytningsindex, k...

Flera vävnadsrensningstekniker har validerats för användning i hjärnan: hydrogel, hydrofil och hydrofobisk. Dessa tekniker syftar till att vända en vävnad transparent genom delipidation, avfärgning och avkalkning via administrering av lösningsmedel. När brytningsindexet för vävnadsprovet matchar det valda bildmediets brytningsindex kan en tydlig bild av provet erhållas. Hydrogelbaserade tekniker, såsom CLARITY, säkrar biomolekyler i vävnaden genom att koppla dem till akrylbaserade hydrogeler, vilket förhindrar strukturella skador och förlust av proteiner1. Hydrogeltekniker använder dock hårda kemikalier än vad som kan skada mer ömtåliga vävnader, och tätare vävnadsprover kanske inte är kompatibla med hydrogelprotokollet. Vissa hydrogeltekniker kan kräva dyr utrustning eller leda till vävnadsexpansion. Hydrofila tekniker, som CUBIC, bevarar 3D-struktur genom bildandet av vätebindningar ivävnaden 2. Vävnad expansion kan också uppstå i vissa hydrofila protokoll. Clearingförmågan hos hydrofila tekniker matchar ofta inte den förmåga som hydrofobiska tekniker har, vilket är viktigt för tätare och tjockarevävnader 3.
Hydrofobiska tekniker är vanligtvis snabba, kräver inte speciell utrustning och producerar ett prov som är lätt att hantera och lagra. iDISCO är en hydrofobisk teknik som eliminerar krympningen som kan uppstå i andra hydrofobiska protokoll. Ursprungligen beskrevs iDISCO vävnad clearing teknik av Renier et al.4 för embryon och täta, vuxna organ av möss. Denna teknik tar bort vatten från vävnaden i det första uttorkningssteget, vilket minskar ljusspridningen. Vävnaden genomsyras under förbehandlingen för att möjliggöra djup antikroppspenetration. Alexa Fluorfärgämnen i det långröda spektrumet används för immunolabeling för att undvika autofluorescens av vävnaden vid lägrevåglängder 5. Vävnad som har genomgått hydrofobiska clearingprotokoll kan hanteras enkelt och kan avbildas flera gånger på grund av livslängden hos Alexa Fluor-färgämnena. Om vävnaderna lagras korrekt kan de ge bilder i månader till ett år efter den första bearbetningen.
I detta protokoll användes tyrosinhydroxilas (TH) antikroppar, Iba1 antikroppar och Kolera Toxin Subunit B (CTB) på både manliga och kvinnliga kontroll och HIV-1 transgena (Tg) råtta hjärnor. HIV-1 Tg-råttan har sju av de nio gener som utgör hiv-1-virusgenomet, vilket leder till en icke-infektiös modell av långvarig HIV-1 proteinexponering6,7,8. Dopaminerga förändringar har tidigare visats hos HIV-1 Tg-råttan, och HIV-1 i sig är en inflammatorisk sjukdom, så antikroppsvalet var relevant för den experimentella designen9,10,11,12. CTB är en spårämne som fäster vid nervceller via gangliosidebindning och kan användas för att spåra afferenta projektioner i hjärnan. CTB har tidigare använts för att studera projektioner från kärnan accumbens till substantia nigra området, två områden i hjärnan starkt involverade i dopaminerga vägar13,14,15.
I detta protokoll kommer TH att fungera som en markör för dopaminproduktion, och Iba1 kommer att markera aktiverad mikroglia. TH-antikroppen som används märker selektivt ett enda band på cirka 62 kDa som motsvarar tyrosinhydroxilas. Iba1-antikroppen motsvarar Iba1-karboxeterminalsekvensen. Båda antikropparna höjdes i kanin och var polyklonala. CTB kommer att användas för bakåtsträvande spårning av nervceller från nucleus accumbens-området till substantia nigra-området. Det nuvarande protokollet erbjuder också en riktlinje för justering av det ursprungliga iDISCO-protokollet på två olika sätt: 1) övergripande minskning av bakgrundsfärgningen genom att ändra serumreagenserna i blockeringsstegen och 2) skalning av inkubationstiden för att vara lämplig för större vävnadsprover. Sammantaget ger detta protokoll fortsatta bevis för att hydrofobiska clearingtekniker är genomförbara i hjärnans vävnader hos råttan, har inga märkbara skadliga interaktioner med HIV-1-virusproteiner och är kompatibla med TH-antikroppar, Iba1-antikroppar och CTB.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cholera Toxin Subunit B (Recombinant), Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C34775</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DBE</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>108014-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DCM</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>270997-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>472301-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>G46-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit Alexa Fluor Plus 647</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A32733</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>G9023-10mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>41121-0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iba1 primary antibody</td>
			<td>FUJIFILM Wako</td>
			<td>019-19741</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kwik-sil epoxy</td>
			<td>VWR</td>
			<td>70730-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34860-1l-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP2944-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion machine</td>
			<td>VWR</td>
			<td>70730-062</td>
			<td>mini pump variable flow</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PFA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>158127-3KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TH primary antibody</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>AB152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TritonX-100</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP151-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP337-500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a hydrophobic tissue clearing method for rat brain tissue

Hydrofobiska vävnadsrensningsmetoder är lätt justerbara, snabba och billiga förfaranden som möjliggör studier av en molekyl av intresse för oförändrade vävnadsprover. Traditionella immunolabeling förfaranden kräver att provet skärs i tunna sektioner, vilket begränsar förmågan att märka och undersöka intakta strukturer. Men om hjärnvävnad kan förbli intakt under bearbetningen kan strukturer och kretsar förbli intakta för analysen. Tidigare etablerade clearingmetoder tar betydande tid att rensa vävnaden helt, och de hårda kemikalierna kan ofta skada känsliga antikroppar. IDISCO-metoden rensar snabbt och helt vävnad, är kompatibel med många antikroppar och kräver ingen speciell labbutrustning. Denna teknik validerades ursprungligen för användning i möss vävnad, men det nuvarande protokollet anpassar denna metod till bild halvklot av kontroll och transgena råtta hjärnor. Utöver detta gör det nuvarande protokollet också flera justeringar av befintliga protokoll för att ge tydligare bilder med mindre bakgrundsfärgning. Antikroppar för Iba-1 och tyrosinhydroxilas validerades hos den transgena hiv-1-råttan och hos F344/N-kontrollråttor med den nuvarande hydrofobiska vävnadsrensningsmetoden. Hjärnan är ett sammanvävt nätverk, där strukturer arbetar tillsammans oftare än separat av varandra. Att analysera hjärnan som helhetssystem i motsats till en kombination av enskilda bitar är den största fördelen med hela denna hjärnrensningsmetod.

Fullständig clearing av stora delar av både F344/N och HIV-1 råtta hjärnvävnad uppnåddes med hjälp av detta modifierade hydrofobiska vävnad clearing protokoll. Figur 1 visar en typisk konfokal bild för TH i regionen substantia nigra. Figur 1A representerar tät, positiv färgning. Täta områden som dessa kan tolkas genom att fokusera genom "Z" -planet för att bekräfta positiv färgning och korrekt cellmorfologi. Figur 1B...

Watch this Scientific Journal Video about A Hydrophobic Tissue Clearing Method for Rat Brain Tissue at JoVE.com

A Hydrophobic Tissue Clearing Method for Rat Brain Tissue

Här presenterar vi en hydrofobisk vävnadsrensningsmetod som möjliggör visning av målmolekyler som en del av intakta hjärnstrukturer. Denna teknik har nu validerats för F344/N kontroll och HIV-1 transgena råttor av båda könen.

En hydrofobisk vävnadsrensningsmetod för råtta hjärnvävnad

Hydrophobic tissue clearing methods are easily adjustable, fast, and low-cost procedures that allows for the study of a molecule of interest in unaltered ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Preparation of Mouse Brain Tissue for Immunoelectron Microscopy

Beredning av Mouse hjärnvävnad för Immunoelectron mikroskopi

Transmission electron microscopy (TEM) is extremely useful for visualizing microglial, oligodendrocytic, astrocytic, and neuronal subcellular compartments ...

Intact Histological Characterization of Brain-implanted Microdevices and Surrounding Tissue

Intakt Histologisk karakterisering av Brain-implanterade Microdevices och omgivande vävnad

Research  into the design and utilization of brain-implanted microdevices, such as  microelectrode arrays, aims to produce clinically relevant devices ...

Immunohistochemical Analysis in the Rat Central Nervous System and Peripheral Lymph Node Tissue Sections

Immunohistokemisk analys i Rat centrala nervsystemet och perifera lymfkörtelvävnadssnitt

Immunohistochemistry (IHC) provides highly specific, reliable and attractive protein visualization. Correct performance and interpretation of an IHC-based ...

Primer for Immunohistochemistry on Cryosectioned Rat Brain Tissue: Example Staining for Microglia and Neurons

Primer för Immunohistokemi på Cryosectioned råtthjärna Vävnad: Exempel färgning för Mikroglia och Neurons

Immunohistochemistry is a widely used technique for detecting the presence, location, and relative abundance of antigens in situ. This introductory level ...

Using Fluorescence Activated Cell Sorting to Examine Cell-Type-Specific Gene Expression in Rat Brain Tissue

Använda Fluorescensaktiverad cellsortering för att Undersök Cell-Type-Specific Gene Expression i råtthjärnvävnad

The brain is comprised of four primary cell types including neurons, astrocytes, microglia and oligodendrocytes. Though they are not the most abundant ...

Sublimation of DAN Matrix for the Detection and Visualization of Gangliosides in Rat Brain Tissue for MALDI Imaging Mass Spectrometry

Sublimering av DAN Matrix för detektion och visualisering av gangliosider i råtthjärnvävnad för MALDI Imaging Mass Spectrometry

Sample preparation is key for optimal detection and visualization of analytes in Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization (MALDI) Imaging Mass ...

A Rat Model of Mild Intrauterine Hypoperfusion with Microcoil Stenosis

En råtta modell av Mild intrauterin Hypoperfusion med Microcoil stenos

Intrauterine hypoperfusion/ischemia is one of the major causes of intrauterine/fetal growth restriction, preterm birth, and low birth weight. Most studies ...

Novel Passive Clearing Methods for the Rapid Production of Optical Transparency in Whole CNS Tissue

Romanen passiv Clearing metoder för snabb produktion av optisk transparens i hela CNS-vävnaden

Since the development of CLARITY, a bioelectrochemical clearing technique that allows for three-dimensional phenotype mapping within transparent tissues, ...

Isolation of Cerebral Capillaries from Fresh Human Brain Tissue

Isolering av Cerebral kapillärerna från färska mänsklig hjärnvävnad

Understanding blood-brain barrier function under physiological and pathophysiological conditions is critical for the development of new therapeutic ...