Name: a multi-cue bioreactor to evaluate the inflammatory and regenerative capacity of biomaterials under flow and stretch
Uploaded: 2020-12-10T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Multi-Cue Bioreactor to Evaluate the Inflammatory and Regenerative Capacity of Biomaterials under Flow and Stretch at JoVE.com

يتم دعم هذه الدراسة ماليا من قبل ZonMw كجزء من برنامج LSH 2Treat (436001003) ومؤسسة الكلى الهولندية (14a2d507). ن. أ. ك. تعترف بدعم مجلس البحوث الأوروبي (851960). ونعرب عن امتناننا لبرنامج الجاذبية "تجديد المواد المدفوعة"، الذي تموله المنظمة الهولندية للبحث العلمي (024.003.013).

في الدراسات الموصوفة في هذا البروتوكول، تم استخدام الضامة البشرية الأولية المعزولة عن معاطف برتقالي الدم المحيطي والخلايا الميوفيبروبلاست البشرية المعزولة عن الوريد الشافيني بعد جراحة المرور الشرياني التاجي44. تم الحصول على المعاطف بافي من صحية، والمتطوعين مجهولي الهوية ا...

يسمح المفاعل الحيوي الموصوف هنا بإجراء تقييم منهجي لمساهمات التأثيرات الفردية والمجمعة لإجهاد القص والتمدد الدوري على الالتهاب وتجديد الأنسجة في السقالات القابلة للتكثير الأنبوبي. ويتيح هذا النهج أيضا إجراء مجموعة كبيرة ومتنوعة من التحليلات على البنى الوعائية، كما يتضح من قسم النتائج ...

هندسة أنسجة القلب والأوعية الدموية (TE) ويجري السعي كخيار علاج بديل لأطراف القلب والأوعية الدموية المستخدمة حاليا دائمة (على سبيل المثال، ترقيع الأوعية الدموية، واستبدال صمام القلب)، والتي هي دون المستوى الأمثل لأفواج كبيرة من المرضى1،2،3،4. وتشمل التطبيقات المطلوبة كثيرا بعد ترقيع الأوعية الدموية المهندسة الأنسجة (TEVGs)5و6 وصمامات القلب (TEHVs)7،8. في معظم الأحيان، تستخدم منهجيات TE القلبية الوعائية المواد الحيوية القابلة لإعادة التكثير (سواء كانت طبيعية أو اصطناعية) التي تعمل سقالة مفيدة للأنسجة الجديدة التي سيتم تشكيلها. تشكيل نسيج جديد يمكن إما أن تكون هندسية تماما في المختبر، عن طريق بذر السقالة مع الخلايا وزراعة في مفاعل حيوي قبل زرع (في المختبر TE)9،10،11، أو مباشرة في الموقع، والتي يتم زرع السقالة الاصطناعية دون زرع قبل من أجل الحث على تشكيل أنسجة جديدة مباشرة في الجسم (في الموقع TE)12،13،14. لكل من المختبر وفي الموقع نهج TE القلب والأوعية الدموية، وتجديد وظيفي ناجح يعتمد بشكل مهيمن على كل من الاستجابة المناعية المضيف لبناء مزروع وتحميل الميكانيكا الحيوية المناسبة.
أهمية التحميل الميكانيكي الحيوي لTE القلب والأوعية الدموية هو معترف به جيدا15. في حالة زراعة القلب والأوعية الدموية ، تتعرض الخلايا التي تملأ السقالة لإجهادات التمدد الدوري والقص التي تنشأ نتيجة للبيئة الدموية. وقد ذكرت العديد من الدراسات تأثير تحفيزي من (دوري) تمتد على تشكيل مكونات مصفوفة, مثل الكولاجين16,17,18,19, الجليكوسامينوجليكان (GAGs)20, والإيلاستين21,22, من قبل أنواع مختلفة من الخلايا. على سبيل المثال، أثبت هوانغ وآخرون أن امتداد ثنائي ساكسيال رفع ترسب وتنظيم الكولاجين والإيلاستين في المختبر TEVGs باستخدام مفاعل حيوي الأوعية الدموية23. في حين أن التركيز يكمن عادة على التمدد كحمل مهيمن ، فإن هذه الدراسات غالبا ما تستخدم المفاعلات الحيوية التي تحركها التدفق والتي تتعرض فيها العينة أيضا لتدفق القص. على الرغم من أنه لا يعرف سوى القليل نسبيا عن التأثير المعزول لضغوط القص على تكوين الأنسجة والالتهاب في 3D ، إلا أن بعض البيانات متوفرة. على سبيل المثال، أظهر Hinderer et al. و Eoh وآخرون أن تدفق القص، بالإضافة إلى البنية الدقيقة للسقالة ثلاثية الأبعاد، كان مهما لتشكيل الإيلاستين الناضج بواسطة خلايا العضلات الملساء الوعائية البشرية في نظام نموذج المختبر24،25. وإجمالا، توضح هذه النتائج أهمية كل من التمدد الدوري والإجهاد القصي ل TE القلبي الوعائي.
محدد مهم آخر لنجاح أو فشل يزرع TE هو استجابة المضيف المناعية للكسب غير المشروع المزروعة26. وهذا مهم بشكل خاص لاستراتيجيات TE التي تحركها المواد في الموقع ، والتي تعتمد في الواقع على الاستجابة الالتهابية الحادة للسقالة لبدء العمليات اللاحقة لتدفق الخلايا وتشكيل الأنسجة الذاتية وإعادة عرض27. الماكروفاج هو البادئ الحاسم لتجديد الأنسجة الوظيفية، والتي أظهرتها دراسات متعددة28،29،30. مماثلة لتضميد الجروح، ويحكم تجديد الأنسجة من قبل إشارات الباراكورين بين الضامة والخلايا المنتجة للأنسجة مثل الخلايا الليفية والخلايا العضليةالليفية 31،32،33. بالإضافة إلى تنسيق ترسب الأنسجة الجديدة ، وتشارك الضامة في ارتشاف نشط من المواد سقالة الأجنبية34،35. على هذا النحو ، تم تحديد استجابة الضامة في المختبر للمواد الحيوية كمعلمة تنبؤية لنجاح الجسم الحي للغرسات36و37و38.
تعتمد استجابة الضامة على السقالة المزروعة على ميزات تصميم السقالات مثل تكوين المواد والبنية المجهرية35و39و40. بالإضافة إلى خصائص السقالة ، تتأثر استجابة الضامة إلى سقالة ومكائدها المتقاطعة مع الخلايا الميوفيبروبلاست أيضا بالأحمال الديناميكية الدموية. على سبيل المثال، تبين أن امتداد دوري هو المغير المهم للنمط الظاهري الضام41،42،43،44 وإفراز السيتوكينات43،44،45،46 في سقالات كهربائية ثلاثية الأبعاد. باستخدام نظام الثقافة المشتركة من الضامة وخلايا العضلات الملساء الوعائية، أظهر باتيستون وآخرون أن وجود الضامة أدى إلى زيادة مستويات الإيلاستين وGAGs وأن المستويات المعتدلة من الامتداد الدوري (1.07-1.10) حفزت ترسب الكولاجين I والإيلاستين47. في الأعمال السابقة، لقد أثبتنا أن الإجهاد القص هو محدد مهم للتجنيد monocyte في سقالات electrospun 3D48،49،وأن كلا من الإجهاد القص وتمتد دوري تؤثر على الإشارات الباراترين بين الخلايا الأحادية البشرية والخلايا النجمية mesenchymal50. أظهر فاهي وآخرون أن تدفق القص زاد من إفراز السيتوكينات المؤيدة للالتهابات بواسطة الخلايا الأحادية البشرية51.
إذا أخذنا معا، فإن الأدلة المذكورة أعلاه تظهر أن الفهم الكافي للأحمال الديناميكية الدموية والتحكم فيها أمر بالغ الأهمية ل TE القلب والأوعية الدموية، وأنه من المهم النظر في الاستجابة الالتهابية لتحقيق ذلك. وقد وصفت العديد من المفاعلات الحيوية سابقا للمزود في المختبر52،53،54،55،56،57،58 أو ex vivo59،60،61 ثقافة أنسجة القلب والأوعية الدموية. ومع ذلك، تم تصميم جميع هذه الأنظمة لمحاكاة ظروف التحميل الهيمودية الفسيولوجية قدر الإمكان. في حين أن هذا هو قيمة للغاية لغرض خلق أنسجة القلب والأوعية الدموية في المختبر أو الحفاظ على الثقافات الجسم الحي السابق، مثل هذه النظم لا تسمح لدراسات منهجية في الآثار الفردية للإشارات الفردية. وذلك لأن تطبيق كل من التمدد الدوري والإجهاد القص في هذه المفاعلات الحيوية مدفوعة بنفس التدفق المضغوط ، الذي يربط بينهما في جوهره. في حين تم وصف النظم الدقيقة التي تسمح للتلاعب الميكانيكية متعددة جديلة دقيقة لركائز 2D62 أو 3D هيدروجيل الاجهزة63،64، مثل هذه الاجهزة لا تسمح لدمج السقالات 3D elastomeric المواد الحيوية.
هنا، نقدم تطبيق نظام المفاعل الحيوي أنبوبي التي تمكن بشكل فريد من فصل الإجهاد القص وتمتد دوري ويساعد على التحقيق ميكانيكيا آثارها الفردية والمجمعة. يسمح هذا النظام باختبار مجموعة واسعة من ترقيع الأوعية الدموية المهندسة للأنسجة (على سبيل المثال ، المنشأ الاصطناعي أو الطبيعي ، والهندسة المعمارية الدقيقة المختلفة ، والمساميات المختلفة). لفصل فعال تطبيق الإجهاد القص وتمتد، والمفاهيم الرئيسية التي يستخدمها المفاعل الحيوي هي (1) فصل السيطرة على الإجهاد القص وتمتد باستخدام أنظمة مضخة متميزة و (2) تحفيز السقالات بطريقة "من الداخل إلى الخارج" مع أبعاد مدفوعة حسابيا. يتم تطبيق التدفق على السطح الخارجي للسقالة الأنبوبية من خلال استخدام مضخة تدفق ، في حين يتم حث الامتداد المحيطي للسقالة عن طريق توسيع أنبوب السيليكون الذي يتم تركيب السقالة عليه من خلال استخدام مضخة إجهاد منفصلة. يتم اختيار أبعاد أنبوب السيليكون وأنبوب الزجاج الذي يحتوي على البناء بعناية والتحقق من صحتها باستخدام محاكاة ديناميات السوائل الحسابية ، لضمان أن إجهاد القص على السقالة (بسبب التدفق) والتمدد المحيطي (بسبب توسع الأنبوب) لا يؤثران بشكل كبير على بعضهما البعض. هذا التصميم من الداخل إلى الخارج له عدة مبررات عملية. إذا تم تطبيق التمدد بواسطة ضغط السائل الإنارة (على غرار التحميل الفسيولوجي) ، فإنه يتطلب بطبيعته تصميم العينة لتكون خالية من التسرب. بالإضافة إلى ذلك ، فإن الضغط المطلوب لتمديد العينة سيتم تحديده بالكامل من خلال صلابة العينة ، والتي قد تختلف بين العينات وداخل عينة مع مرور الوقت ، مما يجعل من الصعب التحكم في الامتداد. هذا المفاعل الحيوي يتصاعد الكسب غير المشروع الأنسجة المهندسة حول أنبوب السيليكون ويسمح لتطبيق الإجهاد القص الجدار (WSS) على الجدار الخارجي للكسب غير المشروع ويضغط على الكسب غير المشروع من الداخل. وبهذه الطريقة ، يمكن ضمان ظروف تحميل متساوية بين العينات وداخل العينات مع مرور الوقت ، وعلاوة على ذلك ، يسمح للعينات بأن تكون متسربة ، كما هو شائع للسقالات الوعائية المسامية19. يهدف هذا المفاعل الحيوي من الداخل إلى الخارج على وجه التحديد لإجراء دراسات منهجية حول آثار القص و / أو التمدد ، بدلا من هندسة وعاء دموي يشبه الأم في المختبر ، والذي تكون أجهزة المفاعل الحيوي الوعائية التقليدية أكثر ملاءمة له. انظر الشكل 1ألف - باء للاطلاع على رسومات تصميم المفاعل الحيوي، والجدول 1 المقابل له للحصول على وصف وظيفي ومنطقي وراء المكونات الرئيسية للمضبر الحيوي.
ويتجلى استخدام المفاعل الحيوي على أساس سلسلة من الدراسات الحديثة من قبل مجموعتنا التي قمنا بالتحقيق في التأثيرات الفردية والمجمعة من إجهاد القص وتمتد دوري على الالتهاب وتشكيل الأنسجة في سقالات electrospun قابلة لإعادة التكهرب في الموقع أنسجة القلب والأوعية الدموية19،43،44. وتحقيقا لتلك الإنسان الضامة والخلايا الميوفيبرومية إما في أحادية أو في ثقافة مشتركة لمحاكاة مختلف مراحل سلسلة التجدد في الموقع. لقد أثبتنا أن إفراز السيتوكين بواسطة الضامة البشرية يتأثر بشكل واضح بكل من التمدد الدوري والإجهاد القصي ، مما يؤثر على ترسب المصفوفة وتنظيمها من قبل الخلايا العضلية البشرية في هذه السقالات ، سواء عن طريق إشارات الباراكورين والاتصال المباشر19،43،44. وتجدر الإشارة إلى أن هذه الدراسات كشفت أنه في حالة التطبيق المشترك للإجهاد القص وتمتد، والآثار على تشكيل الأنسجة والتهاب إما تهيمن عليها واحدة من اثنين من الأحمال، أو هناك آثار التآزر من كلا الأحمال. توضح هذه النتائج أهمية فصل كلا الحمولتين للحصول على فهم أفضل لمساهمة البيئة الميكانيكية في عمليات TE. ويمكن تطبيق هذا الفهم لتحسين منهجي المعلمات تصميم سقالة في أنظمة التحميل الحيوية ذات الصلة. وبالإضافة إلى ذلك، فإن البيانات الآلية المستمدة من هذه البيئات التي تسيطر عليها سيطرة جيدة قد تكون بمثابة مدخلات للنماذج العددية التي يجري تطويرها للتنبؤ بمسار إعادة عرض الأنسجة في الموقع، كما ورد مؤخرا بالنسبة ل TEVGs65 أو TEHVs66،لزيادة تحسين القدرة التنبؤية.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >advanced Dulbecco&#8217;s modified EagleMedium (aDMEM)</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >12491-015</td>
			<td >cell culture medium for fibroblasts</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Aqua Stabil</td>
			<td >Julabo</td>
			<td >8940012</td>
			<td >prevent microorganism growth in bioreactor-hydraulic reservoir</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Bovine fibrinogen</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >F8630</td>
			<td >to prepare fibrinogen gel to seed the cells on the electrospun scaffold</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Bovine thrombin</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >T4648</td>
			<td >to prepare fibrinogen gel to seed the cells on the electrospun scaffold</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Centrifuge</td>
			<td >Eppendorf</td>
			<td >5804</td>
			<td >to spin down cells and conditioned medium</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Clamp scissor - &#34;kelly forceps&#34;</td>
			<td >Almedic</td>
			<td >P-422</td>
			<td >clamp the silicone tubing and apply pre-stretch to the scaffold so the scaffold can be sutured into the engraved groove (autoclave at step 1, step 7)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CO2 cell culture incubators</td>
			<td >Sanyo</td>
			<td >MCO-170AIC-PE</td>
			<td >for cell culturing</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Compressed air reservoir</td>
			<td >Festo</td>
			<td >CRVZS-5</td>
			<td >smoothing air pressure fluctuations and create time delays for pressure build-up</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Custom Matlab script to calculate the maximum stretches</td>
			<td >Matlab</td>
			<td >R2017. The Mathworks, Natick, MA</td>
			<td >calculate the minimum and maximum outer diameter of the electrospun scaffold</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Data acquisition board</td>
			<td >National Instruments</td>
			<td >BNC-2090</td>
			<td >data processing in between amplifier system and computer</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ethanol</td>
			<td >VWR</td>
			<td >VWRK4096-9005</td>
			<td >to keep sterile working conditions</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fetal bovine calf serum (FBS)</td>
			<td >Greiner</td>
			<td >758087</td>
			<td >cell culture medium supplement; serum-supplement</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Flow culture chamber compartments, consisting of a pressure conduit with engraved grooves and small holes to apply pressure on silicone tubing, a screw thread, nose cone, top compartment with flow inlet and bottom compartment flow outlet, adapter bushing</td>
			<td >Custom made, Department of Biomedical Engineering, Eindhoven University of Technology</td>
			<td >n.a.</td>
			<td >flow culture chamber compartments (autoclave at step 1, step 7)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Glass Pasteur pipet</td>
			<td >Assistant</td>
			<td >HE40567002</td>
			<td >apply vacuum on electrospun scaffold (autoclave at step 1)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Glass tubes of the flow culture chamber</td>
			<td >Custon made, Equipment &#38; Prototype Center, Eindhoven University of Technology</td>
			<td >n.a.</td>
			<td >part of the flow culture chamber (clean and store in 70% ethanol, at step 1 and 7)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >GlutaMax</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >35050061</td>
			<td >cell culture medium amino acid supplement, minimizes ammonia build-up</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >High speed camera</td>
			<td >MotionScope</td>
			<td >M-5</td>
			<td >to monitor the stretch during culture; time-lapse photographs of the scaffolds are captured at a frequency of 30 Hz for 6 sec (i.e. 3 stretch cycles)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >High speed camera lens - Micro-NIKKOR 55mm f/2.8 - lens</td>
			<td >Nikon</td>
			<td >JAA616AB</td>
			<td >to monitor the stretch during culture; time-lapse photographs of the scaffolds are captured at a frequency of 30 Hz for 6 sec (i.e. 3 stretch cycles)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hose clip</td>
			<td >ibidi GmbH</td>
			<td >10821</td>
			<td >block medium flow (autoclave at step 1, step 7)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hydraulic reservoir with 8 screw threads for 8 flow culture chambers</td>
			<td >Custom made, Department of Biomedical Engineering, Eindhoven University of Technology</td>
			<td >n.a.</td>
			<td >to apply pressure to the silicone mounted constructs (clean outside with a paper tissue with 70% ethanol, rinse reservoir with 70% ethanol followed by demi water, at step 1 and 7)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ibidi pump system (8x) including ibidi pump, PumpControl software, fluidic unit, perfusion set (medium tubing), air pressure tubing, drying bottles with orange silica beads</td>
			<td >ibidi GmbH</td>
			<td >10902</td>
			<td >set up used to control the flow in the flow culture chambers. Note 1: the ibidi pumps were modified by the manufacturer to enable 200 mbar capacity. Note 2: can be replaced by pump system of other manufacturer, as long as same flow regimes can be applied.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Knives (no.10 sterile blades, individual foil pack) and scalpel handle (stainless steel, individually wrapped)</td>
			<td >Swann Morton</td>
			<td >0301; 0933</td>
			<td >to cut the silicone tubing in the correct size for the scaffold and to cut the suture material</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >LabVIEW Software</td>
			<td >National Instruments</td>
			<td >version 2018</td>
			<td >to control the stretch applied to the scaffolds</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Laminar flow biosafety cabinet with UV light</td>
			<td >Labconco</td>
			<td >302310001</td>
			<td >to ensure sterile working conditions. The UV is used to decontaminate everything that cannot be autoclaved, or touched after autoclaving</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Large and small petri dishes</td>
			<td >Greiner</td>
			<td >664-160</td>
			<td >for sterile working conditions</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >L-ascorbic acid 2-phosphate (vitamin C)</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >A8960</td>
			<td >cell culture medium supplement, important for collagen production</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >LED light cold source KL2500</td>
			<td >Zeiss</td>
			<td >Schott AG</td>
			<td >to aid in visualization for the time lapse of the scaffolds during monitoring of the stretch</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Luer (female and male) locks and connectors, white luer caps</td>
			<td >ibidi GmbH</td>
			<td >various, see (https://ibidi.com/26-flow-accessories)</td>
			<td >to close or connect parts of the bioreactor and the ibidi pump (autoclave at step 1, step 7)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Measuring amplifier (PICAS)</td>
			<td >PEEKEL instruments B.V.</td>
			<td >n.a.</td>
			<td >to amplify the signal from the pressure sensor and feedback to LabView</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Medium reservoir (large syringes 60 mL) and reservoir holders</td>
			<td >ibidi GmbH</td>
			<td >10974</td>
			<td >medium reservoir (autoclave at step 1, step 7)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Medium tubing with 4.25 mm outer diameter and 1 mm inner diameter</td>
			<td >Rubber BV</td>
			<td >1805</td>
			<td >to allow for a larger flow rate, the ibidi medium tubing with larger diameter is used. Note: the part of medium tubing guided through the fluidic unit valves are the same as the default ibidi medium tubing</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Motion Studio Software</td>
			<td >Idtvision</td>
			<td >2.15.00</td>
			<td >to make the high speed time lapse images for stretch monitoring</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Needle (19G)</td>
			<td >BD Microlance</td>
			<td >301700</td>
			<td >together with thin flexible tubing used to fill the hydraulic reservoir with ultrapure water without adding air bubbles</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Needle driver</td>
			<td >Adson</td>
			<td >2429218</td>
			<td >to handle the needle of the nylon suture through the silicone tube (autoclave at step 1, step 7)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Paper tissues</td>
			<td >Kleenex</td>
			<td >38044001</td>
			<td >for cleaning of the equipment with 70% ethanol</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Parafilm</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >P7793-1EA</td>
			<td >quick fix if leakage occurs</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Penicillin/streptomycin (P/S)</td>
			<td >Lonza</td>
			<td >DE17-602E</td>
			<td >cell culture medium supplement; prevent bacterial contamination</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >P4417-100TAB</td>
			<td >for storage and washing steps (autoclave at step 1)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Plastic containers (60 mL) with red screw caps</td>
			<td >Greiner</td>
			<td >206202</td>
			<td >to prepare the fibrinogen solution</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pneumatic cylinder</td>
			<td >Festo</td>
			<td >AEVC-20-10-I-P</td>
			<td >to actuate the Teflon bellow (clean with a paper tissue with 70% ethanol at step 1 and 7)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Polycaprolactone bisurea (PCL-BU) tubular scaffolds (3 mm inner diameter, 200 &#181;m wall thickness, 20 mm length)</td>
			<td >SyMO-Chem, Eindhoven, The Netherlands</td>
			<td >n.a.</td>
			<td >produced using electrospinning from 15% (w/w) chloroform (Sigma; 372978) polymer solutions. See Van Haaften et al Tissue Engineering Part C (2018) for more details</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pressure conduit without holes (for static control)</td>
			<td >Custom made, Department of Biomedical Engineering, Eindhoven University of Technology</td>
			<td >n.a.</td>
			<td >to mount electrospun tubes on silicon tubing (autoclave at step 1, step 7)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pressure sensor and transducer</td>
			<td >BD</td>
			<td >TC-XX and P 10 EZ</td>
			<td >the air pressure going to the pneumatic actuated pump is raised until it reaches the set pressure</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Proportional air pressure control valve and pressure sensor</td>
			<td >Festo</td>
			<td >MPPES-3-1/8-2-010, 159596</td>
			<td >provides compressed air to the pneumatic actuated pump</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI-1640)</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >A1049101</td>
			<td >cell culture medium for monocyte/macrophage</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Safe lock Eppendorf tubes (1.5 mL)</td>
			<td >Eppendorf</td>
			<td >30120086</td>
			<td >multiple applications (autoclave at step 1)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sodium dodecyl sulfate solution 20%</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >5030</td>
			<td >Used to clean materials, at a concentration of 0.1%.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Silicone O-rings</td>
			<td >Technirub</td>
			<td >1250S</td>
			<td >to prevent leakage (autoclave at step 1, step 7)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Silicone tubing (2.8 mm outer diameter, 400 um wall thickness)</td>
			<td >Rubber BV</td>
			<td >1805</td>
			<td >to mount the electrospun tubes on the pressure conduits (autoclave at step 1)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sterile tube (15 mL)</td>
			<td >Falcon</td>
			<td >352095</td>
			<td >multiple applications</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Suture, 5-0 prolene with pre-attached taper point needle</td>
			<td >Ethicon, Johnson&#38;Johnson</td>
			<td >EH7404H</td>
			<td >Prolene suture wire 5-0 (75cm length, TF taper point needle, 1/2 circle, 13 mm needle length)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Syringe (24 mL)</td>
			<td >B. Braun Melsungen AG</td>
			<td >2057932</td>
			<td >to add the ultrapure water or medium to the hydraulic reservoir or flow culture chamber</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Syringe filter (0.2 &#181;m)</td>
			<td >Satorius</td>
			<td >17597-K</td>
			<td >to filter the fibrinogen solution</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >T150 cell culture flask with filter cap</td>
			<td >Nunc</td>
			<td >178983</td>
			<td >to degas culture medium</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >T75 Cell culture flask with filter cap</td>
			<td >Nunc</td>
			<td >156499</td>
			<td >to culture static control samples</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Teflon bellow</td>
			<td >Custom made, Department of Biomedical Engineering, Eindhoven University of Technology</td>
			<td >n.a.</td>
			<td >to load the hydraulic reservoir (clean outside with a paper tissue with 70% ethanol at step 1 and 7)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tray (stainless steel)</td>
			<td >PolarWare</td>
			<td >15-248</td>
			<td >for easy transport of the fluidic culture chambers and the bioreactor from incubator to laminar flow cabinet and back (clean with a paper tissue with 70% ethanol before and after use)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tweezers</td>
			<td >Wironit</td>
			<td >4910</td>
			<td >sterile handling of individual parts (autoclave at step 1 and 7)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ultrapure water</td>
			<td >Stakpure</td>
			<td >Omniapure UV 18200002</td>
			<td >to correct for medium evaporation, mixed with aqua stabil mixed and used as hydraulic fluid. (autoclave ultrapure water at step 1)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >UV light</td>
			<td >Philips</td>
			<td >TUV 30W/G30 T8</td>
			<td >for decontamination of grafts and bioreactor parts before seeding</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a multi-cue bioreactor to evaluate the inflammatory and regenerative capacity of biomaterials under flow and stretch

استخدام المواد الحيوية القابلة للتك00 للحث على التجديد مباشرة في الجسم هو استراتيجية جذابة من منظور تحويلي. هذه المواد تحفز استجابة التهابية عند الزرع ، وهو المحرك لإعادة امتصاص المواد اللاحقة وتجديد الأنسجة الجديدة. هذه الاستراتيجية، والمعروفة أيضا باسم هندسة الأنسجة في الموقع، يتم اتباعها للحصول على بدائل القلب والأوعية الدموية مثل ترقيع الأوعية الدموية المهندسة الأنسجة. يتم تحديد كل من العمليات الالتهابية والتجددية من خلال الإشارات الميكانيكية الحيوية المحلية على السقالة (أي إجهاد التمدد والقص). هنا، ونحن نصف بالتفصيل استخدام مفاعل حيوي وضعت خصيصا التي تمكن بشكل فريد من فصل تمتد والقص الإجهاد على سقالة أنبوبي. وهذا يسمح للتقييم المنهجي والموحد للقدرة الالتهابية والتجديدية للسقالات الأنبوبية تحت تأثير الأحمال الميكانيكية التي يتم التحكم فيها بشكل جيد ، والتي نظهرها على أساس تجربة ديناميكية للثقافة المشتركة باستخدام الضامة البشرية والخلايا العضلية. وتناقش بالتفصيل الخطوات العملية الرئيسية في هذا النهج - بناء وإنشاء المفاعل الحيوي، وإعداد السقالات وبذر الخلايا، وتطبيق وصيانة تدفق التمدد والقص، وحصاد العينات للتحليل.

تم تطوير هذا المفاعل الحيوي لدراسة الآثار الفردية والمجمعة لإجهاد القص والتمدد الدوري على نمو الأنسجة الوعائية وإعادة عرضها في سقالات المواد الحيوية ثلاثية الأبعاد. تصميم المفاعل الحيوي يسمح لزراعة ما يصل إلى ثمانية بنيات الأوعية الدموية تحت ظروف التحميل المختلفة(الشكل 1A</stro...

Watch this Scientific Journal Video about A Multi-Cue Bioreactor to Evaluate the Inflammatory and Regenerative Capacity of Biomaterials under Flow and Stretch at JoVE.com

A Multi-Cue Bioreactor to Evaluate the Inflammatory and Regenerative Capacity of Biomaterials under Flow and Stretch

الهدف من هذا البروتوكول هو تنفيذ ثقافة مشتركة ديناميكية من الضامة البشرية و myofibroblasts في سقالات كهربائية أنبوبية للتحقيق في تجديد الأنسجة التي تحركها المواد ، وذلك باستخدام مفاعل حيوي يمكن من فصل إجهاد القص والتمدد الدوري.

مفاعل حيوي متعدد العظة لتقييم القدرة الالتهابية والتجديدية للمواد الحيوية تحت التدفق والتمدد

The use of resorbable biomaterials to induce regeneration directly in the body is an attractive strategy from a translational perspective. Such materials ...

So far, it has been really difficult to identify the cause and effect relationships between hemodynamics and vascular tissue regeneration. And this has because it's challenging to control the individual mechanical loads. This bioreactor enables us to mechanistically investigate the individual and combined effects of sheer stress and cyclic stretch on the regenerative potential of a broad variety of tissue engineered vascular grafts.Demonstrating this procedure will be Suzanne Koch, a PhD candidate in our group. And Dr.Tamar Wissing who is a postdoctoral researcher from our laboratory. To mount the electro spun scaffold onto the silicone tubing, thread a 4-0 prolene suture into one end of a piece of silicone tubing and out of the other.Make a small knot on both sides of the tube leaving approximately 10 centimeters of wire on both knots and make a third knot on top of the two. After removing a suture needle, trim the edges of the silicone tubing into a triangular shape and make a final knot at the end of the two 10 centimeter wires. Dip the electro spun scaffold in 30%ethanol and place the scaffold over one end of free suture wire.Next, gently stretch both sides of the silicone tubing and the 10 centimeter suture knot while second researcher uses tweezers with a smooth inner tip to gently slide the electro spun scaffold over the tubing. Slowly release the stretch on the silicone tubing while simultaneously smoothing the electro spun scaffold with the tweezers. And dip the scaffold and silicone tubing in ultra pure water two times.Construct the bottom compartment and make sure that the O-ring is properly placed. Place an adaptor bushing in the upper part of the bottom compartment and place the pressure conduit with holes through the bottom compartment. Lace the silicone O-ring around the lower end of the pressure conduit to prevent leakage.And screw the lower part of the bottom compartment to the upper part of the bottom compartment to secure the pressure conduit. Make sure that the lower engraved groove of the pressure conduit is approximately three to five millimeters above the edge of the adapter bushing of the bottom compartment. Pull the silicone tube with the electro spun scaffold over the pressure conduit and make a nod and the suture wire at the lower end of the electro spun scaffold, at the location of the engraved groove on the pressure conduit.Make a second nod at the opposite side to tightly secure the silicone tubing with the electro spun graft. And placing a scissor clamp equipped with a rule at the upper end of the silicone tubing, pull the scissor clamp upwards in a consistent manner and gently pull on the electric spawn scaffold to remove any wrinkles. Use a suture wire to make two knots at both ends of the scaffold at the upper engraved groove of the pressure conduit.When both knots have been made, release the scissor clamp and use a knife to remove any excess silicone tubing. Screw the nose cones on the screw thread of the pressure conduits for the samples that will be dynamically loaded. Dip the pressure conduit, tubing, and scaffold one time in 30%ethanol and two times in ultrapure water to pre-wet the setup.Place the glass tube over the pressure conduit and push gently on the bottom compartment to secure the glass tube in place. Then place the flow straightener, a silicone O-ring, and adapter bushing in the top compartment. And secure the compartment over the open end of the glass tube.Remove the male lure plug from the flow outlet, work in a sterile laminar flow cabinet. Open the white lure cap and place an ethanol soak tissue in front of the flow outlet. Deconstruct the flow culture chamber by taking off the glass tube with the top compartment.Place a vacuum pasture pipe add onto the electro spun scaffold to remove as much medium as possible. And add fibrinogen solution at a one-to-one ratio with the thrombin supplemented cell suspension. Pipette the solution up and down one time and immediately drip the solution over the full length of the scaffold.When all of the cells have been delivered, slowly move the scaffold from left to right and up and down to achieve an even distribution of the cells. When both sides of the scaffold have been seeded, carefully reconstruct the flow culture chamber by putting the glass tube and top compartment back. And place the flow culture chamber into the incubator to let the fiber solidify.To couple the bioreactor to the pump system, place the flow culture chamber on one of the eight screw threads on the bioreactor base. And place a host clip on the medium tubing. Remove the white lure cap, covering the flow inlet of the top compartment of the flow culture chamber and remove the female lure coupler of the medium tubing.Connect the medium tubing with one side of the flow inlet on the top compartment. And the other side with the flow outlet at the bottom compartment. Transfer the complete setup from the laminar flow cabinet to the incubator.And connect a fluidic units and the bioreactor base to the air pressure tubing and electric cable. Start the software and initialize the pumps. Start the medium flow for the samples one by one.Then change the strain pump parameters to the desired settings and start the strain. Monitor the stretch applied to the scaffold every other day. The monitoring of stretch and wall shear stress over longterm culture periods shows that these values can be maintained at relatively constant levels over a period of up to 20 days.After three days of hemodynamic loading, immunofluorescent staining reveals a homogenous distribution of monocyte derived macrophages and myofibroblasts throughout the scaffold. After 20 days of co-culture, cyclic stretch results in the deposition of more numerous and thicker collagen type 1 fibers. While in the combined hemodynamic load group, the cyclic stretch effect is overruled by sheer stress resulting in a less pronounced collagen type 1 deposition.After eight days of macrophage monoculture, fiber erosion and fiber cleavage are observed in all of the hemodynamic loading regimes with the most pronounced resorption observed in the static group, and the least pronounced resorption observed in the sheer stress group. Both cyclic stretch and a sheer stress impact the cytokine secretion profile of the co-culture setup. Interestingly, the combined effects of both loads show either dominance of one of the two loads or synergistic effects of both loads.Co-culture experiments also show that the mechanical environment and resulting loading dependent inflammatory environments modulate the phenotype of the myofibroblasts. Furthermore, the gene expression patterns of contractile marker alpha smooth muscle actin correlate with protein synthesis. The most important thing when performing this protocol is that's what the application of stretch, it's essential that your setup is leak-free.

Research

JoVE Journal

Engineering

Measuring Material Microstructure Under Flow Using 1-2 Plane Flow-Small Angle Neutron Scattering

قياس المواد المجهرية تحت التدفق باستخدام الطائرة 1-2 التدفق الصغيرة زاوية تشتت النيوترونات

A new small-angle neutron scattering (SANS) sample environment optimized for studying the microstructure of complex fluids under simple shear flow is ...

Experimental Protocol to Investigate Particle Aerosolization of a Product Under Abrasion and Under Environmental Weathering

بروتوكول تجريبي المعنية بالتحقيق في الجسيمات هباء من المنتج تحت كشط وتحت التجوية البيئية

The present article presents an experimental protocol to investigate particle aerosolization of a product under abrasion and under environmental ...

Design and Use of a Full Flow Sampling System (FFS) for the Quantification of Methane Emissions

Design and Use of a Full Flow Sampling System FFS for the Quantification of Methane Emissions

تصميم واستخدام نظام أخذ العينات التدفق الكامل (FFS) لالكمي لانبعاثات الميثان

The use of natural gas continues to grow with increased discovery and production of unconventional shale resources. At the same time, the natural gas ...

A Robotic Platform to Study the Foreflipper of the California Sea Lion

ومنصة الروبوتية لدراسة Foreflipper من أسد البحر كاليفورنيا

The California sea lion (Zalophus californianus), is an agile and powerful swimmer. Unlike many successful swimmers (dolphins, tuna), they generate most ...

Solvent Bonding for Fabrication of PMMA and COP Microfluidic Devices

الرابطة المذيبات لتصنيع PMMA وCOP أجهزة ميكروفلويديك

Thermoplastic microfluidic devices offer many advantages over those made from silicone elastomers, but bonding procedures must be developed for each ...

In Situ Visualization of the Phase Behavior of Oil Samples Under Refinery Process Conditions

In Situ Visualization of the Phase Behavior of Oil Samples Under Refinery Process Conditions

في الموقع التصور في سلوك المرحلة من عينات النفط تحت ظروف عملية مصفاة

To help address production issues in refineries caused by the fouling of process units and lines, we have developed a setup as well as a method to ...

Scanning Light Scattering Profiler (SLPS) Based Methodology to Quantitatively Evaluate Forward and Backward Light Scattering from Intraocular Lenses

Scanning Light Scattering Profiler SLPS Based Methodology to Quantitatively Evaluate Forward and Backward Light Scattering from Intraocular Lenses

المسح الضوئي لانتثار الضوء المنشئ (سلبس) المنهجية لتقييم كميا إلى الأمام والخلف نثر الضوء من العدسات داخل العين

The scanning light scattering profiler (SLSP) methodology has been developed for the full-angle quantitative evaluation of forward and backward light ...

A Novel Biaxial Testing Apparatus for the Determination of Forming Limit under Hot Stamping Conditions

A جهاز رواية ذو محورين اختبار لتحديد الحد تشكيل تحت الساخن شروط ختم

The hot stamping and cold die quenching process is increasingly used to form complex shaped structural components of sheet metals. Conventional ...

Microfluidic Imaging Flow Cytometry by Asymmetric-detection Time-stretch Optical Microscopy (ATOM)

Microfluidic Imaging Flow Cytometry by Asymmetric-detection Time-stretch Optical Microscopy ATOM

ميكروفلويديك تدفق التدفق الخلوي بواسطة غير المتماثلة الكشف الوقت تمتد المجهر الضوئي (أتوم)

Scaling the number of measurable parameters, which allows for multidimensional data analysis and thus higher-confidence statistical results, has been the ...

Flow-assisted Dielectrophoresis: A Low Cost Method for the Fabrication of High Performance Solution-processable Nanowire Devices

ديليكتروفوريسيس ساعد تدفق: طريقة منخفضة تكلفة لتصنيع الأجهزة عالية الأداء الحل مفهرسة أسلاك متناهية الصغر

Flow-assisted dielectrophoresis (DEP) is an efficient self-assembly method for the controllable and reproducible positioning, alignment, and selection of ...