Name: a multi-cue bioreactor to evaluate the inflammatory and regenerative capacity of biomaterials under flow and stretch
Uploaded: 2020-12-10T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Multi-Cue Bioreactor to Evaluate the Inflammatory and Regenerative Capacity of Biomaterials under Flow and Stretch at JoVE.com

Deze studie wordt financieel ondersteund door ZonMw in het kader van het LSH 2Treat programma (436001003) en de Nierstichting (14a2d507). N.A.K. erkent de steun van de Europese Onderzoeksraad (851960). Wij erkennen met dank het Gravitatieprogramma "Materials Driven Regeneration", gefinancierd door de Nederlandse Organisatie voor Wetenschappelijk Onderzoek (024.003.013).

In de studies die in dit protocol worden beschreven, zijn primaire menselijke macrofagen geïsoleerd uit perifere bloedpoeljassen en menselijke myofibroblasten geïsoleerd uit de sapheneuze ader na coronaire omleidingsoperaties gebruikt44. De buffy jassen werden verkregen van gezonde, geanonimiseerde vrijwilligers die schriftelijke geïnformeerde toestemming gaven, die werd goedgekeurd door de Sanquin Research Institutional Medical Ethical Committee. Het gebruik van menselijke vena saphena cellen ...

De hierin beschreven bioreactor maakt een systematische evaluatie mogelijk van de bijdragen van de individuele en gecombineerde effecten van schuifspanning en cyclische rek op ontsteking en weefselregeneratie in buisvormige resorbeerbare steigers. Deze aanpak maakt het ook mogelijk om een grote verscheidenheid aan analyses uit te voeren op vasculaire constructies, zoals geïllustreerd in de sectie representatieve resultaten. Deze resultaten tonen de onderscheidende impact van de verschillende hemodynamische belastingsreg...

Cardiovasculaire weefseltechniek (TE) wordt nagestreefd als een alternatieve behandelingsoptie voor de momenteel gebruikte permanente cardiovasculaire prothesen (bijv. vasculaire grafts, hartklepvervangingen), die suboptimaal zijn voor grote cohorten van patiënten1,2,3,4. Veelgevraagde toepassingen zijn weefselgeïnjeneerde vasculaire grafts (TEVGs)5,6 en hartkleppen (TEHVs)7,8. Meestal maken cardiovasculaire TE-methodieken gebruik van resorbeerbare biomaterialen (natuurlijk of synthetisch) die dienen als een leerzame steiger voor het nieuwe weefsel dat moet worden gevormd. De vorming van nieuw weefsel kan volledig in vitro worden ontworpen, door de steiger met cellen te zaaien en te cultiveren in een bioreactor voorafgaand aan implantatie (in vitro TE)9,10,11, of direct in situ, waarbij de synthetische steiger wordt geïmplanteerd zonder voorkweek om de vorming van nieuw weefsel rechtstreeks in het lichaam te induceren (in situ TE)12,13,14. Voor zowel in vitro als in situ cardiovasculaire TE-benaderingen is succesvolle functionele regeneratie dominant afhankelijk van zowel de immuunrespons van de gastheer op de geïmplanteerde constructie als de juiste biomechanische belasting.
Het belang van biomechanische belasting voor cardiovasculaire TE wordt algemeen erkend15. In het geval van cardiovasculaire implantaten worden de cellen die de steiger bevolken blootgesteld aan cyclische rek- en schuifspanningen die ontstaan als gevolg van de hemodynamische omgeving. Talrijke studies hebben het stimulerende effect van (cyclische) rek op de vorming van matrixcomponenten, zoals collageen16, 17,18,19,glycosaminoglycanen (GAGs)20, en elastine21,22, door verschillende celtypen gerapporteerd. Huang et al. toonden bijvoorbeeld aan dat biaxiale stretch de afzetting en organisatie van collageen en elastine in in vitro TEVGs verhoogde met behulp van een vasculaire bioreactor23. Hoewel de nadruk meestal ligt op rek als dominante belasting, maken deze studies vaak gebruik van door debiet aangedreven bioreactoren waarin het monster ook wordt blootgesteld aan afschuifstroom. Hoewel er relatief weinig bekend is over de geïsoleerde invloed van afschuifspanningen op weefselvorming en ontsteking in 3D, zijn er enkele gegevens beschikbaar. Zo toonden Hinderer et al. en Eoh et al. aan dat afschuifstroom, naast een 3D steigermicrostructuur, belangrijk was voor de vorming van volwassen elastine door menselijke vasculaire gladde spiercellen in een in vitro modelsysteem24,25. Al met al illustreren deze bevindingen de relevantie van zowel cyclische rek- als afschuifspanning voor cardiovasculaire TE.
Een andere belangrijke bepalende factor voor het succes of falen van TE-implantaten is de immuunrespons van de gastheer op de geïmplanteerdeent 26. Dit is met name belangrijk voor materiaalgestuurde TE-strategieën in situ, die eigenlijk afhankelijk zijn van de acute ontstekingsreactie op de steiger om de daaropvolgende processen van cellulaire instroom en endogene weefselvorming en remodellering op gang te brengen27. De macrofaag is een kritische initiator van functionele weefselregeneratie, wat is aangetoond door meerdere studies28,29,30. Analoog aan wondgenezing wordt de regeneratie van weefsel geregeld door paracrinesignalering tussen macrofagen en weefselproducerende cellen zoals fibroblasten en myofibroblasten31,32,33. Naast het coördineren van nieuwe weefseldepositie zijn macrofagen betrokken bij de actieve resorptie van vreemd steigermateriaal34,35. Als zodanig is de in vitro macrofaagrespons op een biomateriaal geïdentificeerd als een voorspellende parameter voor het in vivo succes van implantaten36,37,38.
De macrofaagrespons op een geïmplanteerde steiger is afhankelijk van steigerontwerpkenmerken zoals materiaalsamenstelling en microstructuur35,39,40. Naast steigereigenschappen wordt ook de macrofaagrespons op een steiger en hun overspraak met myofibroblasten beïnvloed door hemodynamische belastingen. Cyclische stretch bleek bijvoorbeeld een belangrijke modulator te zijn van macrofaagfenotype41,42,43,44 en de afscheiding van cytokinen43,44,45,46 in 3D-elektrospunsteigers. Battiston et al. toonden met behulp van een co-kweeksysteem van macrofagen en vasculaire gladde spiercellen aan dat de aanwezigheid van macrofagen leidde tot verhoogde niveaus van elastine en GAG's en dat matige niveaus van cyclische stretch (1,07-1,10) de afzetting van collageen I en elastine47stimuleerden . In eerdere werken hebben we aangetoond dat schuifspanning een belangrijke determinant is voor monocytwerving in 3D-elektrospunsteigers48,49, en dat zowel schuifspanning als cyclische rek de paracrinesignalering tussen menselijke monocyten en mesenchymale stromale cellenbeïnvloeden 50. Fahy et al. toonden aan dat de afschuifstroom de afscheiding van pro-inflammatoire cytokinen door menselijke monocyten verhoogde51.
Al met al toont het bovenstaande bewijs aan dat een adequaat begrip van en controle over hemodynamische belastingen cruciaal is voor cardiovasculaire TE, en dat het belangrijk is om de ontstekingsreactie te overwegen om dit te bereiken. Talrijke bioreactoren zijn eerder beschreven voor de in vitro52,53,54,55,56,57,58 of ex vivo59,60,61 kweek van cardiovasculaire weefsels. Al deze systemen zijn echter ontworpen om de fysiologische hemodynamische belastingsomstandigheden zoveel mogelijk na te bootsen. Hoewel dit zeer waardevol is voor het creëren van cardiovasculaire weefsels in vitro of het handhaven van ex vivo-culturen, maken dergelijke systemen geen systematisch onderzoek naar de individuele effecten van individuele signalen mogelijk. Dit komt omdat de toepassing van zowel cyclische rek- als schuifspanning in deze bioreactoren wordt aangedreven door dezelfde drukstroom, die ze intrinsiek verbindt. Hoewel microsystemen die nauwkeurige multi-cue mechanische manipulatie mogelijk maken, zijn beschreven voor 2D-substraten62 of 3D-hydrogelopstellingen63,64, maken dergelijke opstellingen het niet mogelijk om elastomeer 3D-biomateriaalsteigers op te zetten.
Hier presenteren we de toepassing van een buisvormig bioreactorsysteem dat op unieke wijze de ontkoppeling van schuifspanning en cyclische rek mogelijk maakt en helpt om hun individuele en gecombineerde effecten mechanistisch te onderzoeken. Dit systeem maakt het mogelijk om een breed scala aan weefselgeënskundig vasculaire grafts te testen (bijv. synthetische of natuurlijke oorsprong, verschillende micro-architectuur, verschillende porositeiten). Om de toepassing van afschuifspanning en rek effectief los te ontkoppelen, zijn de belangrijkste concepten die de bioreactor gebruikt (1) scheiding van de controle van schuifspanning en rek met behulp van verschillende pompsystemen en (2) stimulatie van de steigers op een 'inside-out' manier met rekengestuurde afmetingen. Debiet wordt aangebracht op het buitenoppervlak van de buissteiger door het gebruik van een stromingspomp, terwijl de omtrek van de steiger wordt veroorzaakt door het uitzetten van een siliconenbuis waarop de steiger is gemonteerd door het gebruik van een aparte stampomp. De afmetingen van de siliconenbuis en de glazen buis die de constructie bevat, worden zorgvuldig gekozen en gevalideerd met behulp van computationele vloeistofdynamicasimulaties, om ervoor te zorgen dat de schuifspanning op de steiger (als gevolg van stroming) en de omtrekspanning (als gevolg van buisuitbreiding) elkaar niet significant beïnvloeden. Dit inside-out ontwerp heeft verschillende praktische redenen. Als stretch wordt toegepast door de lichtgevende vloeistofdruk (vergelijkbaar met fysiologische belasting), vereist dit inherent dat het monsterontwerp lekvrij is. Bovendien zou de druk die nodig is om het monster uit te rekken volledig worden bepaald door de stijfheid van het monster, die in de loop van de tijd tussen de monsters en binnen een monster kan variëren, waardoor het moeilijk is om de rek te controleren. Deze bioreactor monteert het weefsel ontworpen transplantaat rond een siliconenbuis en maakt het mogelijk om muurschaarspanning (WSS) aan te brengen op de buitenwand van de graft en zet de ent van binnenuit onder druk. Op deze manier kunnen gelijke belastingsomstandigheden tussen monsters en binnen monsters in de loop van de tijd worden gegarandeerd, en bovendien mogen de monsters lekken, zoals gebruikelijk is voor poreuze vasculaire steigers19. Deze inside-out bioreactor is specifiek bedoeld voor systematisch onderzoek naar de effecten van afschuiven en/of rekken, in plaats van de engineering van een native-achtig bloedvat in vitro, waarvoor traditionele vasculaire bioreactoropstellingen geschikter zijn. Zie figuur 1A–B voor de ontwerptekeningen van de bioreactor en de bijbehorende tabel 1 voor een functionele beschrijving en motivering achter de belangrijkste componenten van de bioreactor.
Het gebruik van de bioreactor wordt aangetoond op basis van een reeks recente studies van onze groep waarin we de individuele en gecombineerde invloeden van schuifspanning en cyclische rek op ontsteking en weefselvorming in resorbeerbare elektrospunsteigers voor in situ cardiovasculair weefsel19,43,44onderzochten . Daartoe gebruikten we menselijke macrofagen en myofibroblasten in mono- of in co-cultuur om de verschillende fasen van de regeneratieve cascade in situ te simuleren. We hebben aangetoond dat cytokinesecretie door menselijke macrofagen duidelijk wordt beïnvloed door zowel cyclische rek- als schuifspanning, die de matrixdepositie en organisatie door menselijke myofibroblasten in deze steigers beïnvloedt, zowel via paracrinesignalering als direct contact19,43,44. Met name deze studies toonden aan dat in het geval van gecombineerde toepassing van afschuifspanning en rek, de effecten op weefselvorming en ontsteking worden gedomineerd door een van de twee belastingen, of dat er synergetische effecten van beide belastingen zijn. Deze bevindingen illustreren de relevantie van het ontkoppelen van beide belastingen om een beter inzicht te krijgen in de bijdrage van de mechanische omgeving aan TE-processen. Dit begrip kan worden toegepast om steigerontwerpparameters systematisch te optimaliseren in relevante hemodynamische belastingsregimes. Bovendien kunnen de mechanistische gegevens uit dergelijke goed gecontroleerde omgevingen dienen als input voor numerieke modellen die worden ontwikkeld om het verloop van in situ weefselremodellering te voorspellen, zoals onlangs gerapporteerd voor TEVGs65 of TEHVs66, om de voorspellende capaciteit verder te verbeteren.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >advanced Dulbecco&#8217;s modified EagleMedium (aDMEM)</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >12491-015</td>
			<td >cell culture medium for fibroblasts</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Aqua Stabil</td>
			<td >Julabo</td>
			<td >8940012</td>
			<td >prevent microorganism growth in bioreactor-hydraulic reservoir</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Bovine fibrinogen</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >F8630</td>
			<td >to prepare fibrinogen gel to seed the cells on the electrospun scaffold</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Bovine thrombin</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >T4648</td>
			<td >to prepare fibrinogen gel to seed the cells on the electrospun scaffold</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Centrifuge</td>
			<td >Eppendorf</td>
			<td >5804</td>
			<td >to spin down cells and conditioned medium</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Clamp scissor - &#34;kelly forceps&#34;</td>
			<td >Almedic</td>
			<td >P-422</td>
			<td >clamp the silicone tubing and apply pre-stretch to the scaffold so the scaffold can be sutured into the engraved groove (autoclave at step 1, step 7)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CO2 cell culture incubators</td>
			<td >Sanyo</td>
			<td >MCO-170AIC-PE</td>
			<td >for cell culturing</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Compressed air reservoir</td>
			<td >Festo</td>
			<td >CRVZS-5</td>
			<td >smoothing air pressure fluctuations and create time delays for pressure build-up</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Custom Matlab script to calculate the maximum stretches</td>
			<td >Matlab</td>
			<td >R2017. The Mathworks, Natick, MA</td>
			<td >calculate the minimum and maximum outer diameter of the electrospun scaffold</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Data acquisition board</td>
			<td >National Instruments</td>
			<td >BNC-2090</td>
			<td >data processing in between amplifier system and computer</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ethanol</td>
			<td >VWR</td>
			<td >VWRK4096-9005</td>
			<td >to keep sterile working conditions</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fetal bovine calf serum (FBS)</td>
			<td >Greiner</td>
			<td >758087</td>
			<td >cell culture medium supplement; serum-supplement</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Flow culture chamber compartments, consisting of a pressure conduit with engraved grooves and small holes to apply pressure on silicone tubing, a screw thread, nose cone, top compartment with flow inlet and bottom compartment flow outlet, adapter bushing</td>
			<td >Custom made, Department of Biomedical Engineering, Eindhoven University of Technology</td>
			<td >n.a.</td>
			<td >flow culture chamber compartments (autoclave at step 1, step 7)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Glass Pasteur pipet</td>
			<td >Assistant</td>
			<td >HE40567002</td>
			<td >apply vacuum on electrospun scaffold (autoclave at step 1)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Glass tubes of the flow culture chamber</td>
			<td >Custon made, Equipment &#38; Prototype Center, Eindhoven University of Technology</td>
			<td >n.a.</td>
			<td >part of the flow culture chamber (clean and store in 70% ethanol, at step 1 and 7)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >GlutaMax</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >35050061</td>
			<td >cell culture medium amino acid supplement, minimizes ammonia build-up</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >High speed camera</td>
			<td >MotionScope</td>
			<td >M-5</td>
			<td >to monitor the stretch during culture; time-lapse photographs of the scaffolds are captured at a frequency of 30 Hz for 6 sec (i.e. 3 stretch cycles)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >High speed camera lens - Micro-NIKKOR 55mm f/2.8 - lens</td>
			<td >Nikon</td>
			<td >JAA616AB</td>
			<td >to monitor the stretch during culture; time-lapse photographs of the scaffolds are captured at a frequency of 30 Hz for 6 sec (i.e. 3 stretch cycles)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hose clip</td>
			<td >ibidi GmbH</td>
			<td >10821</td>
			<td >block medium flow (autoclave at step 1, step 7)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hydraulic reservoir with 8 screw threads for 8 flow culture chambers</td>
			<td >Custom made, Department of Biomedical Engineering, Eindhoven University of Technology</td>
			<td >n.a.</td>
			<td >to apply pressure to the silicone mounted constructs (clean outside with a paper tissue with 70% ethanol, rinse reservoir with 70% ethanol followed by demi water, at step 1 and 7)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ibidi pump system (8x) including ibidi pump, PumpControl software, fluidic unit, perfusion set (medium tubing), air pressure tubing, drying bottles with orange silica beads</td>
			<td >ibidi GmbH</td>
			<td >10902</td>
			<td >set up used to control the flow in the flow culture chambers. Note 1: the ibidi pumps were modified by the manufacturer to enable 200 mbar capacity. Note 2: can be replaced by pump system of other manufacturer, as long as same flow regimes can be applied.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Knives (no.10 sterile blades, individual foil pack) and scalpel handle (stainless steel, individually wrapped)</td>
			<td >Swann Morton</td>
			<td >0301; 0933</td>
			<td >to cut the silicone tubing in the correct size for the scaffold and to cut the suture material</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >LabVIEW Software</td>
			<td >National Instruments</td>
			<td >version 2018</td>
			<td >to control the stretch applied to the scaffolds</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Laminar flow biosafety cabinet with UV light</td>
			<td >Labconco</td>
			<td >302310001</td>
			<td >to ensure sterile working conditions. The UV is used to decontaminate everything that cannot be autoclaved, or touched after autoclaving</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Large and small petri dishes</td>
			<td >Greiner</td>
			<td >664-160</td>
			<td >for sterile working conditions</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >L-ascorbic acid 2-phosphate (vitamin C)</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >A8960</td>
			<td >cell culture medium supplement, important for collagen production</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >LED light cold source KL2500</td>
			<td >Zeiss</td>
			<td >Schott AG</td>
			<td >to aid in visualization for the time lapse of the scaffolds during monitoring of the stretch</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Luer (female and male) locks and connectors, white luer caps</td>
			<td >ibidi GmbH</td>
			<td >various, see (https://ibidi.com/26-flow-accessories)</td>
			<td >to close or connect parts of the bioreactor and the ibidi pump (autoclave at step 1, step 7)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Measuring amplifier (PICAS)</td>
			<td >PEEKEL instruments B.V.</td>
			<td >n.a.</td>
			<td >to amplify the signal from the pressure sensor and feedback to LabView</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Medium reservoir (large syringes 60 mL) and reservoir holders</td>
			<td >ibidi GmbH</td>
			<td >10974</td>
			<td >medium reservoir (autoclave at step 1, step 7)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Medium tubing with 4.25 mm outer diameter and 1 mm inner diameter</td>
			<td >Rubber BV</td>
			<td >1805</td>
			<td >to allow for a larger flow rate, the ibidi medium tubing with larger diameter is used. Note: the part of medium tubing guided through the fluidic unit valves are the same as the default ibidi medium tubing</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Motion Studio Software</td>
			<td >Idtvision</td>
			<td >2.15.00</td>
			<td >to make the high speed time lapse images for stretch monitoring</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Needle (19G)</td>
			<td >BD Microlance</td>
			<td >301700</td>
			<td >together with thin flexible tubing used to fill the hydraulic reservoir with ultrapure water without adding air bubbles</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Needle driver</td>
			<td >Adson</td>
			<td >2429218</td>
			<td >to handle the needle of the nylon suture through the silicone tube (autoclave at step 1, step 7)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Paper tissues</td>
			<td >Kleenex</td>
			<td >38044001</td>
			<td >for cleaning of the equipment with 70% ethanol</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Parafilm</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >P7793-1EA</td>
			<td >quick fix if leakage occurs</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Penicillin/streptomycin (P/S)</td>
			<td >Lonza</td>
			<td >DE17-602E</td>
			<td >cell culture medium supplement; prevent bacterial contamination</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >P4417-100TAB</td>
			<td >for storage and washing steps (autoclave at step 1)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Plastic containers (60 mL) with red screw caps</td>
			<td >Greiner</td>
			<td >206202</td>
			<td >to prepare the fibrinogen solution</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pneumatic cylinder</td>
			<td >Festo</td>
			<td >AEVC-20-10-I-P</td>
			<td >to actuate the Teflon bellow (clean with a paper tissue with 70% ethanol at step 1 and 7)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Polycaprolactone bisurea (PCL-BU) tubular scaffolds (3 mm inner diameter, 200 &#181;m wall thickness, 20 mm length)</td>
			<td >SyMO-Chem, Eindhoven, The Netherlands</td>
			<td >n.a.</td>
			<td >produced using electrospinning from 15% (w/w) chloroform (Sigma; 372978) polymer solutions. See Van Haaften et al Tissue Engineering Part C (2018) for more details</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pressure conduit without holes (for static control)</td>
			<td >Custom made, Department of Biomedical Engineering, Eindhoven University of Technology</td>
			<td >n.a.</td>
			<td >to mount electrospun tubes on silicon tubing (autoclave at step 1, step 7)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pressure sensor and transducer</td>
			<td >BD</td>
			<td >TC-XX and P 10 EZ</td>
			<td >the air pressure going to the pneumatic actuated pump is raised until it reaches the set pressure</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Proportional air pressure control valve and pressure sensor</td>
			<td >Festo</td>
			<td >MPPES-3-1/8-2-010, 159596</td>
			<td >provides compressed air to the pneumatic actuated pump</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI-1640)</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >A1049101</td>
			<td >cell culture medium for monocyte/macrophage</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Safe lock Eppendorf tubes (1.5 mL)</td>
			<td >Eppendorf</td>
			<td >30120086</td>
			<td >multiple applications (autoclave at step 1)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sodium dodecyl sulfate solution 20%</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >5030</td>
			<td >Used to clean materials, at a concentration of 0.1%.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Silicone O-rings</td>
			<td >Technirub</td>
			<td >1250S</td>
			<td >to prevent leakage (autoclave at step 1, step 7)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Silicone tubing (2.8 mm outer diameter, 400 um wall thickness)</td>
			<td >Rubber BV</td>
			<td >1805</td>
			<td >to mount the electrospun tubes on the pressure conduits (autoclave at step 1)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sterile tube (15 mL)</td>
			<td >Falcon</td>
			<td >352095</td>
			<td >multiple applications</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Suture, 5-0 prolene with pre-attached taper point needle</td>
			<td >Ethicon, Johnson&#38;Johnson</td>
			<td >EH7404H</td>
			<td >Prolene suture wire 5-0 (75cm length, TF taper point needle, 1/2 circle, 13 mm needle length)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Syringe (24 mL)</td>
			<td >B. Braun Melsungen AG</td>
			<td >2057932</td>
			<td >to add the ultrapure water or medium to the hydraulic reservoir or flow culture chamber</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Syringe filter (0.2 &#181;m)</td>
			<td >Satorius</td>
			<td >17597-K</td>
			<td >to filter the fibrinogen solution</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >T150 cell culture flask with filter cap</td>
			<td >Nunc</td>
			<td >178983</td>
			<td >to degas culture medium</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >T75 Cell culture flask with filter cap</td>
			<td >Nunc</td>
			<td >156499</td>
			<td >to culture static control samples</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Teflon bellow</td>
			<td >Custom made, Department of Biomedical Engineering, Eindhoven University of Technology</td>
			<td >n.a.</td>
			<td >to load the hydraulic reservoir (clean outside with a paper tissue with 70% ethanol at step 1 and 7)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tray (stainless steel)</td>
			<td >PolarWare</td>
			<td >15-248</td>
			<td >for easy transport of the fluidic culture chambers and the bioreactor from incubator to laminar flow cabinet and back (clean with a paper tissue with 70% ethanol before and after use)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tweezers</td>
			<td >Wironit</td>
			<td >4910</td>
			<td >sterile handling of individual parts (autoclave at step 1 and 7)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ultrapure water</td>
			<td >Stakpure</td>
			<td >Omniapure UV 18200002</td>
			<td >to correct for medium evaporation, mixed with aqua stabil mixed and used as hydraulic fluid. (autoclave ultrapure water at step 1)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >UV light</td>
			<td >Philips</td>
			<td >TUV 30W/G30 T8</td>
			<td >for decontamination of grafts and bioreactor parts before seeding</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a multi-cue bioreactor to evaluate the inflammatory and regenerative capacity of biomaterials under flow and stretch

Het gebruik van resorbeerbare biomaterialen om regeneratie direct in het lichaam te induceren is een aantrekkelijke strategie vanuit een translationeel perspectief. Dergelijke materialen induceren een ontstekingsreactie bij implantatie, die de oorzaak is van daaropvolgende resorptie van het materiaal en de regeneratie van nieuw weefsel. Deze strategie, ook bekend als in situ tissue engineering, wordt nagestreefd om cardiovasculaire vervangingen zoals weefsel-engineered vasculaire grafts te verkrijgen. Zowel de ontstekings- als de regeneratieve processen worden bepaald door de lokale biomechanische signalen op de steiger (d.w.z. rek- en schuifspanning). Hier beschrijven we in detail het gebruik van een op maat ontwikkelde bioreactor die op unieke wijze het ontkoppelen van rek- en schuifspanning op een buisvormige steiger mogelijk maakt. Dit maakt een systematische en gestandaardiseerde evaluatie mogelijk van het ontstekings- en regeneratieve vermogen van buisvormige steigers onder invloed van goed gecontroleerde mechanische belastingen, wat we aantonen op basis van een dynamisch co-cultuurexperiment met menselijke macrofagen en myofibroblasten. De belangrijkste praktische stappen in deze aanpak - de bouw en het opzetten van de bioreactor, de voorbereiding van de steigers en het zaaien van cellen, het aanbrengen en onderhouden van rek- en afschuifstroom en het oogsten van monsters voor analyse - worden in detail besproken.

Deze bioreactor is ontwikkeld om de individuele en gecombineerde effecten van afschuifspanning en cyclische rek op vasculaire weefselgroei en remodellering in 3D-biomateriaalsteigers te bestuderen. Het ontwerp van de bioreactor maakt het mogelijk om tot acht vasculaire constructies onder verschillende belastingsomstandigheden te cultiveren (figuur 1A). De vasculaire constructies bevinden zich in een stromingscultuurkamer (figuur 1B) waarin zowel de omtrek als WS...

Watch this Scientific Journal Video about A Multi-Cue Bioreactor to Evaluate the Inflammatory and Regenerative Capacity of Biomaterials under Flow and Stretch at JoVE.com

A Multi-Cue Bioreactor to Evaluate the Inflammatory and Regenerative Capacity of Biomaterials under Flow and Stretch

Het doel van dit protocol is om een dynamische co-cultuur van menselijke macrofagen en myofibroblasten in buisvormige elektrospunsteigers uit te voeren om materiaalgestuurde weefselregeneratie te onderzoeken, met behulp van een bioreactor die het ontkoppelen van schuifspanning en cyclische rek mogelijk maakt.

Een multi-cue bioreactor om de inflammatoire en regeneratieve capaciteit van biomaterialen onder flow en stretch te evalueren

The use of resorbable biomaterials to induce regeneration directly in the body is an attractive strategy from a translational perspective. Such materials ...

So far, it has been really difficult to identify the cause and effect relationships between hemodynamics and vascular tissue regeneration. And this has because it's challenging to control the individual mechanical loads. This bioreactor enables us to mechanistically investigate the individual and combined effects of sheer stress and cyclic stretch on the regenerative potential of a broad variety of tissue engineered vascular grafts.Demonstrating this procedure will be Suzanne Koch, a PhD candidate in our group. And Dr.Tamar Wissing who is a postdoctoral researcher from our laboratory. To mount the electro spun scaffold onto the silicone tubing, thread a 4-0 prolene suture into one end of a piece of silicone tubing and out of the other.Make a small knot on both sides of the tube leaving approximately 10 centimeters of wire on both knots and make a third knot on top of the two. After removing a suture needle, trim the edges of the silicone tubing into a triangular shape and make a final knot at the end of the two 10 centimeter wires. Dip the electro spun scaffold in 30%ethanol and place the scaffold over one end of free suture wire.Next, gently stretch both sides of the silicone tubing and the 10 centimeter suture knot while second researcher uses tweezers with a smooth inner tip to gently slide the electro spun scaffold over the tubing. Slowly release the stretch on the silicone tubing while simultaneously smoothing the electro spun scaffold with the tweezers. And dip the scaffold and silicone tubing in ultra pure water two times.Construct the bottom compartment and make sure that the O-ring is properly placed. Place an adaptor bushing in the upper part of the bottom compartment and place the pressure conduit with holes through the bottom compartment. Lace the silicone O-ring around the lower end of the pressure conduit to prevent leakage.And screw the lower part of the bottom compartment to the upper part of the bottom compartment to secure the pressure conduit. Make sure that the lower engraved groove of the pressure conduit is approximately three to five millimeters above the edge of the adapter bushing of the bottom compartment. Pull the silicone tube with the electro spun scaffold over the pressure conduit and make a nod and the suture wire at the lower end of the electro spun scaffold, at the location of the engraved groove on the pressure conduit.Make a second nod at the opposite side to tightly secure the silicone tubing with the electro spun graft. And placing a scissor clamp equipped with a rule at the upper end of the silicone tubing, pull the scissor clamp upwards in a consistent manner and gently pull on the electric spawn scaffold to remove any wrinkles. Use a suture wire to make two knots at both ends of the scaffold at the upper engraved groove of the pressure conduit.When both knots have been made, release the scissor clamp and use a knife to remove any excess silicone tubing. Screw the nose cones on the screw thread of the pressure conduits for the samples that will be dynamically loaded. Dip the pressure conduit, tubing, and scaffold one time in 30%ethanol and two times in ultrapure water to pre-wet the setup.Place the glass tube over the pressure conduit and push gently on the bottom compartment to secure the glass tube in place. Then place the flow straightener, a silicone O-ring, and adapter bushing in the top compartment. And secure the compartment over the open end of the glass tube.Remove the male lure plug from the flow outlet, work in a sterile laminar flow cabinet. Open the white lure cap and place an ethanol soak tissue in front of the flow outlet. Deconstruct the flow culture chamber by taking off the glass tube with the top compartment.Place a vacuum pasture pipe add onto the electro spun scaffold to remove as much medium as possible. And add fibrinogen solution at a one-to-one ratio with the thrombin supplemented cell suspension. Pipette the solution up and down one time and immediately drip the solution over the full length of the scaffold.When all of the cells have been delivered, slowly move the scaffold from left to right and up and down to achieve an even distribution of the cells. When both sides of the scaffold have been seeded, carefully reconstruct the flow culture chamber by putting the glass tube and top compartment back. And place the flow culture chamber into the incubator to let the fiber solidify.To couple the bioreactor to the pump system, place the flow culture chamber on one of the eight screw threads on the bioreactor base. And place a host clip on the medium tubing. Remove the white lure cap, covering the flow inlet of the top compartment of the flow culture chamber and remove the female lure coupler of the medium tubing.Connect the medium tubing with one side of the flow inlet on the top compartment. And the other side with the flow outlet at the bottom compartment. Transfer the complete setup from the laminar flow cabinet to the incubator.And connect a fluidic units and the bioreactor base to the air pressure tubing and electric cable. Start the software and initialize the pumps. Start the medium flow for the samples one by one.Then change the strain pump parameters to the desired settings and start the strain. Monitor the stretch applied to the scaffold every other day. The monitoring of stretch and wall shear stress over longterm culture periods shows that these values can be maintained at relatively constant levels over a period of up to 20 days.After three days of hemodynamic loading, immunofluorescent staining reveals a homogenous distribution of monocyte derived macrophages and myofibroblasts throughout the scaffold. After 20 days of co-culture, cyclic stretch results in the deposition of more numerous and thicker collagen type 1 fibers. While in the combined hemodynamic load group, the cyclic stretch effect is overruled by sheer stress resulting in a less pronounced collagen type 1 deposition.After eight days of macrophage monoculture, fiber erosion and fiber cleavage are observed in all of the hemodynamic loading regimes with the most pronounced resorption observed in the static group, and the least pronounced resorption observed in the sheer stress group. Both cyclic stretch and a sheer stress impact the cytokine secretion profile of the co-culture setup. Interestingly, the combined effects of both loads show either dominance of one of the two loads or synergistic effects of both loads.Co-culture experiments also show that the mechanical environment and resulting loading dependent inflammatory environments modulate the phenotype of the myofibroblasts. Furthermore, the gene expression patterns of contractile marker alpha smooth muscle actin correlate with protein synthesis. The most important thing when performing this protocol is that's what the application of stretch, it's essential that your setup is leak-free.

Research

JoVE Journal

Engineering

Measuring Material Microstructure Under Flow Using 1-2 Plane Flow-Small Angle Neutron Scattering

Meten Materiaal microstructuur Onder Flow Met behulp van 1-2 Plane Flow-Lage hoek neutronenverstrooiing

A new small-angle neutron scattering (SANS) sample environment optimized for studying the microstructure of complex fluids under simple shear flow is ...

Experimental Protocol to Investigate Particle Aerosolization of a Product Under Abrasion and Under Environmental Weathering

Experimenteel Protocol te onderzoeken Particle Aërosolvorming van een Product Under Schuring en Under Milieu Weathering

The present article presents an experimental protocol to investigate particle aerosolization of a product under abrasion and under environmental ...

Design and Use of a Full Flow Sampling System (FFS) for the Quantification of Methane Emissions

Design and Use of a Full Flow Sampling System FFS for the Quantification of Methane Emissions

Ontwerp en gebruik van een Full Flow Sampling System (FFS) voor de kwantificering van methaan emissies

The use of natural gas continues to grow with increased discovery and production of unconventional shale resources. At the same time, the natural gas ...

A Robotic Platform to Study the Foreflipper of the California Sea Lion

Een Robotic Platform aan de Foreflipper van de Californische zeeleeuw Studie

The California sea lion (Zalophus californianus), is an agile and powerful swimmer. Unlike many successful swimmers (dolphins, tuna), they generate most ...

Solvent Bonding for Fabrication of PMMA and COP Microfluidic Devices

Oplosmiddel Bonding voor de productie van PMMA en COP microfluïdische apparaten

Thermoplastic microfluidic devices offer many advantages over those made from silicone elastomers, but bonding procedures must be developed for each ...

In Situ Visualization of the Phase Behavior of Oil Samples Under Refinery Process Conditions

In Situ Visualization of the Phase Behavior of Oil Samples Under Refinery Process Conditions

In Situ Visualisatie van het fasegedrag van Oil Monsters Under raffinageproces Voorwaarden

To help address production issues in refineries caused by the fouling of process units and lines, we have developed a setup as well as a method to ...

Scanning Light Scattering Profiler (SLPS) Based Methodology to Quantitatively Evaluate Forward and Backward Light Scattering from Intraocular Lenses

Scanning Light Scattering Profiler SLPS Based Methodology to Quantitatively Evaluate Forward and Backward Light Scattering from Intraocular Lenses

Scanning Light Scattering Profiler (SLPS) gebaseerde methodologie om kwantitatief te evalueren voorwaartse en achterwaartse lichtverspreiding van intraculaire objectieven

The scanning light scattering profiler (SLSP) methodology has been developed for the full-angle quantitative evaluation of forward and backward light ...

A Novel Biaxial Testing Apparatus for the Determination of Forming Limit under Hot Stamping Conditions

A Novel Biaxial testapparatuur voor de bepaling van vormingsgrens onder stampen Voorwaarden

The hot stamping and cold die quenching process is increasingly used to form complex shaped structural components of sheet metals. Conventional ...

Microfluidic Imaging Flow Cytometry by Asymmetric-detection Time-stretch Optical Microscopy (ATOM)

Microfluidic Imaging Flow Cytometry by Asymmetric-detection Time-stretch Optical Microscopy ATOM

Microfluïdische Imaging Flow Cytometry door Asymmetrische Deteksie Time-stretch Optische Microscopie (ATOM)

Scaling the number of measurable parameters, which allows for multidimensional data analysis and thus higher-confidence statistical results, has been the ...

Flow-assisted Dielectrophoresis: A Low Cost Method for the Fabrication of High Performance Solution-processable Nanowire Devices

Stroom-bijgewoonde diëlektroforese: Een Low-Cost methode voor de fabricage van hoogwaardige oplossing-verwerkbaar Nanowire apparaten

Flow-assisted dielectrophoresis (DEP) is an efficient self-assembly method for the controllable and reproducible positioning, alignment, and selection of ...