Name: a multi-cue bioreactor to evaluate the inflammatory and regenerative capacity of biomaterials under flow and stretch
Uploaded: 2020-12-10T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Multi-Cue Bioreactor to Evaluate the Inflammatory and Regenerative Capacity of Biomaterials under Flow and Stretch at JoVE.com

Cette étude est soutenue financièrement par ZonMw dans le cadre du programme LSH 2Treat (436001003) et de la Dutch Kidney Foundation (14a2d507). N.A.K. reconnaît le soutien du Conseil européen de la recherche (851960). Nous remercions le programme gravitation « Materials Driven Regeneration », financé par l’Organisation néerlandaise pour la recherche scientifique (024.003.013).

Dans les études décrites dans ce protocole, des macrophages humains primaires isolés des manteaux bouffants du sang périphérique et des myofibroblastes humains isolés de la veine saphène après une chirurgie de pontage coronaire ont été utilisés44. Les manteaux bouffants ont été obtenus auprès de volontaires en bonne santé et anonymes qui ont fourni un consentement éclairé écrit, qui a été approuvé par le Comité d’éthique médicale de l’établissement de recherche Sanquin...

Le bioréacteur décrit ici permet l’évaluation systématique des contributions de l’individu et des effets combinés de la contrainte de cisaillement et de l’étirement cyclique sur l’inflammation et la régénération tissulaire dans les échafaudages tubulaires résorbables. Cette approche permet également d’effectuer une grande variété d’analyses sur des constructions vasculaires, comme l’illustre la section des résultats représentatifs. Ces résultats montrent l’impact distinctif des différent...

L’ingénierie tissulaire cardiovasculaire (TE) est poursuivie comme une option de traitement alternative aux prothèses cardiovasculaires permanentes actuellement utilisées (par exemple, greffes vasculaires, remplacements de valves cardiaques), qui sont sous-optimales pour de grandes cohortes de patients1,2,3,4. Les applications très recherchées comprennent les greffes vasculaires d’ingénierie tissulaire (TEVG)5,6 et les valves cardiaques (TEHV)7,8. Le plus souvent, les méthodologies d’ÉT cardiovasculaire utilisent des biomatériaux résorbables (naturels ou synthétiques) qui servent d’échafaudage instructif pour la formation du nouveau tissu. La formation de nouveaux tissus peut soit être conçue complètement in vitro, en ensemencant l’échafaudage avec des cellules et en le cultivant dans un bioréacteur avant l’implantation (TE in vitro)9,10,11, soit directement in situ, dans laquelle l’échafaudage synthétique est implanté sans pré-culture afin d’induire la formation de nouveaux tissus directement dans le corps (TE in situ)12,13,14. Pour les approches cardiovasculaires TE in vitro et in situ, la régénération fonctionnelle réussie dépend principalement de la réponse immunitaire de l’hôte à la construction implantée et de la charge biomécanique appropriée.
L’importance de la charge biomécanique pour les TE cardiovasculaires est bien reconnue15. Dans le cas des implants cardiovasculaires, les cellules qui peuplent l’échafaudage sont exposées à des contraintes d’étirement et de cisaillement cycliques résultant de l’environnement hémodynamique. De nombreuses études ont rapporté l’effet stimulant de l’étirement (cyclique) sur la formation de composants de la matrice,tels que le collagène16,17,18,19, glycosaminoglycanes (GAGs)20, etl’élastine 21,22, par divers types de cellules. Par exemple, Huang et al. ont démontré que l’étirement biaxial élevait le dépôt et l’organisation du collagène et de l’élastine dans les TEVG in vitro en utilisant un bioréacteur vasculaire23. Bien que l’accent soit généralement mis sur l’étirement en tant que charge dominante, ces études utilisent souvent des bioréacteurs pilotés par écoulement dans lesquels l’échantillon est également exposé à un écoulement de cisaillement. Bien que l’on sache relativement peu de choses sur l’influence isolée des contraintes de cisaillement sur la formation des tissus et l’inflammation en 3D, certaines données sont disponibles. Par exemple, Hinderer et al. et Eoh et al. ont démontré que le flux de cisaillement, en plus d’une microstructure d’échafaudage 3D, était important pour la formation d’élastine mature par les cellules musculaires lisses vasculaires humaines dans un système de modèle in vitro24,25. Dans l’ensemble, ces résultats illustrent la pertinence de l’étirement cyclique et du stress de cisaillement pour l’ET cardiovasculaire.
Un autre déterminant important du succès ou de l’échec des implants TE est la réponse immunitaire de l’hôte au greffon implanté26. Ceci est particulièrement important pour les stratégies TE in situ axées sur les matériaux, qui reposent en fait sur la réponse inflammatoire aiguë à l’échafaudage pour lancer les processus ultérieurs d’afflux cellulaire et de formation et de remodelage des tissus endogènes27. Le macrophage est un initiateur critique de la régénération fonctionnelle des tissus, ce qui a été démontré par de multiples études28,29,30. Analogue à la cicatrisation des plaies, la régénération des tissus est régie par la signalisation paracrine entre les macrophages et les cellules productrices de tissus telles que les fibroblastes et les myofibroblastes31,32,33. En plus de coordonner les nouveaux dépôts tissulaires, les macrophages sont impliqués dans la résorption active des échafaudages étrangers34,35. A ce titre, la réponse in vitro des macrophages à un biomatériau a été identifiée comme un paramètre prédictif du succès in vivo des implants36,37,38.
La réponse des macrophages à un échafaudage implanté dépend des caractéristiques de conception de l’échafaudage telles que la composition du matériau et la microstructure35,39,40. En plus des propriétés de l’échafaudage, la réponse des macrophages à un échafaudage et leur diaphonie avec les myofibroblastes sont également affectées par les charges hémodynamiques. Par exemple, l’étirement cyclique s’est avéré être un modulateur important du phénotype des macrophages41,42,43,44 et de la sécrétion de cytokines 43 ,44,45,46 dans les échafaudages électrospunés 3D. En utilisant un système de co-culture de macrophages et de cellules musculaires lisses vasculaires, Battiston et al. ont démontré que la présence de macrophages entraînait une augmentation des niveaux d’élastine et de GAG et que des niveaux modérés d’étirement cyclique (1,07-1,10) stimulaient le dépôt de collagène I et d’élastine47. Dans des travaux antérieurs, nous avons démontré que le stress de cisaillement est un déterminant important pour le recrutement des monocytes dans les échafaudages électro filés3D 48,49, et que le stress de cisaillement et l’étirement cyclique ont un impact sur la signalisation paracrine entre les monocytes humains et les cellules stromales mésenchymateuses50. Fahy et al. ont démontré que le flux de cisaillement augmentait la sécrétion de cytokines pro-inflammatoires par les monocytes humains51.
Pris ensemble, les preuves ci-dessus montrent qu’une compréhension et un contrôle adéquats des charges hémodynamiques sont cruciaux pour l’ÉT cardiovasculaire, et qu’il est important de prendre en compte la réponse inflammatoire pour y parvenir. De nombreux bioréacteurs ont été décrits précédemment pour la culture in vitro52,53,54,55,56,57,58 ou ex vivo59,60,61 de tissus cardiovasculaires. Cependant, tous ces systèmes sont conçus pour imiter autant que possible les conditions physiologiques de charge hémodynamique. Bien que cela soit très utile dans le but de créer des tissus cardiovasculaires in vitro ou de maintenir des cultures ex vivo, de tels systèmes ne permettent pas d’études systématiques sur les effets individuels d’indices individuels. En effet, l’application de la contrainte d’étirement et de cisaillement cyclique dans ces bioréacteurs est entraînée par le même écoulement sous pression, qui les lie intrinsèquement. Alors que des microsystèmes permettant une manipulation mécanique multi-signaux précise ont été décrits pour les substrats2D 62 ou les configurations d’hydrogel 3D63,64, de telles configurations ne permettent pas l’incorporation d’échafaudages de biomatériaux élastomères 3D.
Nous présentons ici l’application d’un système de bioréacteur tubulaire qui permet de manière unique le découplage de la contrainte de cisaillement et de l’étirement cyclique et aide à étudier mécaniquement leurs effets individuels et combinés. Ce système permet de tester une grande variété de greffes vasculaires d’ingénierie tissulaire (par exemple, origine synthétique ou naturelle, micro-architecture différente, porosités diverses). Pour découpler efficacement l’application de la contrainte de cisaillement et de l’étirement, les concepts clés utilisés par le bioréacteur sont (1) la séparation du contrôle de la contrainte de cisaillement et de l’étirement à l’aide de systèmes de pompage distincts et (2) la stimulation des échafaudages de manière « à l’envers » avec des dimensions pilotées par calcul. L’écoulement est appliqué sur la surface extérieure de l’échafaudage tubulaire à l’utilisation d’une pompe à débit, tandis que l’étirement circonférentiel de l’échafaudage est induit par l’expansion d’un tube en silicone sur lequel l’échafaudage est monté à l’utilisation d’une pompe de contrainte séparée. Les dimensions du tube en silicone et du tube en verre qui contient la construction sont soigneusement choisies et validées à l’aide de simulations computationnelles de la dynamique des fluides, afin de s’assurer que la contrainte de cisaillement sur l’échafaudage (due à l’écoulement) et l’étirement circonférentiel (dû à l’expansion du tube) ne s’affectent pas de manière significative. Cette conception à l’envers a plusieurs justifications pratiques. Si l’étirement est appliqué par la pression du fluide luminal (similaire à la charge physiologique), il nécessite intrinsèquement que le plan d’échantillonnage soit exempt de fuites. De plus, la pression requise pour étirer l’échantillon serait entièrement déterminée par la rigidité de l’échantillon, qui peut varier d’un échantillon à l’autre et à l’intérieur d’un échantillon au fil du temps, ce qui rend difficile le contrôle de l’étirement. Ce bioréacteur monte la greffe de tissu autour d’un tube en silicone et permet l’application de contraintes de cisaillement de la paroi (WSS) sur la paroi externe de la greffe et met la greffe sous pression de l’intérieur. De cette façon, des conditions de charge égales entre les échantillons et à l’intérieur des échantillons au fil du temps peuvent être assurées, et de plus, les échantillons sont autorisés à fuir, comme c’est le cas pour les échafaudages vasculaires poreux19. Ce bioréacteur à l’envers est spécifiquement destiné à des études systématiques sur les effets du cisaillement et / ou de l’étirement, plutôt qu’à l’ingénierie d’un vaisseau sanguin de type natif in vitro, pour lequel les configurations de bioréacteur vasculaire traditionnelles sont plus appropriées. Voir la figure 1A–B pour les dessins de conception du bioréacteur et le tableau 1 correspondant pour une description fonctionnelle et une justification des principaux composants du bioréacteur.
L’utilisation du bioréacteur est démontrée sur la base d’une série d’études récentes de notre groupe dans lesquelles nous avons étudié les influences individuelles et combinées du stress de cisaillement et de l’étirement cyclique sur l’inflammation et la formation de tissus dans des échafaudages électrospunables résorbables pour les tissus cardiovasculaires in situ19,43,44. À cette fin, nous avons utilisé des macrophages humains et des myofibroblastes en monoculture ou en co-culture pour simuler les différentes phases de la cascade régénérative in situ. Nous avons démontré que la sécrétion de cytokines par les macrophages humains est nettement affectée par l’étirement cyclique et la contrainte de cisaillement, affectant le dépôt et l’organisation de la matrice par les myofibroblastes humains dans ces échafaudages, à la fois via la signalisation paracrine et le contact direct19,43,44. Notamment, ces études ont révélé que dans le cas de l’application combinée de contrainte de cisaillement et d’étirement, les effets sur la formation tissulaire et l’inflammation sont soit dominés par l’une des deux charges, soit il existe des effets synergiques des deux charges. Ces résultats illustrent la pertinence du découplage des deux charges pour mieux comprendre la contribution de l’environnement mécanique sur les processus TE. Cette compréhension peut être appliquée pour optimiser systématiquement les paramètres de conception des échafaudages dans les régimes de charge hémodynamique pertinents. En outre, les données mécanistes de ces environnements bien contrôlés peuvent servir d’entrée pour des modèles numériques en cours de développement pour prédire l’évolution du remodelage tissulaire in situ, comme cela a été récemment rapporté pour les TEVG65 ou TEHV66,afin d’améliorer encore la capacité prédictive.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >advanced Dulbecco&#8217;s modified EagleMedium (aDMEM)</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >12491-015</td>
			<td >cell culture medium for fibroblasts</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Aqua Stabil</td>
			<td >Julabo</td>
			<td >8940012</td>
			<td >prevent microorganism growth in bioreactor-hydraulic reservoir</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Bovine fibrinogen</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >F8630</td>
			<td >to prepare fibrinogen gel to seed the cells on the electrospun scaffold</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Bovine thrombin</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >T4648</td>
			<td >to prepare fibrinogen gel to seed the cells on the electrospun scaffold</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Centrifuge</td>
			<td >Eppendorf</td>
			<td >5804</td>
			<td >to spin down cells and conditioned medium</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Clamp scissor - &#34;kelly forceps&#34;</td>
			<td >Almedic</td>
			<td >P-422</td>
			<td >clamp the silicone tubing and apply pre-stretch to the scaffold so the scaffold can be sutured into the engraved groove (autoclave at step 1, step 7)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CO2 cell culture incubators</td>
			<td >Sanyo</td>
			<td >MCO-170AIC-PE</td>
			<td >for cell culturing</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Compressed air reservoir</td>
			<td >Festo</td>
			<td >CRVZS-5</td>
			<td >smoothing air pressure fluctuations and create time delays for pressure build-up</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Custom Matlab script to calculate the maximum stretches</td>
			<td >Matlab</td>
			<td >R2017. The Mathworks, Natick, MA</td>
			<td >calculate the minimum and maximum outer diameter of the electrospun scaffold</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Data acquisition board</td>
			<td >National Instruments</td>
			<td >BNC-2090</td>
			<td >data processing in between amplifier system and computer</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ethanol</td>
			<td >VWR</td>
			<td >VWRK4096-9005</td>
			<td >to keep sterile working conditions</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fetal bovine calf serum (FBS)</td>
			<td >Greiner</td>
			<td >758087</td>
			<td >cell culture medium supplement; serum-supplement</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Flow culture chamber compartments, consisting of a pressure conduit with engraved grooves and small holes to apply pressure on silicone tubing, a screw thread, nose cone, top compartment with flow inlet and bottom compartment flow outlet, adapter bushing</td>
			<td >Custom made, Department of Biomedical Engineering, Eindhoven University of Technology</td>
			<td >n.a.</td>
			<td >flow culture chamber compartments (autoclave at step 1, step 7)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Glass Pasteur pipet</td>
			<td >Assistant</td>
			<td >HE40567002</td>
			<td >apply vacuum on electrospun scaffold (autoclave at step 1)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Glass tubes of the flow culture chamber</td>
			<td >Custon made, Equipment &#38; Prototype Center, Eindhoven University of Technology</td>
			<td >n.a.</td>
			<td >part of the flow culture chamber (clean and store in 70% ethanol, at step 1 and 7)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >GlutaMax</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >35050061</td>
			<td >cell culture medium amino acid supplement, minimizes ammonia build-up</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >High speed camera</td>
			<td >MotionScope</td>
			<td >M-5</td>
			<td >to monitor the stretch during culture; time-lapse photographs of the scaffolds are captured at a frequency of 30 Hz for 6 sec (i.e. 3 stretch cycles)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >High speed camera lens - Micro-NIKKOR 55mm f/2.8 - lens</td>
			<td >Nikon</td>
			<td >JAA616AB</td>
			<td >to monitor the stretch during culture; time-lapse photographs of the scaffolds are captured at a frequency of 30 Hz for 6 sec (i.e. 3 stretch cycles)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hose clip</td>
			<td >ibidi GmbH</td>
			<td >10821</td>
			<td >block medium flow (autoclave at step 1, step 7)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hydraulic reservoir with 8 screw threads for 8 flow culture chambers</td>
			<td >Custom made, Department of Biomedical Engineering, Eindhoven University of Technology</td>
			<td >n.a.</td>
			<td >to apply pressure to the silicone mounted constructs (clean outside with a paper tissue with 70% ethanol, rinse reservoir with 70% ethanol followed by demi water, at step 1 and 7)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ibidi pump system (8x) including ibidi pump, PumpControl software, fluidic unit, perfusion set (medium tubing), air pressure tubing, drying bottles with orange silica beads</td>
			<td >ibidi GmbH</td>
			<td >10902</td>
			<td >set up used to control the flow in the flow culture chambers. Note 1: the ibidi pumps were modified by the manufacturer to enable 200 mbar capacity. Note 2: can be replaced by pump system of other manufacturer, as long as same flow regimes can be applied.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Knives (no.10 sterile blades, individual foil pack) and scalpel handle (stainless steel, individually wrapped)</td>
			<td >Swann Morton</td>
			<td >0301; 0933</td>
			<td >to cut the silicone tubing in the correct size for the scaffold and to cut the suture material</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >LabVIEW Software</td>
			<td >National Instruments</td>
			<td >version 2018</td>
			<td >to control the stretch applied to the scaffolds</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Laminar flow biosafety cabinet with UV light</td>
			<td >Labconco</td>
			<td >302310001</td>
			<td >to ensure sterile working conditions. The UV is used to decontaminate everything that cannot be autoclaved, or touched after autoclaving</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Large and small petri dishes</td>
			<td >Greiner</td>
			<td >664-160</td>
			<td >for sterile working conditions</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >L-ascorbic acid 2-phosphate (vitamin C)</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >A8960</td>
			<td >cell culture medium supplement, important for collagen production</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >LED light cold source KL2500</td>
			<td >Zeiss</td>
			<td >Schott AG</td>
			<td >to aid in visualization for the time lapse of the scaffolds during monitoring of the stretch</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Luer (female and male) locks and connectors, white luer caps</td>
			<td >ibidi GmbH</td>
			<td >various, see (https://ibidi.com/26-flow-accessories)</td>
			<td >to close or connect parts of the bioreactor and the ibidi pump (autoclave at step 1, step 7)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Measuring amplifier (PICAS)</td>
			<td >PEEKEL instruments B.V.</td>
			<td >n.a.</td>
			<td >to amplify the signal from the pressure sensor and feedback to LabView</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Medium reservoir (large syringes 60 mL) and reservoir holders</td>
			<td >ibidi GmbH</td>
			<td >10974</td>
			<td >medium reservoir (autoclave at step 1, step 7)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Medium tubing with 4.25 mm outer diameter and 1 mm inner diameter</td>
			<td >Rubber BV</td>
			<td >1805</td>
			<td >to allow for a larger flow rate, the ibidi medium tubing with larger diameter is used. Note: the part of medium tubing guided through the fluidic unit valves are the same as the default ibidi medium tubing</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Motion Studio Software</td>
			<td >Idtvision</td>
			<td >2.15.00</td>
			<td >to make the high speed time lapse images for stretch monitoring</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Needle (19G)</td>
			<td >BD Microlance</td>
			<td >301700</td>
			<td >together with thin flexible tubing used to fill the hydraulic reservoir with ultrapure water without adding air bubbles</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Needle driver</td>
			<td >Adson</td>
			<td >2429218</td>
			<td >to handle the needle of the nylon suture through the silicone tube (autoclave at step 1, step 7)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Paper tissues</td>
			<td >Kleenex</td>
			<td >38044001</td>
			<td >for cleaning of the equipment with 70% ethanol</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Parafilm</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >P7793-1EA</td>
			<td >quick fix if leakage occurs</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Penicillin/streptomycin (P/S)</td>
			<td >Lonza</td>
			<td >DE17-602E</td>
			<td >cell culture medium supplement; prevent bacterial contamination</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >P4417-100TAB</td>
			<td >for storage and washing steps (autoclave at step 1)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Plastic containers (60 mL) with red screw caps</td>
			<td >Greiner</td>
			<td >206202</td>
			<td >to prepare the fibrinogen solution</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pneumatic cylinder</td>
			<td >Festo</td>
			<td >AEVC-20-10-I-P</td>
			<td >to actuate the Teflon bellow (clean with a paper tissue with 70% ethanol at step 1 and 7)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Polycaprolactone bisurea (PCL-BU) tubular scaffolds (3 mm inner diameter, 200 &#181;m wall thickness, 20 mm length)</td>
			<td >SyMO-Chem, Eindhoven, The Netherlands</td>
			<td >n.a.</td>
			<td >produced using electrospinning from 15% (w/w) chloroform (Sigma; 372978) polymer solutions. See Van Haaften et al Tissue Engineering Part C (2018) for more details</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pressure conduit without holes (for static control)</td>
			<td >Custom made, Department of Biomedical Engineering, Eindhoven University of Technology</td>
			<td >n.a.</td>
			<td >to mount electrospun tubes on silicon tubing (autoclave at step 1, step 7)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pressure sensor and transducer</td>
			<td >BD</td>
			<td >TC-XX and P 10 EZ</td>
			<td >the air pressure going to the pneumatic actuated pump is raised until it reaches the set pressure</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Proportional air pressure control valve and pressure sensor</td>
			<td >Festo</td>
			<td >MPPES-3-1/8-2-010, 159596</td>
			<td >provides compressed air to the pneumatic actuated pump</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI-1640)</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >A1049101</td>
			<td >cell culture medium for monocyte/macrophage</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Safe lock Eppendorf tubes (1.5 mL)</td>
			<td >Eppendorf</td>
			<td >30120086</td>
			<td >multiple applications (autoclave at step 1)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sodium dodecyl sulfate solution 20%</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >5030</td>
			<td >Used to clean materials, at a concentration of 0.1%.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Silicone O-rings</td>
			<td >Technirub</td>
			<td >1250S</td>
			<td >to prevent leakage (autoclave at step 1, step 7)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Silicone tubing (2.8 mm outer diameter, 400 um wall thickness)</td>
			<td >Rubber BV</td>
			<td >1805</td>
			<td >to mount the electrospun tubes on the pressure conduits (autoclave at step 1)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sterile tube (15 mL)</td>
			<td >Falcon</td>
			<td >352095</td>
			<td >multiple applications</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Suture, 5-0 prolene with pre-attached taper point needle</td>
			<td >Ethicon, Johnson&#38;Johnson</td>
			<td >EH7404H</td>
			<td >Prolene suture wire 5-0 (75cm length, TF taper point needle, 1/2 circle, 13 mm needle length)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Syringe (24 mL)</td>
			<td >B. Braun Melsungen AG</td>
			<td >2057932</td>
			<td >to add the ultrapure water or medium to the hydraulic reservoir or flow culture chamber</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Syringe filter (0.2 &#181;m)</td>
			<td >Satorius</td>
			<td >17597-K</td>
			<td >to filter the fibrinogen solution</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >T150 cell culture flask with filter cap</td>
			<td >Nunc</td>
			<td >178983</td>
			<td >to degas culture medium</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >T75 Cell culture flask with filter cap</td>
			<td >Nunc</td>
			<td >156499</td>
			<td >to culture static control samples</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Teflon bellow</td>
			<td >Custom made, Department of Biomedical Engineering, Eindhoven University of Technology</td>
			<td >n.a.</td>
			<td >to load the hydraulic reservoir (clean outside with a paper tissue with 70% ethanol at step 1 and 7)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tray (stainless steel)</td>
			<td >PolarWare</td>
			<td >15-248</td>
			<td >for easy transport of the fluidic culture chambers and the bioreactor from incubator to laminar flow cabinet and back (clean with a paper tissue with 70% ethanol before and after use)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tweezers</td>
			<td >Wironit</td>
			<td >4910</td>
			<td >sterile handling of individual parts (autoclave at step 1 and 7)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ultrapure water</td>
			<td >Stakpure</td>
			<td >Omniapure UV 18200002</td>
			<td >to correct for medium evaporation, mixed with aqua stabil mixed and used as hydraulic fluid. (autoclave ultrapure water at step 1)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >UV light</td>
			<td >Philips</td>
			<td >TUV 30W/G30 T8</td>
			<td >for decontamination of grafts and bioreactor parts before seeding</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a multi-cue bioreactor to evaluate the inflammatory and regenerative capacity of biomaterials under flow and stretch

L’utilisation de biomatériaux résorbables pour induire la régénération directement dans le corps est une stratégie attrayante d’un point de vue translationnel. Ces matériaux induisent une réponse inflammatoire lors de l’implantation, qui est le moteur de la résorption ultérieure du matériau et de la régénération de nouveaux tissus. Cette stratégie, également connue sous le nom d’ingénierie tissulaire in situ, est poursuivie pour obtenir des remplacements cardiovasculaires tels que des greffes vasculaires modifiées par des tissus. Les processus inflammatoires et régénératifs sont déterminés par les signaux biomécaniques locaux sur l’échafaudage (c.-à-d. contrainte d’étirement et de cisaillement). Ici, nous décrivons en détail l’utilisation d’un bioréacteur développé sur mesure qui permet de manière unique le découplage de la contrainte d’étirement et de cisaillement sur un échafaudage tubulaire. Cela permet l’évaluation systématique et standardisée de la capacité inflammatoire et régénératrice des échafaudages tubulaires sous l’influence de charges mécaniques bien contrôlées, que nous démontrons sur la base d’une expérience de co-culture dynamique utilisant des macrophages et des myofibroblastes humains. Les principales étapes pratiques de cette approche – la construction et la mise en place du bioréacteur, la préparation des échafaudages et de l’ensemencement des cellules, l’application et le maintien de l’écoulement d’étirement et de cisaillement, et la récolte d’échantillons pour analyse – sont discutées en détail.

Ce bioréacteur a été développé pour étudier les effets individuels et combinés du stress de cisaillement et de l’étirement cyclique sur la croissance et le remodelage des tissus vasculaires dans les échafaudages de biomatériaux 3D. La conception du bioréacteur permet de cultiver jusqu’à huit constructions vasculaires dans diverses conditions de charge(Figure 1A). Les constructions vasculaires sont positionnées dans une chambre de culture en flux(Figure 1...

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A Multi-Cue Bioreactor to Evaluate the Inflammatory and Regenerative Capacity of Biomaterials under Flow and Stretch

L’objectif de ce protocole est d’exécuter une co-culture dynamique de macrophages humains et de myofibroblastes dans des échafaudages tubulaires électrospunés pour étudier la régénération tissulaire entraînée par les matériaux, à l’aide d’un bioréacteur qui permet le découplage de la contrainte de cisaillement et de l’étirement cyclique.

Un bioréacteur multi-cue pour évaluer la capacité inflammatoire et régénératrice des biomatériaux sous écoulement et étirement

The use of resorbable biomaterials to induce regeneration directly in the body is an attractive strategy from a translational perspective. Such materials ...

So far, it has been really difficult to identify the cause and effect relationships between hemodynamics and vascular tissue regeneration. And this has because it's challenging to control the individual mechanical loads. This bioreactor enables us to mechanistically investigate the individual and combined effects of sheer stress and cyclic stretch on the regenerative potential of a broad variety of tissue engineered vascular grafts.Demonstrating this procedure will be Suzanne Koch, a PhD candidate in our group. And Dr.Tamar Wissing who is a postdoctoral researcher from our laboratory. To mount the electro spun scaffold onto the silicone tubing, thread a 4-0 prolene suture into one end of a piece of silicone tubing and out of the other.Make a small knot on both sides of the tube leaving approximately 10 centimeters of wire on both knots and make a third knot on top of the two. After removing a suture needle, trim the edges of the silicone tubing into a triangular shape and make a final knot at the end of the two 10 centimeter wires. Dip the electro spun scaffold in 30%ethanol and place the scaffold over one end of free suture wire.Next, gently stretch both sides of the silicone tubing and the 10 centimeter suture knot while second researcher uses tweezers with a smooth inner tip to gently slide the electro spun scaffold over the tubing. Slowly release the stretch on the silicone tubing while simultaneously smoothing the electro spun scaffold with the tweezers. And dip the scaffold and silicone tubing in ultra pure water two times.Construct the bottom compartment and make sure that the O-ring is properly placed. Place an adaptor bushing in the upper part of the bottom compartment and place the pressure conduit with holes through the bottom compartment. Lace the silicone O-ring around the lower end of the pressure conduit to prevent leakage.And screw the lower part of the bottom compartment to the upper part of the bottom compartment to secure the pressure conduit. Make sure that the lower engraved groove of the pressure conduit is approximately three to five millimeters above the edge of the adapter bushing of the bottom compartment. Pull the silicone tube with the electro spun scaffold over the pressure conduit and make a nod and the suture wire at the lower end of the electro spun scaffold, at the location of the engraved groove on the pressure conduit.Make a second nod at the opposite side to tightly secure the silicone tubing with the electro spun graft. And placing a scissor clamp equipped with a rule at the upper end of the silicone tubing, pull the scissor clamp upwards in a consistent manner and gently pull on the electric spawn scaffold to remove any wrinkles. Use a suture wire to make two knots at both ends of the scaffold at the upper engraved groove of the pressure conduit.When both knots have been made, release the scissor clamp and use a knife to remove any excess silicone tubing. Screw the nose cones on the screw thread of the pressure conduits for the samples that will be dynamically loaded. Dip the pressure conduit, tubing, and scaffold one time in 30%ethanol and two times in ultrapure water to pre-wet the setup.Place the glass tube over the pressure conduit and push gently on the bottom compartment to secure the glass tube in place. Then place the flow straightener, a silicone O-ring, and adapter bushing in the top compartment. And secure the compartment over the open end of the glass tube.Remove the male lure plug from the flow outlet, work in a sterile laminar flow cabinet. Open the white lure cap and place an ethanol soak tissue in front of the flow outlet. Deconstruct the flow culture chamber by taking off the glass tube with the top compartment.Place a vacuum pasture pipe add onto the electro spun scaffold to remove as much medium as possible. And add fibrinogen solution at a one-to-one ratio with the thrombin supplemented cell suspension. Pipette the solution up and down one time and immediately drip the solution over the full length of the scaffold.When all of the cells have been delivered, slowly move the scaffold from left to right and up and down to achieve an even distribution of the cells. When both sides of the scaffold have been seeded, carefully reconstruct the flow culture chamber by putting the glass tube and top compartment back. And place the flow culture chamber into the incubator to let the fiber solidify.To couple the bioreactor to the pump system, place the flow culture chamber on one of the eight screw threads on the bioreactor base. And place a host clip on the medium tubing. Remove the white lure cap, covering the flow inlet of the top compartment of the flow culture chamber and remove the female lure coupler of the medium tubing.Connect the medium tubing with one side of the flow inlet on the top compartment. And the other side with the flow outlet at the bottom compartment. Transfer the complete setup from the laminar flow cabinet to the incubator.And connect a fluidic units and the bioreactor base to the air pressure tubing and electric cable. Start the software and initialize the pumps. Start the medium flow for the samples one by one.Then change the strain pump parameters to the desired settings and start the strain. Monitor the stretch applied to the scaffold every other day. The monitoring of stretch and wall shear stress over longterm culture periods shows that these values can be maintained at relatively constant levels over a period of up to 20 days.After three days of hemodynamic loading, immunofluorescent staining reveals a homogenous distribution of monocyte derived macrophages and myofibroblasts throughout the scaffold. After 20 days of co-culture, cyclic stretch results in the deposition of more numerous and thicker collagen type 1 fibers. While in the combined hemodynamic load group, the cyclic stretch effect is overruled by sheer stress resulting in a less pronounced collagen type 1 deposition.After eight days of macrophage monoculture, fiber erosion and fiber cleavage are observed in all of the hemodynamic loading regimes with the most pronounced resorption observed in the static group, and the least pronounced resorption observed in the sheer stress group. Both cyclic stretch and a sheer stress impact the cytokine secretion profile of the co-culture setup. Interestingly, the combined effects of both loads show either dominance of one of the two loads or synergistic effects of both loads.Co-culture experiments also show that the mechanical environment and resulting loading dependent inflammatory environments modulate the phenotype of the myofibroblasts. Furthermore, the gene expression patterns of contractile marker alpha smooth muscle actin correlate with protein synthesis. The most important thing when performing this protocol is that's what the application of stretch, it's essential that your setup is leak-free.

Research

JoVE Journal

Engineering

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A new small-angle neutron scattering (SANS) sample environment optimized for studying the microstructure of complex fluids under simple shear flow is ...

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Conception et utilisation d&#39;un système d&#39;échantillonnage plein débit (FFS) pour la quantification des émissions de méthane

The use of natural gas continues to grow with increased discovery and production of unconventional shale resources. At the same time, the natural gas ...

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Thermoplastic microfluidic devices offer many advantages over those made from silicone elastomers, but bonding procedures must be developed for each ...

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Scanning Light Scattering Profiler (SLPS) Based Methodology to Quantitatively Evaluate Forward and Backward Light Scattering from Intraocular Lenses

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The scanning light scattering profiler (SLSP) methodology has been developed for the full-angle quantitative evaluation of forward and backward light ...

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