Name: a multi-cue bioreactor to evaluate the inflammatory and regenerative capacity of biomaterials under flow and stretch
Uploaded: 2020-12-10T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Multi-Cue Bioreactor to Evaluate the Inflammatory and Regenerative Capacity of Biomaterials under Flow and Stretch at JoVE.com

이 연구는 LSH 2Treat 프로그램 (436001003)과 네덜란드 신장 재단 (14a2d507)의 일환으로 ZonMw에 의해 재정적으로 지원됩니다. N.A.K.는 유럽 연구 위원회 (851960)의 지원을 인정합니다. 네덜란드 과학연구기구(024.003.013)가 후원한 중력프로그램 '재료 중심재생'을 감사하게 인정합니다.

이 프로토콜에 설명된 연구에서, 관상 동맥 바이패스 수술 후 사페누스 정맥으로부터 분리된 말초 혈액 버피 코트와 인간 근섬유아세포로부터 분리된 1차 인간 대식세포가44개사용되었다. 버피 코트는 산퀸 연구 기관 의료 윤리위원회의 승인을 받은 서면 동의를 제공한 건강하고 익명화된 자원봉사자들로부터 얻어졌습니다. 인간의 베나 사페나 세포의 사용 (HVSC) 네덜란드에서 ?...

본 명세서에 기재된 생물반응기는 관내 반사성 스캐폴드에서 염증 및 조직 재생에 대한 전단 스트레스 및 순환 스트레칭의 개별 및 결합된 효과의 기여도를 체계적으로 평가할 수 있다. 또한 이 방법을 사용하면 대표적인 결과 섹션에서 예시된 바와 같이 혈관 구조에서 다양한 분석을 수행할 수 있습니다. 이러한 결과는 TEVG 구조의 성장과 리모델링 모두에 다양한 혈역학 적재 체제(즉, 전단및 스?...

심혈관 조직 공학(TE)은 현재 사용되는 영구 심혈관 보철물(예를 들어, 혈관 이식, 심장 판막 교체)에 대한 대체 치료 옵션으로 추구되고 있으며, 이는 환자의 큰 코호트에 대해 최적이 아니다1,2,3,4. 많은 수요가 응용 프로그램은 조직 엔지니어링 혈관 이식편 (TEVGs)5,6 및 심장 판막 (TEHV)7,8을포함한다. 대부분의 경우, 심장 혈관 TE 방법론은 새로운 조직이 형성될 수 있는 유익한 발판역할을 하는 개역 가능한 생체 재료(천연 또는 합성)를 사용합니다. 새로운 조직의 형성은 체외에서 완전히 설계될 수 있으며, 세포와 함께 스캐폴드를 시드하고 이식 전에 생체 반응기에서 배양하여(체외TE)9,10,11,또는 직접 앉아서 합성 스캐폴드가 체내에서 직접 새로운 조직의 형성을 유도하기 위해 사전 배양없이 이식된다( 12) 1,12. 시험관 내 및 시투 심혈관 TE 접근법의 경우 성공적인 기능성 재생은 이식된 구조에 대한 숙주 면역 반응과 적절한 생체 기계적 적재모두에 크게 의존합니다.
심혈관 TE용 생체역학적 하중의 중요성은15. 심혈관 임플란트의 경우, 스캐폴드를 채우는 세포는 혈역학적 환경의 결과로 발생하는 순환 스트레칭및 전단 응력에 노출됩니다. 수많은 연구는 콜라겐16,17,18,19,글리코소미노글리산 (GAGs)20,및 엘라스틴(21,22)및 다양한 세포 유형에 의해 매트릭스 성분의 형성에 (순환) 스트레칭의 자극 효과를보고했다. 예를 들어, 황 외는 혈관생물반응기(23)를이용하여 체외 TEVG에서 콜라겐 및 엘라스틴의 증착 및 조직을 상승시키는 양축 스트레칭을 입증했다. 강조는 일반적으로 지배적 인 부하로 스트레칭에 놓여 있지만, 이러한 연구는 종종 샘플이 전단 흐름에 노출되는 흐름 중심의 생물 반응기를 사용합니다. 3D의 조직 형성과 염증에 대한 전단 응력의 고립 된 영향에 대해서는 상대적으로 거의 알려져 없지만 일부 데이터를 사용할 수 있습니다. 예를 들어, Hinderer 외. 및 Eoh 외. 전단 흐름, 3D 스캐폴드 미세 구조 이외에, 체외 모델시스템(24,25)에서인체 혈관 평활근 세포에 의한 성숙한 엘라스틴형성에 중요했다. 전부, 이 사실 인정은 심장 혈관 TE를 위한 순환 스트레칭 및 전단 긴장 둘 다의 관련성을 보여줍니다.
TE 임플란트의 성공 또는 실패에 대한 또 다른 중요한 결정요인은 이식된접목(26)에대한 호스트의 면역 반응이다. 이는 실제로 세포 유입 및 내인성 조직 형성 및 리모델링27의후속 과정을 킥스타트하기 위해 스캐폴드에 대한 급성 염증 반응에 의존하는 시투 TE 전략에서 물질 중심의 물질 중심의 물질 중심을 위해 특히 중요하다. 대식세포는 기능성 조직 재생의 중요한 시노레이터이며, 이는 다중 연구28,29,30에의해 나타났다. 상처 치유와 유사하게, 조직의 재생은 섬유아세포와 근섬유세포 와 같은 대식세포와 조직 생성 세포 사이의 파라크리노 신호에 의해 지배된다31,32,33. 새로운 조직 증착을 조정하는 것 외에도, 대식세포는이물질(34,35)의활성 재흡수에 관여한다. 이와 같이, 생체물질에 대한 체외 대식세포반응은임플란트(36,37,38)의생체 내 성공을 위한 예측 파라미터로서 확인되었다.
이식된 스캐폴드에 대한 대식대식 반응은 재료 조성 및미세구조(35,39,40)와같은 스캐폴드 설계 기능에 의존한다. 스캐폴드 특성 외에도 비계에 대한 대식대식 반응과 근섬유아세포와의 교차토크도 혈역학적 하중의 영향을 받았습니다. 예를 들어, 순환 스트레치는 대식세포 표현형41,42,43,44 및 사이토카인의 분비(43,44,45,46in 3D 일렉트로스펀 스캐폴드)의 중요한 변조기로 나타났다. 대식세포와 혈관 평활근 세포의 공동 배양 시스템을 사용하여, Battiston 등. 대식세포의 존재는 엘라스틴과 GAGs의 증가 수준으로 이어졌고 순환 스트레치 (1.07-1.10)의 적당한 수준이 콜라겐 I와 엘라스틴47의증착을 자극했다는 것을 입증했습니다. 전작에서는 전단 응력이 3D 전두엽 비계48,49로단백세포 모집을 위한 중요한 결정제이며, 전단 응력과 순환 스트레치 모두 인간 단세포와 중간엽 기질세포(50)사이의 파라크리온 신호에 영향을 미친다는 것을 입증하였다. Fahy 등은 전단 흐름이 인간단핵구(51)에의한 염증성 사이토카인의 분비를 증가시키는 것을 입증했다.
종합하면, 위의 증거는 혈역학 적재에 대한 적절한 이해와 제어가 심혈관 TE에 매우 중요하며 이를 달성하기 위해 염증 반응을 고려하는 것이 중요하다는 것을 보여줍니다. 수많은 생물 반응기는 이전에 시험관 내52,53,54,55, 56,57,57,58 또는 전 생체59,60,61 심혈관 조직의 문화를 위해 이전에 기술되었다. 그러나 이러한 모든 시스템은 가능한 한 생리적 혈역학 적재 조건을 모방하도록 설계되었습니다. 이것은 시험관 내에서 심장 혈관 조직을 만들거나 전 생체 문화를 유지하기위한 목적으로 매우 가치가 있지만, 이러한 시스템은 개별 단서의 개별 효과에 체계적인 연구를 허용하지 않습니다. 이는 이러한 생물 반응기에서 순환 스트레칭과 전단 응력의 적용이 본질적으로 연결되는 동일한 가압 흐름에 의해 구동되므로. 정확한 멀티큐 기계식 조작을 허용하는 마이크로시스템은 2D 기판62 또는 3D 하이드로겔 설정63,64에대해 설명되어 왔지만, 이러한 설정은 탄성액 3D 생물재료 스캐폴드의 통합을 허용하지 않는다.
여기에서, 우리는 유일하게 전단 응력과 순환 스트레칭의 분리를 가능하게하고 기계적으로 그들의 개별및 결합된 효력을 조사하는 것을 돕는 관 생물 반응기 시스템의 응용을 제시합니다. 이 시스템은 조직 설계 혈관 이식의 광범위한 테스트를 허용 (예를 들어, 합성 또는 자연 기원, 다른 마이크로 아키텍처, 다양한 다공성). 전단 응력과 스트레치의 적용을 효과적으로 분리하기 위해, 생체 반응기에서 사용하는 주요 개념은 (1) 뚜렷한 펌프 시스템을 사용하여 전단 응력 및 스트레치 제어의 분리와 (2) 스캐폴드의 자극을 계산 구동 치수로 '내부 아웃'방식으로 분리하는 것이다. 흐름은 유동 펌프의 사용을 통해 관 비계의 외부 표면에 적용되는 반면, 스캐폴드의 일주 스트레칭은 별도의 스트레인 펌프를 사용하여 스캐폴드가 장착되는 실리콘 튜브를 확장하여 유도된다. 구성을 포함하는 실리콘 튜브및 유리 튜브의 치수는 스캐폴드(흐름에 의한) 및 외주 스트레치(튜브 팽창로 인한)의 전단 응력이 서로 크게 영향을 미치지 않도록 하기 위해 전산 유체 역학 시뮬레이션을 사용하여 신중하게 선택및 검증된다. 이 내부 아웃 디자인은 몇 가지 실용적인 근거가 있습니다. 발광 유체 압력(생리적 적재와 유사)에 의해 스트레치가 적용되는 경우, 본질적으로 샘플 설계가 누출되지 않습니다. 또한, 시료를 스트레칭하는 데 필요한 압력은 시료 강성에 의해 완전히 결정되며, 이는 시간이 지남에 따라 샘플과 샘플 내에서 다를 수 있어 스트레치를 제어하기가 어려워집니다. 이 생물 반응기는 실리콘 튜브 주위에 조직 설계 이식편을 장착하고 접목의 외벽에 벽 전단 응력 (WSS) 응용 프로그램을 허용하고 내부에서 접목을 가압합니다. 이러한 방식으로, 시간이 지남에 따라 샘플과 샘플 내의 동일한 하중 조건을 보장할 수 있으며, 또한, 다공성 혈관비계(19)에공통적으로 도공되는 바와 같이 시료가 새는 것을 허용한다. 이 내부 아웃 생물 반응기는 특히 전통적인 혈관 생물 반응기 설치가 더 적합한 시험관 내의 토착 혈관의 엔지니어링보다는 전단 및 / 또는 스트레치의 효과에 대한 체계적인 연구를 위한 것입니다. 생물 반응기 설계 도면에대한 그림 1A-B를 참조하고, 생체 반응기의 주요 구성 요소 뒤에 기능적 설명 및 근거에 대한 해당 표 1을 참조하십시오.
생물 반응기의 사용은 우리가 시상 심혈 관 조직19,43,44에대한 반사 전기 스프폴드에서 염증과 조직 형성에 전단 스트레스와 순환 스트레칭의 개인 및 결합 된 영향을 조사하는 우리 그룹에 의해 최근 연구의 시리즈에 기초하여 입증된다. 이를 위해, 우리는 인간 대식세포와 근섬유아세포를 모노 또는 공동 배양에서 사용하여 시투 재생 폭포의 다양한 단계를 시뮬레이션했습니다. 우리는 인간 대식세포에 의한 사이토카인 분비액이 이러한 비계에서 인간 근섬유세포에 의해 매트릭스 증착 및 조직에 영향을 미치는 순환 스트레치 및 전단 응력 모두에 의해 뚜렷하게 영향을 받는것을 입증했으며, 파라크리노 신호 및 직접 접촉19,43,44를통해. 특히, 이러한 연구는 전단 스트레스와 스트레칭의 결합 된 응용 프로그램의 경우, 조직 형성과 염증에 미치는 영향은 두 부하 중 하나에 의해 지배된다는 것을 밝혔다, 또는 두 부하의 시너지 효과가있다. 이러한 연구 결과는 TE 공정에서 기계적 환경의 기여를 더 잘 이해하기 위해 두 부하를 분리하는 관련성을 보여줍니다. 이러한 이해는 관련 혈역학 적재 기조에서 스캐폴드 설계 파라미터를 체계적으로 최적화하기 위해 적용될 수 있습니다. 또한, 이러한 잘 조절된 환경에서 의 기계형 데이터는 최근 TEVGs65 또는 TEHV66에대해 보고된 바와 같이, 시투 조직 리모델링 과정을 예측하기 위해 개발되고 있는 수치 모델에 대한 입력으로 작용할 수 있으며, 예측 능력을 더욱 향상시킨다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >advanced Dulbecco&#8217;s modified EagleMedium (aDMEM)</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >12491-015</td>
			<td >cell culture medium for fibroblasts</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Aqua Stabil</td>
			<td >Julabo</td>
			<td >8940012</td>
			<td >prevent microorganism growth in bioreactor-hydraulic reservoir</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Bovine fibrinogen</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >F8630</td>
			<td >to prepare fibrinogen gel to seed the cells on the electrospun scaffold</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Bovine thrombin</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >T4648</td>
			<td >to prepare fibrinogen gel to seed the cells on the electrospun scaffold</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Centrifuge</td>
			<td >Eppendorf</td>
			<td >5804</td>
			<td >to spin down cells and conditioned medium</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Clamp scissor - &#34;kelly forceps&#34;</td>
			<td >Almedic</td>
			<td >P-422</td>
			<td >clamp the silicone tubing and apply pre-stretch to the scaffold so the scaffold can be sutured into the engraved groove (autoclave at step 1, step 7)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CO2 cell culture incubators</td>
			<td >Sanyo</td>
			<td >MCO-170AIC-PE</td>
			<td >for cell culturing</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Compressed air reservoir</td>
			<td >Festo</td>
			<td >CRVZS-5</td>
			<td >smoothing air pressure fluctuations and create time delays for pressure build-up</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Custom Matlab script to calculate the maximum stretches</td>
			<td >Matlab</td>
			<td >R2017. The Mathworks, Natick, MA</td>
			<td >calculate the minimum and maximum outer diameter of the electrospun scaffold</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Data acquisition board</td>
			<td >National Instruments</td>
			<td >BNC-2090</td>
			<td >data processing in between amplifier system and computer</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ethanol</td>
			<td >VWR</td>
			<td >VWRK4096-9005</td>
			<td >to keep sterile working conditions</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fetal bovine calf serum (FBS)</td>
			<td >Greiner</td>
			<td >758087</td>
			<td >cell culture medium supplement; serum-supplement</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Flow culture chamber compartments, consisting of a pressure conduit with engraved grooves and small holes to apply pressure on silicone tubing, a screw thread, nose cone, top compartment with flow inlet and bottom compartment flow outlet, adapter bushing</td>
			<td >Custom made, Department of Biomedical Engineering, Eindhoven University of Technology</td>
			<td >n.a.</td>
			<td >flow culture chamber compartments (autoclave at step 1, step 7)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Glass Pasteur pipet</td>
			<td >Assistant</td>
			<td >HE40567002</td>
			<td >apply vacuum on electrospun scaffold (autoclave at step 1)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Glass tubes of the flow culture chamber</td>
			<td >Custon made, Equipment &#38; Prototype Center, Eindhoven University of Technology</td>
			<td >n.a.</td>
			<td >part of the flow culture chamber (clean and store in 70% ethanol, at step 1 and 7)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >GlutaMax</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >35050061</td>
			<td >cell culture medium amino acid supplement, minimizes ammonia build-up</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >High speed camera</td>
			<td >MotionScope</td>
			<td >M-5</td>
			<td >to monitor the stretch during culture; time-lapse photographs of the scaffolds are captured at a frequency of 30 Hz for 6 sec (i.e. 3 stretch cycles)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >High speed camera lens - Micro-NIKKOR 55mm f/2.8 - lens</td>
			<td >Nikon</td>
			<td >JAA616AB</td>
			<td >to monitor the stretch during culture; time-lapse photographs of the scaffolds are captured at a frequency of 30 Hz for 6 sec (i.e. 3 stretch cycles)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hose clip</td>
			<td >ibidi GmbH</td>
			<td >10821</td>
			<td >block medium flow (autoclave at step 1, step 7)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hydraulic reservoir with 8 screw threads for 8 flow culture chambers</td>
			<td >Custom made, Department of Biomedical Engineering, Eindhoven University of Technology</td>
			<td >n.a.</td>
			<td >to apply pressure to the silicone mounted constructs (clean outside with a paper tissue with 70% ethanol, rinse reservoir with 70% ethanol followed by demi water, at step 1 and 7)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ibidi pump system (8x) including ibidi pump, PumpControl software, fluidic unit, perfusion set (medium tubing), air pressure tubing, drying bottles with orange silica beads</td>
			<td >ibidi GmbH</td>
			<td >10902</td>
			<td >set up used to control the flow in the flow culture chambers. Note 1: the ibidi pumps were modified by the manufacturer to enable 200 mbar capacity. Note 2: can be replaced by pump system of other manufacturer, as long as same flow regimes can be applied.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Knives (no.10 sterile blades, individual foil pack) and scalpel handle (stainless steel, individually wrapped)</td>
			<td >Swann Morton</td>
			<td >0301; 0933</td>
			<td >to cut the silicone tubing in the correct size for the scaffold and to cut the suture material</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >LabVIEW Software</td>
			<td >National Instruments</td>
			<td >version 2018</td>
			<td >to control the stretch applied to the scaffolds</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Laminar flow biosafety cabinet with UV light</td>
			<td >Labconco</td>
			<td >302310001</td>
			<td >to ensure sterile working conditions. The UV is used to decontaminate everything that cannot be autoclaved, or touched after autoclaving</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Large and small petri dishes</td>
			<td >Greiner</td>
			<td >664-160</td>
			<td >for sterile working conditions</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >L-ascorbic acid 2-phosphate (vitamin C)</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >A8960</td>
			<td >cell culture medium supplement, important for collagen production</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >LED light cold source KL2500</td>
			<td >Zeiss</td>
			<td >Schott AG</td>
			<td >to aid in visualization for the time lapse of the scaffolds during monitoring of the stretch</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Luer (female and male) locks and connectors, white luer caps</td>
			<td >ibidi GmbH</td>
			<td >various, see (https://ibidi.com/26-flow-accessories)</td>
			<td >to close or connect parts of the bioreactor and the ibidi pump (autoclave at step 1, step 7)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Measuring amplifier (PICAS)</td>
			<td >PEEKEL instruments B.V.</td>
			<td >n.a.</td>
			<td >to amplify the signal from the pressure sensor and feedback to LabView</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Medium reservoir (large syringes 60 mL) and reservoir holders</td>
			<td >ibidi GmbH</td>
			<td >10974</td>
			<td >medium reservoir (autoclave at step 1, step 7)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Medium tubing with 4.25 mm outer diameter and 1 mm inner diameter</td>
			<td >Rubber BV</td>
			<td >1805</td>
			<td >to allow for a larger flow rate, the ibidi medium tubing with larger diameter is used. Note: the part of medium tubing guided through the fluidic unit valves are the same as the default ibidi medium tubing</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Motion Studio Software</td>
			<td >Idtvision</td>
			<td >2.15.00</td>
			<td >to make the high speed time lapse images for stretch monitoring</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Needle (19G)</td>
			<td >BD Microlance</td>
			<td >301700</td>
			<td >together with thin flexible tubing used to fill the hydraulic reservoir with ultrapure water without adding air bubbles</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Needle driver</td>
			<td >Adson</td>
			<td >2429218</td>
			<td >to handle the needle of the nylon suture through the silicone tube (autoclave at step 1, step 7)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Paper tissues</td>
			<td >Kleenex</td>
			<td >38044001</td>
			<td >for cleaning of the equipment with 70% ethanol</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Parafilm</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >P7793-1EA</td>
			<td >quick fix if leakage occurs</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Penicillin/streptomycin (P/S)</td>
			<td >Lonza</td>
			<td >DE17-602E</td>
			<td >cell culture medium supplement; prevent bacterial contamination</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >P4417-100TAB</td>
			<td >for storage and washing steps (autoclave at step 1)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Plastic containers (60 mL) with red screw caps</td>
			<td >Greiner</td>
			<td >206202</td>
			<td >to prepare the fibrinogen solution</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pneumatic cylinder</td>
			<td >Festo</td>
			<td >AEVC-20-10-I-P</td>
			<td >to actuate the Teflon bellow (clean with a paper tissue with 70% ethanol at step 1 and 7)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Polycaprolactone bisurea (PCL-BU) tubular scaffolds (3 mm inner diameter, 200 &#181;m wall thickness, 20 mm length)</td>
			<td >SyMO-Chem, Eindhoven, The Netherlands</td>
			<td >n.a.</td>
			<td >produced using electrospinning from 15% (w/w) chloroform (Sigma; 372978) polymer solutions. See Van Haaften et al Tissue Engineering Part C (2018) for more details</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pressure conduit without holes (for static control)</td>
			<td >Custom made, Department of Biomedical Engineering, Eindhoven University of Technology</td>
			<td >n.a.</td>
			<td >to mount electrospun tubes on silicon tubing (autoclave at step 1, step 7)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pressure sensor and transducer</td>
			<td >BD</td>
			<td >TC-XX and P 10 EZ</td>
			<td >the air pressure going to the pneumatic actuated pump is raised until it reaches the set pressure</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Proportional air pressure control valve and pressure sensor</td>
			<td >Festo</td>
			<td >MPPES-3-1/8-2-010, 159596</td>
			<td >provides compressed air to the pneumatic actuated pump</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI-1640)</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >A1049101</td>
			<td >cell culture medium for monocyte/macrophage</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Safe lock Eppendorf tubes (1.5 mL)</td>
			<td >Eppendorf</td>
			<td >30120086</td>
			<td >multiple applications (autoclave at step 1)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sodium dodecyl sulfate solution 20%</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >5030</td>
			<td >Used to clean materials, at a concentration of 0.1%.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Silicone O-rings</td>
			<td >Technirub</td>
			<td >1250S</td>
			<td >to prevent leakage (autoclave at step 1, step 7)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Silicone tubing (2.8 mm outer diameter, 400 um wall thickness)</td>
			<td >Rubber BV</td>
			<td >1805</td>
			<td >to mount the electrospun tubes on the pressure conduits (autoclave at step 1)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sterile tube (15 mL)</td>
			<td >Falcon</td>
			<td >352095</td>
			<td >multiple applications</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Suture, 5-0 prolene with pre-attached taper point needle</td>
			<td >Ethicon, Johnson&#38;Johnson</td>
			<td >EH7404H</td>
			<td >Prolene suture wire 5-0 (75cm length, TF taper point needle, 1/2 circle, 13 mm needle length)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Syringe (24 mL)</td>
			<td >B. Braun Melsungen AG</td>
			<td >2057932</td>
			<td >to add the ultrapure water or medium to the hydraulic reservoir or flow culture chamber</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Syringe filter (0.2 &#181;m)</td>
			<td >Satorius</td>
			<td >17597-K</td>
			<td >to filter the fibrinogen solution</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >T150 cell culture flask with filter cap</td>
			<td >Nunc</td>
			<td >178983</td>
			<td >to degas culture medium</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >T75 Cell culture flask with filter cap</td>
			<td >Nunc</td>
			<td >156499</td>
			<td >to culture static control samples</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Teflon bellow</td>
			<td >Custom made, Department of Biomedical Engineering, Eindhoven University of Technology</td>
			<td >n.a.</td>
			<td >to load the hydraulic reservoir (clean outside with a paper tissue with 70% ethanol at step 1 and 7)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tray (stainless steel)</td>
			<td >PolarWare</td>
			<td >15-248</td>
			<td >for easy transport of the fluidic culture chambers and the bioreactor from incubator to laminar flow cabinet and back (clean with a paper tissue with 70% ethanol before and after use)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tweezers</td>
			<td >Wironit</td>
			<td >4910</td>
			<td >sterile handling of individual parts (autoclave at step 1 and 7)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ultrapure water</td>
			<td >Stakpure</td>
			<td >Omniapure UV 18200002</td>
			<td >to correct for medium evaporation, mixed with aqua stabil mixed and used as hydraulic fluid. (autoclave ultrapure water at step 1)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >UV light</td>
			<td >Philips</td>
			<td >TUV 30W/G30 T8</td>
			<td >for decontamination of grafts and bioreactor parts before seeding</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a multi-cue bioreactor to evaluate the inflammatory and regenerative capacity of biomaterials under flow and stretch

신체에서 직접 재생을 유도하는 재생을 유도하는 재생 가능한 생체 재료의 사용은 번역 관점에서 매력적인 전략입니다. 이러한 물질은 이식 시 염증 반응을 유도하며, 이는 물질의 후속 흡수와 새로운 조직의 재생의 원동력이다. 이 전략, 또한 시투 조직 공학에서 로 알려진, 조직 설계 혈관 이식 등 심장 혈관 교체를 얻기 위해 추구. 염증 및 재생 공정 은 스캐폴드 (즉, 스트레치 및 전단 응력)에 대한 국소 생체 역학 적 단서에 의해 결정됩니다. 여기서는 관 비계에서 스트레치및 전단 응력을 분리할 수 있는 맞춤형 생물 반응기의 사용을 자세히 설명합니다. 이를 통해 인간 대식세포와 근섬유아세포아제를 이용한 역동적인 공동배양 실험에 기초하여 입증되는 잘 조절된 기계적 하중의 영향으로 관 비계의 염증및 재생 능력의 체계적이고 표준화된 평가를 가능하게 한다. 바이오 반응기의 구성 및 설정, 비계 및 세포 파종의 준비, 스트레치 및 전단 흐름의 적용 및 유지 보수, 분석을 위한 샘플 수확 등 이 접근법의 주요 실용적인 단계는 자세히 설명합니다.

이 생물 반응기는 혈관 조직 성장에 전단 스트레스와 순환 스트레칭의 개별적이고 결합 된 효과를 연구하고 3D 생체 물질 스캐폴드에서 리모델링하기 위해 개발되었다. 생물 반응기의 설계는 다양한 적재 조건하에서 최대 8개의 혈관 구조를 배양할 수 있게한다(도 1A). 혈관 구조는 둘레 스트레치와 WSS가 독립적으로 제어될 수 있는 유량 배양챔버(도 1B)에</stron...

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A Multi-Cue Bioreactor to Evaluate the Inflammatory and Regenerative Capacity of Biomaterials under Flow and Stretch

이 프로토콜의 목표는 관형 전기 스캐폴드에서 인간 대식세포와 근섬유세포의 동적 공동 배양을 실행하여 재료 중심 조직 재생을 조사하는 것이며, 전단 응력과 순환 스트레칭의 분리를 가능하게 하는 생체 반응기를 사용하는 것입니다.

유량 및 스트레치 하에서 생체 재료의 염증 및 재생 능력을 평가하는 다중 큐 생물 반응기

The use of resorbable biomaterials to induce regeneration directly in the body is an attractive strategy from a translational perspective. Such materials ...

So far, it has been really difficult to identify the cause and effect relationships between hemodynamics and vascular tissue regeneration. And this has because it's challenging to control the individual mechanical loads. This bioreactor enables us to mechanistically investigate the individual and combined effects of sheer stress and cyclic stretch on the regenerative potential of a broad variety of tissue engineered vascular grafts.Demonstrating this procedure will be Suzanne Koch, a PhD candidate in our group. And Dr.Tamar Wissing who is a postdoctoral researcher from our laboratory. To mount the electro spun scaffold onto the silicone tubing, thread a 4-0 prolene suture into one end of a piece of silicone tubing and out of the other.Make a small knot on both sides of the tube leaving approximately 10 centimeters of wire on both knots and make a third knot on top of the two. After removing a suture needle, trim the edges of the silicone tubing into a triangular shape and make a final knot at the end of the two 10 centimeter wires. Dip the electro spun scaffold in 30%ethanol and place the scaffold over one end of free suture wire.Next, gently stretch both sides of the silicone tubing and the 10 centimeter suture knot while second researcher uses tweezers with a smooth inner tip to gently slide the electro spun scaffold over the tubing. Slowly release the stretch on the silicone tubing while simultaneously smoothing the electro spun scaffold with the tweezers. And dip the scaffold and silicone tubing in ultra pure water two times.Construct the bottom compartment and make sure that the O-ring is properly placed. Place an adaptor bushing in the upper part of the bottom compartment and place the pressure conduit with holes through the bottom compartment. Lace the silicone O-ring around the lower end of the pressure conduit to prevent leakage.And screw the lower part of the bottom compartment to the upper part of the bottom compartment to secure the pressure conduit. Make sure that the lower engraved groove of the pressure conduit is approximately three to five millimeters above the edge of the adapter bushing of the bottom compartment. Pull the silicone tube with the electro spun scaffold over the pressure conduit and make a nod and the suture wire at the lower end of the electro spun scaffold, at the location of the engraved groove on the pressure conduit.Make a second nod at the opposite side to tightly secure the silicone tubing with the electro spun graft. And placing a scissor clamp equipped with a rule at the upper end of the silicone tubing, pull the scissor clamp upwards in a consistent manner and gently pull on the electric spawn scaffold to remove any wrinkles. Use a suture wire to make two knots at both ends of the scaffold at the upper engraved groove of the pressure conduit.When both knots have been made, release the scissor clamp and use a knife to remove any excess silicone tubing. Screw the nose cones on the screw thread of the pressure conduits for the samples that will be dynamically loaded. Dip the pressure conduit, tubing, and scaffold one time in 30%ethanol and two times in ultrapure water to pre-wet the setup.Place the glass tube over the pressure conduit and push gently on the bottom compartment to secure the glass tube in place. Then place the flow straightener, a silicone O-ring, and adapter bushing in the top compartment. And secure the compartment over the open end of the glass tube.Remove the male lure plug from the flow outlet, work in a sterile laminar flow cabinet. Open the white lure cap and place an ethanol soak tissue in front of the flow outlet. Deconstruct the flow culture chamber by taking off the glass tube with the top compartment.Place a vacuum pasture pipe add onto the electro spun scaffold to remove as much medium as possible. And add fibrinogen solution at a one-to-one ratio with the thrombin supplemented cell suspension. Pipette the solution up and down one time and immediately drip the solution over the full length of the scaffold.When all of the cells have been delivered, slowly move the scaffold from left to right and up and down to achieve an even distribution of the cells. When both sides of the scaffold have been seeded, carefully reconstruct the flow culture chamber by putting the glass tube and top compartment back. And place the flow culture chamber into the incubator to let the fiber solidify.To couple the bioreactor to the pump system, place the flow culture chamber on one of the eight screw threads on the bioreactor base. And place a host clip on the medium tubing. Remove the white lure cap, covering the flow inlet of the top compartment of the flow culture chamber and remove the female lure coupler of the medium tubing.Connect the medium tubing with one side of the flow inlet on the top compartment. And the other side with the flow outlet at the bottom compartment. Transfer the complete setup from the laminar flow cabinet to the incubator.And connect a fluidic units and the bioreactor base to the air pressure tubing and electric cable. Start the software and initialize the pumps. Start the medium flow for the samples one by one.Then change the strain pump parameters to the desired settings and start the strain. Monitor the stretch applied to the scaffold every other day. The monitoring of stretch and wall shear stress over longterm culture periods shows that these values can be maintained at relatively constant levels over a period of up to 20 days.After three days of hemodynamic loading, immunofluorescent staining reveals a homogenous distribution of monocyte derived macrophages and myofibroblasts throughout the scaffold. After 20 days of co-culture, cyclic stretch results in the deposition of more numerous and thicker collagen type 1 fibers. While in the combined hemodynamic load group, the cyclic stretch effect is overruled by sheer stress resulting in a less pronounced collagen type 1 deposition.After eight days of macrophage monoculture, fiber erosion and fiber cleavage are observed in all of the hemodynamic loading regimes with the most pronounced resorption observed in the static group, and the least pronounced resorption observed in the sheer stress group. Both cyclic stretch and a sheer stress impact the cytokine secretion profile of the co-culture setup. Interestingly, the combined effects of both loads show either dominance of one of the two loads or synergistic effects of both loads.Co-culture experiments also show that the mechanical environment and resulting loading dependent inflammatory environments modulate the phenotype of the myofibroblasts. Furthermore, the gene expression patterns of contractile marker alpha smooth muscle actin correlate with protein synthesis. The most important thing when performing this protocol is that's what the application of stretch, it's essential that your setup is leak-free.

Research

JoVE Journal

Engineering

Measuring Material Microstructure Under Flow Using 1-2 Plane Flow-Small Angle Neutron Scattering

1-2 평면 흐름 - 작은 각 중성자 산란을 이용하여 재료 미세 조직에서 유량을 측정

A new small-angle neutron scattering (SANS) sample environment optimized for studying the microstructure of complex fluids under simple shear flow is ...

연구

공학

Experimental Protocol to Investigate Particle Aerosolization of a Product Under Abrasion and Under Environmental Weathering

실험 프로토콜 마모에서 환경 풍화에서 제품의 입자 에어로졸을 조사하기

The present article presents an experimental protocol to investigate particle aerosolization of a product under abrasion and under environmental ...

Design and Use of a Full Flow Sampling System (FFS) for the Quantification of Methane Emissions

Design and Use of a Full Flow Sampling System FFS for the Quantification of Methane Emissions

메탄 배출량의 정량화를위한​​ 설계 및 전체 흐름 샘플링 시스템 (FFS)의 사용

The use of natural gas continues to grow with increased discovery and production of unconventional shale resources. At the same time, the natural gas ...

A Robotic Platform to Study the Foreflipper of the California Sea Lion

로봇 플랫폼은 캘리포니아 바다 사자의 Foreflipper를 공부하기

The California sea lion (Zalophus californianus), is an agile and powerful swimmer. Unlike many successful swimmers (dolphins, tuna), they generate most ...

Solvent Bonding for Fabrication of PMMA and COP Microfluidic Devices

PMMA의 제조 및 COP 미세 유체 장치에 대한 솔벤트 본딩

Thermoplastic microfluidic devices offer many advantages over those made from silicone elastomers, but bonding procedures must be developed for each ...

In Situ Visualization of the Phase Behavior of Oil Samples Under Refinery Process Conditions

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정유 공정 조건에서 오일 샘플의 위상 행동 제자리 시각화에서

To help address production issues in refineries caused by the fouling of process units and lines, we have developed a setup as well as a method to ...

Scanning Light Scattering Profiler (SLPS) Based Methodology to Quantitatively Evaluate Forward and Backward Light Scattering from Intraocular Lenses

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SLPS (Scanning Profiling Profiler) 기반 방법론으로 안구 내 렌즈의 전방 및 후방 산란을 정량적으로 평가

The scanning light scattering profiler (SLSP) methodology has been developed for the full-angle quantitative evaluation of forward and backward light ...

A Novel Biaxial Testing Apparatus for the Determination of Forming Limit under Hot Stamping Conditions

The hot stamping and cold die quenching process is increasingly used to form complex shaped structural components of sheet metals. Conventional ...

Microfluidic Imaging Flow Cytometry by Asymmetric-detection Time-stretch Optical Microscopy (ATOM)

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Scaling the number of measurable parameters, which allows for multidimensional data analysis and thus higher-confidence statistical results, has been the ...

Flow-assisted Dielectrophoresis: A Low Cost Method for the Fabrication of High Performance Solution-processable Nanowire Devices

흐름 기반 Dielectrophoresis: 고성능 솔루션 처리 나노와이어 소자의 제조에 대 한 낮은 비용 방법

Flow-assisted dielectrophoresis (DEP) is an efficient self-assembly method for the controllable and reproducible positioning, alignment, and selection of ...