Name: a multi-cue bioreactor to evaluate the inflammatory and regenerative capacity of biomaterials under flow and stretch
Uploaded: 2020-12-10T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Multi-Cue Bioreactor to Evaluate the Inflammatory and Regenerative Capacity of Biomaterials under Flow and Stretch at JoVE.com

Denne studien er økonomisk støttet av ZonMw som en del av LSH 2Treat-programmet (436001003) og Dutch Kidney Foundation (14a2d507). N.A.K. anerkjenner støtte fra Det europeiske forskningsrådet (851960). Vi anerkjenner takknemlig gravitasjonsprogrammet "Materials Driven Regeneration", finansiert av Den nederlandske organisasjonen for vitenskapelig forskning (024.003.013).

I studiene beskrevet i denne protokollen, primære menneskelige makrofager isolert fra perifere blod buffy strøk og menneskelige myofibroblaster isolert fra saphenous venen etter koronar bi-pass kirurgi har blitt brukt44. De buffy jakkene ble hentet fra friske, anonymiserte frivillige som ga skriftlig informert samtykke, som ble godkjent av Sanquin Research Institutional Medical Ethical Committee. Bruken av humane vena saphena celler (HVSCs) var i samsvar med "Code Proper Secondary Use of Human T...

Bioreaktoren som er beskrevet her, muliggjør systematisk evaluering av bidragene fra individet og kombinerte effekter av skjærspenning og syklisk strekk på betennelse og vevregenerering i rørformede resorberbare stillaser. Denne tilnærmingen gjør det også mulig å utføre et stort utvalg av analyser på vaskulære konstruksjoner, som eksemplifisert i den representative resultatseksjonen. Disse resultatene viser den særegne effekten av de ulike hemodynamiske lasteregimene (dvs. forskjellige kombinasjoner av skjær...

Kardiovaskulær vevsteknikk (TE) forfølges som et alternativt behandlingsalternativ til de nåværende brukte permanente kardiovaskulære protesene (f.eks. vaskulære transplantater, hjerteklafferstatninger), som er suboptimale for store kohorter av pasienter1,2,3,4. Ettertraktede bruksområder inkluderer vevskonstruerte vaskulære transplantater (TEVG)5,6 og hjerteklaffer (TEHVer)7,8. Ofte bruker kardiovaskulære TE-metoder resorberbare biomaterialer (enten naturlige eller syntetiske) som tjener som et lærerikt stillas for det nye vevet som skal dannes. Dannelsen av nytt vev kan enten konstrueres helt in vitro, ved å så stillaset med celler og kultivering i en bioreaktor før implantasjon (in vitro TE)9,10,11, eller direkte in situ, der det syntetiske stillaset implanteres uten pre-culturing for å indusere dannelsen av nytt vev direkte i kroppen (in s TEitu)12,13,13,1 . For både in vitro og in situ kardiovaskulær TE tilnærminger, vellykket funksjonell regenerering er dominerende avhengig av både verten immunrespons på implantert konstruksjon og passende biomekanisk lasting.
Betydningen av biomekanisk lasting for kardiovaskulær TE er godt anerkjent15. Når det gjelder kardiovaskulære implantater, blir cellene som fyller stillaset utsatt for syklisk strekk og skjærspenninger som oppstår som følge av det hemodynamiske miljøet. Tallrike studier har rapportert den stimulatoriske effekten av (syklisk) strekk på dannelsen av matrisekomponenter, for eksempel kollagen16,17,18,19, glykosaminoglykaner (GAG)20og elastin21,22, av ulike celletyper. For eksempel viste Huang et al. at biaxial strekk forhøyet avsetningen og organiseringen av kollagen og elastin i in vitro TEVGs ved hjelp av en vaskulær bioreaktor23. Selv om vektleggingen typisk ligger på strekk som den dominerende belastningen, bruker disse studiene ofte strømningsdrevne bioreaktorer der prøven også utsettes for skjærstrøm. Selv om relativt lite er kjent om den isolerte påvirkningen av skjærspenninger på vevsdannelse og betennelse i 3D, er noen data tilgjengelige. For eksempel viste Hinderer et al. og Eoh et al. at skjærstrøm, i tillegg til en 3D stillasmikrostruktur, var viktig for dannelsen av moden elastin av humane vaskulære glatte muskelceller i et in vitro-modellsystem24,25. Til sammen illustrerer disse funnene relevansen av både syklisk strekk og skjærspenning for kardiovaskulær TE.
En annen viktig determinant for suksess eller svikt i TE-implantater er vertens immunrespons på den implanterte graft26. Dette er spesielt viktig for materialdrevne IN SITU TE-strategier, som faktisk er avhengige av den akutte inflammatoriske responsen på stillaset for å starte de påfølgende prosessene for cellulær tilstrømning og endogen vevsdannelse og ombygging27. Makrofagen er en kritisk initiativtaker til funksjonell vevregenerering, som har blitt vist ved flere studier28,29,30. Analogt med sårheling styres regenerering av vev ved parakriminalisering mellom makrofager og vevsproduserende celler som fibroblaster og myofibroblaster31,32,33. I tillegg til å koordinere ny vevsavsetning, er makrofager involvert i aktiv resorpsjon av utenlandsk stillasmateriale34,35. Som sådan har in vitro makrofagresponsen til en biomateriale blitt identifisert som en prediktiv parameter for in vivo-suksessen tilimplantater 36,37,38.
Makrofagresponsen på et implantert stillas er avhengig av stillasdesignfunksjoner som materialsammensetning og mikrostruktur35,39,40. I tillegg til stillasegenskaper påvirkes også makrofagresponsen på et stillas og deres krysstale med myofibroblaster av hemodynamiske belastninger. For eksempel ble syklisk strekning vist å være en viktig modulator av makrofag fenotype41,42,43,44 og sekresjonen av cytokiner43,44,45,46 i 3D elektrospun stillaser. Ved hjelp av et samkultursystem av makrofager og vaskulære glatte muskelceller viste Battiston et al. at tilstedeværelsen av makrofager førte til økte nivåer av elastin og GAG og at moderate nivåer av syklisk strekning (1,07-1,10) stimulerte avsetningen av kollagen I og elastin47. I tidligere arbeider har vi vist at skjærspenning er en viktig determinant for monocyttrekruttering til 3D-elektrospun stillaser48,49, og at både skjærspenning og syklisk strekk påvirker parakrinen som signaliserer mellom menneskelige monocytter og mesenchymale stromalceller50. Fahy et al. viste at skjærstrømmen økte sekresjonen av proinflammatoriske cytokiner av menneskelige monocytter51.
Samlet sett viser ovennevnte bevis at en tilstrekkelig forståelse av og kontroll over hemodynamiske belastninger er avgjørende for kardiovaskulær TE, og at det er viktig å vurdere den inflammatoriske responsen for å oppnå dette. Tallrike bioreaktorer har tidligere blitt beskrevet for in vitro52,53,54,55,56,57,58 eller ex vivo59,60,61 kultur av kardiovaskulært vev. Imidlertid er alle disse systemene designet for å etterligne de fysiologiske hemodynamiske lasteforholdene så mye som mulig. Selv om dette er svært verdifullt med det formål å skape kardiovaskulære vev in vitro eller opprettholde ex vivo-kulturer, tillater slike systemer ikke systematiske studier i de individuelle effektene av individuelle signaler. Dette skyldes at anvendelsen av både syklisk strekk og skjærspenning i disse bioreaktorer er drevet av samme trykkstrøm, som i seg selv forbinder dem. Mens mikrosystemer som tillater nøyaktig multi-cue mekanisk manipulasjon er beskrevet for 2D-substrater62 eller 3D hydrogel oppsett63,64, slike oppsett tillater ikke inkorporering av elastomeriske 3D biomaterialer stillaser.
Her presenterer vi anvendelsen av et rørformet bioreaktorsystem som unikt muliggjør frakobling av skjærspenning og syklisk strekning og bidrar til mekanistisk å undersøke deres individuelle og kombinerte effekter. Dette systemet gjør det mulig å teste et bredt utvalg av vevskonstruerte vaskulære transplantater (f.eks. syntetisk eller naturlig opprinnelse, forskjellig mikroarkitektur, ulike porøsiteter). For effektivt å koble fra anvendelsen av skjærspenning og strekk, er nøkkelbegrepene som bioreaktoren bruker (1) separasjon av kontrollen av skjærspenning og strekk ved hjelp av distinkte pumpesystemer og (2) stimulering av stillasene på en "inside-out" måte med beregningsdrevne dimensjoner. Strømning påføres på utsiden av det rørformede stillaset ved bruk av en strømningspumpe, mens omkretsstrekning av stillaset induseres ved å utvide et silikonrør som stillaset er montert ved bruk av en separat strekkpumpe. Dimensjonene til silikonrøret og glassrøret som inneholder konstruksjonen er nøye valgt og validert ved hjelp av beregningsvæskedynamikksimuleringer, for å sikre at skjærspenningen på stillaset (på grunn av strømning) og omkretsstrekningen (på grunn av rørutvidelse) ikke påvirker hverandre betydelig. Denne innvendige designen har flere praktiske begrunnelser. Hvis strekk påføres av det lysende væsketrykket (ligner fysiologisk belastning), krever det iboende at prøvedesignet er lekkasjefritt. I tillegg vil trykket som kreves for å strekke prøven være helt bestemt av prøvestivheten, som kan variere mellom prøver og innenfor en prøve over tid, noe som gjør det vanskelig å kontrollere strekningen. Denne bioreaktoren monterer vevskonstruert graft rundt et silikonrør og tillater veggskjærstress (WSS) -applikasjon på graftens yttervegg og trykker graftet fra innsiden. På denne måten kan like lasteforhold mellom prøver og innenfor prøver over tid sikres, og dessuten kan prøvene lekke, som det er vanlig for porøse vaskulære stillaser19. Denne innside-ut bioreaktoren er spesielt beregnet for systematiske studier på effekten av skjær og / eller strekk, i stedet for å konstruere et innfødt-lignende blodkar in vitro, som tradisjonelle vaskulære bioreaktoroppsett er mer egnet for. Se figur 1A–B for bioreaktordesigntegningene, og tilhørende tabell 1 for funksjonsbeskrivelse og begrunnelse bak bioreaktorens hovedkomponenter.
Bruken av bioreaktoren er demonstrert på grunnlag av en rekke nyere studier av vår gruppe der vi undersøkte de individuelle og kombinerte påvirkningene av skjærspenning og syklisk strekk på betennelse og vevsdannelse i resorberbare elektrospun stillaser for in situ kardiovaskulært vev19,43,44. For det formål brukte vi menneskelige makrofager og myofibroblaster enten i mono- eller i samkultur for å simulere de ulike fasene av in situ regenerativ kaskade. Vi har vist at cytokinsekresjon av menneskelige makrofager er tydelig påvirket av både syklisk strekk og skjærspenning, som påvirker matriseavsetningen og organiseringen av menneskelige myofibroblaster i disse stillasene, både via parakrinesignalering og direkte kontakt19,43,44. Spesielt viste disse studiene at i tilfelle kombinert påføring av skjærspenning og strekk, er effektene på vevsdannelse og betennelse enten dominert av en av de to belastningene, eller det er synergistiske effekter av begge belastningene. Disse funnene illustrerer relevansen av frakobling av begge belastningene for å få en bedre forståelse av det mekaniske miljøets bidrag i TE-prosesser. Denne forståelsen kan anvendes for systematisk å optimalisere stillasdesignparametere i relevante hemodynamiske lasteregimer. I tillegg kan mekanistiske data fra slike velkontrollerte miljøer fungere som inndata for numeriske modeller som utvikles for å forutsi løpet av in situ vevsoppussing, som nylig rapportert for TEVGs65 eller TEHVs66, for ytterligere å forbedre prediktiv kapasitet.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >advanced Dulbecco&#8217;s modified EagleMedium (aDMEM)</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >12491-015</td>
			<td >cell culture medium for fibroblasts</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Aqua Stabil</td>
			<td >Julabo</td>
			<td >8940012</td>
			<td >prevent microorganism growth in bioreactor-hydraulic reservoir</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Bovine fibrinogen</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >F8630</td>
			<td >to prepare fibrinogen gel to seed the cells on the electrospun scaffold</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Bovine thrombin</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >T4648</td>
			<td >to prepare fibrinogen gel to seed the cells on the electrospun scaffold</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Centrifuge</td>
			<td >Eppendorf</td>
			<td >5804</td>
			<td >to spin down cells and conditioned medium</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Clamp scissor - &#34;kelly forceps&#34;</td>
			<td >Almedic</td>
			<td >P-422</td>
			<td >clamp the silicone tubing and apply pre-stretch to the scaffold so the scaffold can be sutured into the engraved groove (autoclave at step 1, step 7)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CO2 cell culture incubators</td>
			<td >Sanyo</td>
			<td >MCO-170AIC-PE</td>
			<td >for cell culturing</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Compressed air reservoir</td>
			<td >Festo</td>
			<td >CRVZS-5</td>
			<td >smoothing air pressure fluctuations and create time delays for pressure build-up</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Custom Matlab script to calculate the maximum stretches</td>
			<td >Matlab</td>
			<td >R2017. The Mathworks, Natick, MA</td>
			<td >calculate the minimum and maximum outer diameter of the electrospun scaffold</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Data acquisition board</td>
			<td >National Instruments</td>
			<td >BNC-2090</td>
			<td >data processing in between amplifier system and computer</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ethanol</td>
			<td >VWR</td>
			<td >VWRK4096-9005</td>
			<td >to keep sterile working conditions</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fetal bovine calf serum (FBS)</td>
			<td >Greiner</td>
			<td >758087</td>
			<td >cell culture medium supplement; serum-supplement</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Flow culture chamber compartments, consisting of a pressure conduit with engraved grooves and small holes to apply pressure on silicone tubing, a screw thread, nose cone, top compartment with flow inlet and bottom compartment flow outlet, adapter bushing</td>
			<td >Custom made, Department of Biomedical Engineering, Eindhoven University of Technology</td>
			<td >n.a.</td>
			<td >flow culture chamber compartments (autoclave at step 1, step 7)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Glass Pasteur pipet</td>
			<td >Assistant</td>
			<td >HE40567002</td>
			<td >apply vacuum on electrospun scaffold (autoclave at step 1)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Glass tubes of the flow culture chamber</td>
			<td >Custon made, Equipment &#38; Prototype Center, Eindhoven University of Technology</td>
			<td >n.a.</td>
			<td >part of the flow culture chamber (clean and store in 70% ethanol, at step 1 and 7)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >GlutaMax</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >35050061</td>
			<td >cell culture medium amino acid supplement, minimizes ammonia build-up</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >High speed camera</td>
			<td >MotionScope</td>
			<td >M-5</td>
			<td >to monitor the stretch during culture; time-lapse photographs of the scaffolds are captured at a frequency of 30 Hz for 6 sec (i.e. 3 stretch cycles)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >High speed camera lens - Micro-NIKKOR 55mm f/2.8 - lens</td>
			<td >Nikon</td>
			<td >JAA616AB</td>
			<td >to monitor the stretch during culture; time-lapse photographs of the scaffolds are captured at a frequency of 30 Hz for 6 sec (i.e. 3 stretch cycles)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hose clip</td>
			<td >ibidi GmbH</td>
			<td >10821</td>
			<td >block medium flow (autoclave at step 1, step 7)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hydraulic reservoir with 8 screw threads for 8 flow culture chambers</td>
			<td >Custom made, Department of Biomedical Engineering, Eindhoven University of Technology</td>
			<td >n.a.</td>
			<td >to apply pressure to the silicone mounted constructs (clean outside with a paper tissue with 70% ethanol, rinse reservoir with 70% ethanol followed by demi water, at step 1 and 7)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ibidi pump system (8x) including ibidi pump, PumpControl software, fluidic unit, perfusion set (medium tubing), air pressure tubing, drying bottles with orange silica beads</td>
			<td >ibidi GmbH</td>
			<td >10902</td>
			<td >set up used to control the flow in the flow culture chambers. Note 1: the ibidi pumps were modified by the manufacturer to enable 200 mbar capacity. Note 2: can be replaced by pump system of other manufacturer, as long as same flow regimes can be applied.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Knives (no.10 sterile blades, individual foil pack) and scalpel handle (stainless steel, individually wrapped)</td>
			<td >Swann Morton</td>
			<td >0301; 0933</td>
			<td >to cut the silicone tubing in the correct size for the scaffold and to cut the suture material</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >LabVIEW Software</td>
			<td >National Instruments</td>
			<td >version 2018</td>
			<td >to control the stretch applied to the scaffolds</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Laminar flow biosafety cabinet with UV light</td>
			<td >Labconco</td>
			<td >302310001</td>
			<td >to ensure sterile working conditions. The UV is used to decontaminate everything that cannot be autoclaved, or touched after autoclaving</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Large and small petri dishes</td>
			<td >Greiner</td>
			<td >664-160</td>
			<td >for sterile working conditions</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >L-ascorbic acid 2-phosphate (vitamin C)</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >A8960</td>
			<td >cell culture medium supplement, important for collagen production</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >LED light cold source KL2500</td>
			<td >Zeiss</td>
			<td >Schott AG</td>
			<td >to aid in visualization for the time lapse of the scaffolds during monitoring of the stretch</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Luer (female and male) locks and connectors, white luer caps</td>
			<td >ibidi GmbH</td>
			<td >various, see (https://ibidi.com/26-flow-accessories)</td>
			<td >to close or connect parts of the bioreactor and the ibidi pump (autoclave at step 1, step 7)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Measuring amplifier (PICAS)</td>
			<td >PEEKEL instruments B.V.</td>
			<td >n.a.</td>
			<td >to amplify the signal from the pressure sensor and feedback to LabView</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Medium reservoir (large syringes 60 mL) and reservoir holders</td>
			<td >ibidi GmbH</td>
			<td >10974</td>
			<td >medium reservoir (autoclave at step 1, step 7)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Medium tubing with 4.25 mm outer diameter and 1 mm inner diameter</td>
			<td >Rubber BV</td>
			<td >1805</td>
			<td >to allow for a larger flow rate, the ibidi medium tubing with larger diameter is used. Note: the part of medium tubing guided through the fluidic unit valves are the same as the default ibidi medium tubing</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Motion Studio Software</td>
			<td >Idtvision</td>
			<td >2.15.00</td>
			<td >to make the high speed time lapse images for stretch monitoring</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Needle (19G)</td>
			<td >BD Microlance</td>
			<td >301700</td>
			<td >together with thin flexible tubing used to fill the hydraulic reservoir with ultrapure water without adding air bubbles</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Needle driver</td>
			<td >Adson</td>
			<td >2429218</td>
			<td >to handle the needle of the nylon suture through the silicone tube (autoclave at step 1, step 7)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Paper tissues</td>
			<td >Kleenex</td>
			<td >38044001</td>
			<td >for cleaning of the equipment with 70% ethanol</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Parafilm</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >P7793-1EA</td>
			<td >quick fix if leakage occurs</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Penicillin/streptomycin (P/S)</td>
			<td >Lonza</td>
			<td >DE17-602E</td>
			<td >cell culture medium supplement; prevent bacterial contamination</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >P4417-100TAB</td>
			<td >for storage and washing steps (autoclave at step 1)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Plastic containers (60 mL) with red screw caps</td>
			<td >Greiner</td>
			<td >206202</td>
			<td >to prepare the fibrinogen solution</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pneumatic cylinder</td>
			<td >Festo</td>
			<td >AEVC-20-10-I-P</td>
			<td >to actuate the Teflon bellow (clean with a paper tissue with 70% ethanol at step 1 and 7)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Polycaprolactone bisurea (PCL-BU) tubular scaffolds (3 mm inner diameter, 200 &#181;m wall thickness, 20 mm length)</td>
			<td >SyMO-Chem, Eindhoven, The Netherlands</td>
			<td >n.a.</td>
			<td >produced using electrospinning from 15% (w/w) chloroform (Sigma; 372978) polymer solutions. See Van Haaften et al Tissue Engineering Part C (2018) for more details</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pressure conduit without holes (for static control)</td>
			<td >Custom made, Department of Biomedical Engineering, Eindhoven University of Technology</td>
			<td >n.a.</td>
			<td >to mount electrospun tubes on silicon tubing (autoclave at step 1, step 7)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pressure sensor and transducer</td>
			<td >BD</td>
			<td >TC-XX and P 10 EZ</td>
			<td >the air pressure going to the pneumatic actuated pump is raised until it reaches the set pressure</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Proportional air pressure control valve and pressure sensor</td>
			<td >Festo</td>
			<td >MPPES-3-1/8-2-010, 159596</td>
			<td >provides compressed air to the pneumatic actuated pump</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI-1640)</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >A1049101</td>
			<td >cell culture medium for monocyte/macrophage</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Safe lock Eppendorf tubes (1.5 mL)</td>
			<td >Eppendorf</td>
			<td >30120086</td>
			<td >multiple applications (autoclave at step 1)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sodium dodecyl sulfate solution 20%</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >5030</td>
			<td >Used to clean materials, at a concentration of 0.1%.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Silicone O-rings</td>
			<td >Technirub</td>
			<td >1250S</td>
			<td >to prevent leakage (autoclave at step 1, step 7)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Silicone tubing (2.8 mm outer diameter, 400 um wall thickness)</td>
			<td >Rubber BV</td>
			<td >1805</td>
			<td >to mount the electrospun tubes on the pressure conduits (autoclave at step 1)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sterile tube (15 mL)</td>
			<td >Falcon</td>
			<td >352095</td>
			<td >multiple applications</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Suture, 5-0 prolene with pre-attached taper point needle</td>
			<td >Ethicon, Johnson&#38;Johnson</td>
			<td >EH7404H</td>
			<td >Prolene suture wire 5-0 (75cm length, TF taper point needle, 1/2 circle, 13 mm needle length)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Syringe (24 mL)</td>
			<td >B. Braun Melsungen AG</td>
			<td >2057932</td>
			<td >to add the ultrapure water or medium to the hydraulic reservoir or flow culture chamber</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Syringe filter (0.2 &#181;m)</td>
			<td >Satorius</td>
			<td >17597-K</td>
			<td >to filter the fibrinogen solution</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >T150 cell culture flask with filter cap</td>
			<td >Nunc</td>
			<td >178983</td>
			<td >to degas culture medium</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >T75 Cell culture flask with filter cap</td>
			<td >Nunc</td>
			<td >156499</td>
			<td >to culture static control samples</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Teflon bellow</td>
			<td >Custom made, Department of Biomedical Engineering, Eindhoven University of Technology</td>
			<td >n.a.</td>
			<td >to load the hydraulic reservoir (clean outside with a paper tissue with 70% ethanol at step 1 and 7)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tray (stainless steel)</td>
			<td >PolarWare</td>
			<td >15-248</td>
			<td >for easy transport of the fluidic culture chambers and the bioreactor from incubator to laminar flow cabinet and back (clean with a paper tissue with 70% ethanol before and after use)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tweezers</td>
			<td >Wironit</td>
			<td >4910</td>
			<td >sterile handling of individual parts (autoclave at step 1 and 7)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ultrapure water</td>
			<td >Stakpure</td>
			<td >Omniapure UV 18200002</td>
			<td >to correct for medium evaporation, mixed with aqua stabil mixed and used as hydraulic fluid. (autoclave ultrapure water at step 1)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >UV light</td>
			<td >Philips</td>
			<td >TUV 30W/G30 T8</td>
			<td >for decontamination of grafts and bioreactor parts before seeding</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a multi-cue bioreactor to evaluate the inflammatory and regenerative capacity of biomaterials under flow and stretch

Bruk av resorberbare biomaterialer for å indusere regenerering direkte i kroppen er en attraktiv strategi fra et translasjonelt perspektiv. Slike materialer induserer en inflammatorisk respons ved implantasjon, som er driveren for etterfølgende resorpsjon av materialet og regenerering av nytt vev. Denne strategien, også kjent som in situ vevsteknikk, forfølges for å oppnå kardiovaskulære erstatninger som vevskonstruerte vaskulære transplantater. Både de inflammatoriske og regenerative prosessene bestemmes av de lokale biomekaniske signalene på stillaset (dvs. strekk og skjærspenning). Her beskriver vi i detalj bruken av en spesialutviklet bioreaktor som unikt muliggjør frakobling av strekk- og skjærspenning på et rørformet stillas. Dette muliggjør systematisk og standardisert evaluering av den inflammatoriske og regenerative kapasiteten til rørformede stillaser under påvirkning av godt kontrollerte mekaniske belastninger, som vi demonstrerer på grunnlag av et dynamisk samkultureksperiment ved hjelp av menneskelige makrofager og myofibroblaster. De viktigste praktiske trinnene i denne tilnærmingen – konstruksjon og oppsett av bioreaktoren, tilberedning av stillasene og cellesåing, påføring og vedlikehold av strekk- og skjærstrøm og prøvehøsting for analyse – diskuteres i detalj.

Denne bioreaktoren ble utviklet for å studere de individuelle og kombinerte effektene av skjærspenning og syklisk strekk på vaskulær vevsvekst og ombygging i 3D biomaterialer. Bioreaktorens utforming gjør det mulig å dyrke opptil åtte vaskulære konstruksjoner under ulike lasteforhold (Figur 1A). De vaskulære konstruksjonene er plassert i et strømningskulturkammer (figur 1B) der både omkretsstrekningen og WSS kan kontrolleres uavhengig. Det øverste ro...

Watch this Scientific Journal Video about A Multi-Cue Bioreactor to Evaluate the Inflammatory and Regenerative Capacity of Biomaterials under Flow and Stretch at JoVE.com

A Multi-Cue Bioreactor to Evaluate the Inflammatory and Regenerative Capacity of Biomaterials under Flow and Stretch

Målet med denne protokollen er å utføre en dynamisk samkultur av menneskelige makrofager og myofibroblaster i rørformede elektrospun stillaser for å undersøke materialdrevet vevregenerering, ved hjelp av en bioreaktor som muliggjør frakobling av skjærspenning og syklisk strekk.

En multi-cue bioreaktor for å evaluere den inflammatoriske og regenerative kapasiteten til biomaterialer under strømning og strekk

The use of resorbable biomaterials to induce regeneration directly in the body is an attractive strategy from a translational perspective. Such materials ...

So far, it has been really difficult to identify the cause and effect relationships between hemodynamics and vascular tissue regeneration. And this has because it's challenging to control the individual mechanical loads. This bioreactor enables us to mechanistically investigate the individual and combined effects of sheer stress and cyclic stretch on the regenerative potential of a broad variety of tissue engineered vascular grafts.Demonstrating this procedure will be Suzanne Koch, a PhD candidate in our group. And Dr.Tamar Wissing who is a postdoctoral researcher from our laboratory. To mount the electro spun scaffold onto the silicone tubing, thread a 4-0 prolene suture into one end of a piece of silicone tubing and out of the other.Make a small knot on both sides of the tube leaving approximately 10 centimeters of wire on both knots and make a third knot on top of the two. After removing a suture needle, trim the edges of the silicone tubing into a triangular shape and make a final knot at the end of the two 10 centimeter wires. Dip the electro spun scaffold in 30%ethanol and place the scaffold over one end of free suture wire.Next, gently stretch both sides of the silicone tubing and the 10 centimeter suture knot while second researcher uses tweezers with a smooth inner tip to gently slide the electro spun scaffold over the tubing. Slowly release the stretch on the silicone tubing while simultaneously smoothing the electro spun scaffold with the tweezers. And dip the scaffold and silicone tubing in ultra pure water two times.Construct the bottom compartment and make sure that the O-ring is properly placed. Place an adaptor bushing in the upper part of the bottom compartment and place the pressure conduit with holes through the bottom compartment. Lace the silicone O-ring around the lower end of the pressure conduit to prevent leakage.And screw the lower part of the bottom compartment to the upper part of the bottom compartment to secure the pressure conduit. Make sure that the lower engraved groove of the pressure conduit is approximately three to five millimeters above the edge of the adapter bushing of the bottom compartment. Pull the silicone tube with the electro spun scaffold over the pressure conduit and make a nod and the suture wire at the lower end of the electro spun scaffold, at the location of the engraved groove on the pressure conduit.Make a second nod at the opposite side to tightly secure the silicone tubing with the electro spun graft. And placing a scissor clamp equipped with a rule at the upper end of the silicone tubing, pull the scissor clamp upwards in a consistent manner and gently pull on the electric spawn scaffold to remove any wrinkles. Use a suture wire to make two knots at both ends of the scaffold at the upper engraved groove of the pressure conduit.When both knots have been made, release the scissor clamp and use a knife to remove any excess silicone tubing. Screw the nose cones on the screw thread of the pressure conduits for the samples that will be dynamically loaded. Dip the pressure conduit, tubing, and scaffold one time in 30%ethanol and two times in ultrapure water to pre-wet the setup.Place the glass tube over the pressure conduit and push gently on the bottom compartment to secure the glass tube in place. Then place the flow straightener, a silicone O-ring, and adapter bushing in the top compartment. And secure the compartment over the open end of the glass tube.Remove the male lure plug from the flow outlet, work in a sterile laminar flow cabinet. Open the white lure cap and place an ethanol soak tissue in front of the flow outlet. Deconstruct the flow culture chamber by taking off the glass tube with the top compartment.Place a vacuum pasture pipe add onto the electro spun scaffold to remove as much medium as possible. And add fibrinogen solution at a one-to-one ratio with the thrombin supplemented cell suspension. Pipette the solution up and down one time and immediately drip the solution over the full length of the scaffold.When all of the cells have been delivered, slowly move the scaffold from left to right and up and down to achieve an even distribution of the cells. When both sides of the scaffold have been seeded, carefully reconstruct the flow culture chamber by putting the glass tube and top compartment back. And place the flow culture chamber into the incubator to let the fiber solidify.To couple the bioreactor to the pump system, place the flow culture chamber on one of the eight screw threads on the bioreactor base. And place a host clip on the medium tubing. Remove the white lure cap, covering the flow inlet of the top compartment of the flow culture chamber and remove the female lure coupler of the medium tubing.Connect the medium tubing with one side of the flow inlet on the top compartment. And the other side with the flow outlet at the bottom compartment. Transfer the complete setup from the laminar flow cabinet to the incubator.And connect a fluidic units and the bioreactor base to the air pressure tubing and electric cable. Start the software and initialize the pumps. Start the medium flow for the samples one by one.Then change the strain pump parameters to the desired settings and start the strain. Monitor the stretch applied to the scaffold every other day. The monitoring of stretch and wall shear stress over longterm culture periods shows that these values can be maintained at relatively constant levels over a period of up to 20 days.After three days of hemodynamic loading, immunofluorescent staining reveals a homogenous distribution of monocyte derived macrophages and myofibroblasts throughout the scaffold. After 20 days of co-culture, cyclic stretch results in the deposition of more numerous and thicker collagen type 1 fibers. While in the combined hemodynamic load group, the cyclic stretch effect is overruled by sheer stress resulting in a less pronounced collagen type 1 deposition.After eight days of macrophage monoculture, fiber erosion and fiber cleavage are observed in all of the hemodynamic loading regimes with the most pronounced resorption observed in the static group, and the least pronounced resorption observed in the sheer stress group. Both cyclic stretch and a sheer stress impact the cytokine secretion profile of the co-culture setup. Interestingly, the combined effects of both loads show either dominance of one of the two loads or synergistic effects of both loads.Co-culture experiments also show that the mechanical environment and resulting loading dependent inflammatory environments modulate the phenotype of the myofibroblasts. Furthermore, the gene expression patterns of contractile marker alpha smooth muscle actin correlate with protein synthesis. The most important thing when performing this protocol is that's what the application of stretch, it's essential that your setup is leak-free.

Research

JoVE Journal

Engineering

Measuring Material Microstructure Under Flow Using 1-2 Plane Flow-Small Angle Neutron Scattering

Måling Material Microstructure Under Flow Bruke 1-2 Plane Flow-Small Angle Neutron Spredning

A new small-angle neutron scattering (SANS) sample environment optimized for studying the microstructure of complex fluids under simple shear flow is ...

Experimental Protocol to Investigate Particle Aerosolization of a Product Under Abrasion and Under Environmental Weathering

Forsøksprotokoll å etterforske Partikkel forstøvning av et produkt Under Slite og under miljø Forvitring

The present article presents an experimental protocol to investigate particle aerosolization of a product under abrasion and under environmental ...

Design and Use of a Full Flow Sampling System (FFS) for the Quantification of Methane Emissions

Design and Use of a Full Flow Sampling System FFS for the Quantification of Methane Emissions

Design og bruk av en Full Flow Sampling System (FFS) for kvantifisering av metanutslipp

The use of natural gas continues to grow with increased discovery and production of unconventional shale resources. At the same time, the natural gas ...

A Robotic Platform to Study the Foreflipper of the California Sea Lion

En robot plattform å studere Foreflipper av California Sea Lion

The California sea lion (Zalophus californianus), is an agile and powerful swimmer. Unlike many successful swimmers (dolphins, tuna), they generate most ...

Solvent Bonding for Fabrication of PMMA and COP Microfluidic Devices

Solvent Bonding for fabrikasjon av PMMA og COP microfluidic enheter

Thermoplastic microfluidic devices offer many advantages over those made from silicone elastomers, but bonding procedures must be developed for each ...

In Situ Visualization of the Phase Behavior of Oil Samples Under Refinery Process Conditions

In Situ Visualization of the Phase Behavior of Oil Samples Under Refinery Process Conditions

In Situ Visualisering av faseoppførsel av oljeprøver Under Refinery Prosessbetingelser

To help address production issues in refineries caused by the fouling of process units and lines, we have developed a setup as well as a method to ...

Scanning Light Scattering Profiler (SLPS) Based Methodology to Quantitatively Evaluate Forward and Backward Light Scattering from Intraocular Lenses

Scanning Light Scattering Profiler SLPS Based Methodology to Quantitatively Evaluate Forward and Backward Light Scattering from Intraocular Lenses

Scanning Light Scattering Profiler (SLPS) basert metode for å kvantitativt vurdere fremover og bakover lys spredning fra intraokulære objektiver

The scanning light scattering profiler (SLSP) methodology has been developed for the full-angle quantitative evaluation of forward and backward light ...

A Novel Biaxial Testing Apparatus for the Determination of Forming Limit under Hot Stamping Conditions

A Novel Biaxial Testing Apparater for fastsettelse av Forming ramme knyttet varm stempling betingelser

The hot stamping and cold die quenching process is increasingly used to form complex shaped structural components of sheet metals. Conventional ...

Microfluidic Imaging Flow Cytometry by Asymmetric-detection Time-stretch Optical Microscopy (ATOM)

Microfluidic Imaging Flow Cytometry by Asymmetric-detection Time-stretch Optical Microscopy ATOM

Mikrofluidisk Imaging Flow Cytometry ved asymmetrisk deteksjon Time-stretch Optical Microscopy (ATOM)

Scaling the number of measurable parameters, which allows for multidimensional data analysis and thus higher-confidence statistical results, has been the ...

Flow-assisted Dielectrophoresis: A Low Cost Method for the Fabrication of High Performance Solution-processable Nanowire Devices

Flyt-assistert Dielectrophoresis: En rimelig metode for fabrikasjon av høytytende løsningen-processable Nanowire enheter

Flow-assisted dielectrophoresis (DEP) is an efficient self-assembly method for the controllable and reproducible positioning, alignment, and selection of ...