Name: a multi-cue bioreactor to evaluate the inflammatory and regenerative capacity of biomaterials under flow and stretch
Uploaded: 2020-12-10T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Multi-Cue Bioreactor to Evaluate the Inflammatory and Regenerative Capacity of Biomaterials under Flow and Stretch at JoVE.com

Este estudo é apoiado financeiramente pela ZonMw como parte do programa LSH 2Treat (436001003) e da Dutch Kidney Foundation (14a2d507). N.A.K. reconhece o apoio do Conselho Europeu de Pesquisa (851960). Agradecemos o Programa de Gravitação "Regeneração Impulsionada por Materiais", financiado pela Organização Holandesa de Pesquisa Científica (024.003.013).

Nos estudos descritos neste protocolo, macrófagos humanos primários isolados de casacos periféricos de sangue e miofibroblasts humanos isolados da veia safena após cirurgia coronariana por passagem foram utilizados44. Os casacos buffy foram obtidos de voluntários saudáveis e anonimizados que forneceram consentimento por escrito informado, que foi aprovado pelo Comitê de Ética Médica Institucional da Sanquin Research. O uso de células vena saphena humanas (HVSCs) foi de acordo com o "Cód...

O bioreator descrito aqui permite a avaliação sistemática das contribuições do indivíduo e efeitos combinados do estresse da cisalhamento e do estiramento cíclico na inflamação e regeneração tecidual em andaimes tubulares resorbáveis. Essa abordagem também permite que uma grande variedade de análises sejam realizadas em construções vasculares, conforme exemplificado na seção de resultados representativos. Esses resultados mostram o impacto característico dos diferentes regimes de carregamento hemodinâ...

A engenharia de tecidos cardiovasculares (TE) está sendo perseguida como opção alternativa de tratamento às próteses cardiovasculares permanentes atualmente utilizadas (por exemplo, enxertos vasculares, substituições de válvulas cardíacas), que são subótimas para grandes coortes de pacientes1,2,3,4. Aplicações muito procuradas incluem enxertos vasculares (TEVGs)5,6 e válvulas cardíacas (TEHVs)7,8. Na maioria das vezes, as metodologias cardiovasculares de TE fazem uso de biomateriais resorbáveis (naturais ou sintéticos) que servem como um andaime instrutivo para a formação do novo tecido. A formação de novos tecidos pode ser projetada completamente in vitro, semeando o andaime com células e culminando em um bioreator antes da implantação (te in vitro)9,10,11, ou diretamente in situ, em que o andaime sintético é implantado sem pré-cultivo, a fim de induzir a formação de novos tecidos diretamente no corpo (in situ TE)12,13,14. Tanto para abordagens in vitro quanto in situ cardiovascular TE, a regeneração funcional bem sucedida é predominantemente dependente tanto da resposta imune do hospedeiro à construção implantada quanto do carregamento biomecânico adequado.
A importância do carregamento biomecânico para te cardiovascular é bem reconhecida15. No caso dos implantes cardiovasculares, as células que povoam o andaime são expostas ao estiramento cíclico e estresses de cisalhamento que surgem como resultado do ambiente hemodinâmico. Inúmeros estudos têm relatado o efeito estimulante do estiramento (cíclico) na formação de componentes matriciais, como o colágeno16,17,18,19, glicosaminoglicas (GAGs)20e elastina21,22, por vários tipos de células. Por exemplo, Huang et al. demonstraram que o estiramento biaxial elevou a deposição e organização do colágeno e da elastina em TEVGs in vitro usando um bioreator vascular23. Embora a ênfase tipicamente reside no alongamento como a carga dominante, esses estudos muitas vezes fazem uso de bioreatores orientados pelo fluxo em que a amostra também é exposta ao fluxo de cisalhamento. Embora relativamente pouco se saiba sobre a influência isolada das tensões de tesoura na formação de tecidos e inflamação em 3D, alguns dados estão disponíveis. Por exemplo, Hinderer et al. e Eoh et al. demonstraram que o fluxo de cisalhamento, além de uma microestrutura de andaime 3D, foi importante para a formação de elastina madura por células musculares vasculares humanas em um sistema de modelo in vitro24,25. Ao todo, esses achados ilustram a relevância tanto do alongamento cíclico quanto do estresse de cisalhamento para te cardiovascular.
Outro determinante importante para o sucesso ou falha dos implantes de TE é a resposta imune do hospedeiro ao enxerto implantado26. Isso é particularmente importante para estratégias de TE in situ in situ, que realmente contam com a resposta inflamatória aguda ao andaime para iniciar os processos subsequentes de influxo celular e formação de tecido endógeno e remodelação27. O macrófago é um iniciador crítico da regeneração do tecido funcional, que tem sido mostrado por múltiplos estudos28,29,30. Análoga à cicatrização de feridas, a regeneração do tecido é regida pela sinalização paracrina entre macrófagos e células produtoras de tecidos, como fibroblastos e miofibroblasts31,32,33. Além de coordenar a nova deposição tecidual, os macrófagos estão envolvidos na resorção ativa do material do andaime estrangeiro34,35. Como tal, a resposta in vitro de macrófago a um bioma material foi identificada como parâmetro preditivo para o sucesso in vivo dos implantes36,37,38.
A resposta do macrófago a um andaime implantado depende de características de design de andaimes, como composição de material e microestrutura35,39,40. Além das propriedades do andaime, a resposta do macrófago a um andaime e seu crosstalk com myofibroblasts também é impactada por cargas hemodinâmicas. Por exemplo, o estiramento cíclico mostrou-se um importante modulador do fenótipo macrófago41,42,43,44 e a secreção de citocinas43,44,45,46 em andaimes eletroscardos 3D. Utilizando um sistema de co-cultura de macrófagos e células musculares lisas vasculares, Battiston et al. demonstraram que a presença de macrófagos levou ao aumento dos níveis de elastina e GAGs e que níveis moderados de estiramento cíclico (1,07-1,10) estimularam a deposição do colágeno I e elastina47. Em trabalhos anteriores, demonstramos que o estresse da cisalhamento é um importante determinante para o recrutamento de monócitos em andaimes eletroscados3D 48,49, e que tanto o estresse da cisalhamento quanto o estiramento cíclico impactam a sinalização paracrina entre monócitos humanos e células estrômicas mesenquimais50. Fahy et al. demonstraram que o fluxo de cisalhamento aumentou a secreção de citocinas pró-inflamatórias por monócitos humanos51.
Em conjunto, as evidências acima mostram que uma compreensão adequada e controle sobre cargas hemodinâmicas é crucial para o TE cardiovascular, e que é importante considerar a resposta inflamatória para conseguir isso. Inúmeros bioreatores foram descritos anteriormente para a cultura in vitro52,53,54,55,56,57,58 ou ex vivo59,60,61 cultura de tecidos cardiovasculares. No entanto, todos esses sistemas são projetados para imitar as condições fisiológicas de carregamento hemodinâmico tanto quanto possível. Embora isso seja altamente valioso para o propósito de criar tecidos cardiovasculares in vitro ou manter culturas ex vivo, tais sistemas não permitem estudos sistemáticos sobre os efeitos individuais das pistas individuais. Isso ocorre porque a aplicação tanto do estresse cíclico quanto do cisalhamento nesses bioreatores é impulsionada pelo mesmo fluxo pressurizado, que os liga intrinsecamente. Embora microsistemas que permitam manipulação mecânica precisa de várias pistas tenham sido descritos para substratos2D configurações de hidrogel 62 ou 3D63,64, tais configurações não permitem a incorporação de andaimes biomateriais 3D elastoméricos.
Aqui, apresentamos a aplicação de um sistema bioreator tubular que permite exclusivamente o desacoplamento do estresse da cisalhamento e do estiramento cíclico e ajuda a investigar mecanicamente seus efeitos individuais e combinados. Este sistema permite testar uma ampla variedade de enxertos vasculares projetados por tecido (por exemplo, origem sintética ou natural, microarquiteção diferente, várias porosidades). Para efetivamente desacoplar a aplicação do estresse e do alongamento da tesoura, os conceitos-chave que o bioreator usa são (1) separação do controle do estresse e do estiramento da tesoura usando sistemas de bomba distintos e (2) estimulação dos andaimes de forma "de dentro para fora" com dimensões computacionalmente orientadas. O fluxo é aplicado na superfície externa do andaime tubular através do uso de uma bomba de fluxo, enquanto o trecho circunferencial do andaime é induzido pela expansão de um tubo de silicone no qual o andaime é montado através do uso de uma bomba de tensão separada. As dimensões do tubo de silicone e do tubo de vidro que contém a construção são cuidadosamente escolhidas e validadas por meio de simulações de dinâmica computacional de fluidos, para garantir que o estresse da cisalhamento no andaime (devido ao fluxo) e o estiramento circunferencial (devido à expansão do tubo) não afetem significativamente uns aos outros. Este design de dentro para fora tem várias lógicas práticas. Se o estiramento for aplicado pela pressão do fluido luminal (semelhante ao carregamento fisiológico), ele requer inerentemente que o desenho da amostra seja livre de vazamentos. Além disso, a pressão necessária para esticar a amostra seria completamente determinada pela rigidez amostral, que pode variar entre amostras e dentro de uma amostra ao longo do tempo, dificultando o controle do trecho. Este bioreator monta o enxerto de tecido projetado em torno de um tubo de silicone e permite a aplicação de estresse de corte de parede (WSS) na parede externa do enxerto e pressuriza o enxerto por dentro. Dessa forma, condições iguais de carregamento entre amostras e dentro das amostras ao longo do tempo podem ser garantidas, e, além disso, as amostras podem ser vazadas, como é comum para andaimes vasculares porosos19. Este bioreator de dentro para fora destina-se especificamente a estudos sistemáticos sobre os efeitos da tesoura e/ou alongamento, em vez da engenharia de um vaso sanguíneo nativo in vitro, para o qual as configurações tradicionais de bioreatores vasculares são mais adequadas. Consulte a Figura 1A-B para os desenhos de design bioreator, e sua tabela correspondente 1 para uma descrição funcional e racionalidade por trás dos principais componentes do bioreator.
O uso do bioreator é demonstrado com base em uma série de estudos recentes do nosso grupo em que investigamos as influências individuais e combinadas do estresse da cisalhamento e do estiramento cíclico na inflamação e formação tecidual em andaimes eletrosopunis resorbáveis para in situ tecido cardiovascular19,43,44. Para isso, usamos macrófagos humanos e miofibroblasts em mono ou em co-cultura para simular as várias fases da cascata regenerativa in situ. Demonstramos que a secreção de citocinas por macrófagos humanos é claramente impactada tanto pelo estresse do estiramento cíclico quanto pelo cisalhamento, afetando a deposição matricial e a organização por myofibroblasts humanos nestes andaimes, tanto via sinalização paracririna quanto pelo contato direto19,43,44. Notavelmente, esses estudos revelaram que, no caso da aplicação combinada de estresse e alongamento da tesoura, os efeitos na formação e inflamação tecidual são dominados por uma das duas cargas, ou há efeitos sinérgicos de ambas as cargas. Esses achados ilustram a relevância da desacoplamento de ambas as cargas para obter uma melhor compreensão da contribuição do ambiente mecânico nos processos de TE. Esse entendimento pode ser aplicado para otimizar sistematicamente parâmetros de design de andaimes em regimes de carregamento hemodinâmicos relevantes. Além disso, os dados mecanicistas de ambientes tão bem controlados podem servir de entrada para modelos numéricos que estão sendo desenvolvidos para prever o curso da remodelação de tecidos in situ, como relatado recentemente para TEVGs65 ou TEHVs66, para melhorar ainda mais a capacidade preditiva.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >advanced Dulbecco&#8217;s modified EagleMedium (aDMEM)</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >12491-015</td>
			<td >cell culture medium for fibroblasts</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Aqua Stabil</td>
			<td >Julabo</td>
			<td >8940012</td>
			<td >prevent microorganism growth in bioreactor-hydraulic reservoir</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Bovine fibrinogen</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >F8630</td>
			<td >to prepare fibrinogen gel to seed the cells on the electrospun scaffold</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Bovine thrombin</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >T4648</td>
			<td >to prepare fibrinogen gel to seed the cells on the electrospun scaffold</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Centrifuge</td>
			<td >Eppendorf</td>
			<td >5804</td>
			<td >to spin down cells and conditioned medium</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Clamp scissor - &#34;kelly forceps&#34;</td>
			<td >Almedic</td>
			<td >P-422</td>
			<td >clamp the silicone tubing and apply pre-stretch to the scaffold so the scaffold can be sutured into the engraved groove (autoclave at step 1, step 7)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CO2 cell culture incubators</td>
			<td >Sanyo</td>
			<td >MCO-170AIC-PE</td>
			<td >for cell culturing</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Compressed air reservoir</td>
			<td >Festo</td>
			<td >CRVZS-5</td>
			<td >smoothing air pressure fluctuations and create time delays for pressure build-up</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Custom Matlab script to calculate the maximum stretches</td>
			<td >Matlab</td>
			<td >R2017. The Mathworks, Natick, MA</td>
			<td >calculate the minimum and maximum outer diameter of the electrospun scaffold</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Data acquisition board</td>
			<td >National Instruments</td>
			<td >BNC-2090</td>
			<td >data processing in between amplifier system and computer</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ethanol</td>
			<td >VWR</td>
			<td >VWRK4096-9005</td>
			<td >to keep sterile working conditions</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fetal bovine calf serum (FBS)</td>
			<td >Greiner</td>
			<td >758087</td>
			<td >cell culture medium supplement; serum-supplement</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Flow culture chamber compartments, consisting of a pressure conduit with engraved grooves and small holes to apply pressure on silicone tubing, a screw thread, nose cone, top compartment with flow inlet and bottom compartment flow outlet, adapter bushing</td>
			<td >Custom made, Department of Biomedical Engineering, Eindhoven University of Technology</td>
			<td >n.a.</td>
			<td >flow culture chamber compartments (autoclave at step 1, step 7)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Glass Pasteur pipet</td>
			<td >Assistant</td>
			<td >HE40567002</td>
			<td >apply vacuum on electrospun scaffold (autoclave at step 1)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Glass tubes of the flow culture chamber</td>
			<td >Custon made, Equipment &#38; Prototype Center, Eindhoven University of Technology</td>
			<td >n.a.</td>
			<td >part of the flow culture chamber (clean and store in 70% ethanol, at step 1 and 7)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >GlutaMax</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >35050061</td>
			<td >cell culture medium amino acid supplement, minimizes ammonia build-up</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >High speed camera</td>
			<td >MotionScope</td>
			<td >M-5</td>
			<td >to monitor the stretch during culture; time-lapse photographs of the scaffolds are captured at a frequency of 30 Hz for 6 sec (i.e. 3 stretch cycles)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >High speed camera lens - Micro-NIKKOR 55mm f/2.8 - lens</td>
			<td >Nikon</td>
			<td >JAA616AB</td>
			<td >to monitor the stretch during culture; time-lapse photographs of the scaffolds are captured at a frequency of 30 Hz for 6 sec (i.e. 3 stretch cycles)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hose clip</td>
			<td >ibidi GmbH</td>
			<td >10821</td>
			<td >block medium flow (autoclave at step 1, step 7)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hydraulic reservoir with 8 screw threads for 8 flow culture chambers</td>
			<td >Custom made, Department of Biomedical Engineering, Eindhoven University of Technology</td>
			<td >n.a.</td>
			<td >to apply pressure to the silicone mounted constructs (clean outside with a paper tissue with 70% ethanol, rinse reservoir with 70% ethanol followed by demi water, at step 1 and 7)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ibidi pump system (8x) including ibidi pump, PumpControl software, fluidic unit, perfusion set (medium tubing), air pressure tubing, drying bottles with orange silica beads</td>
			<td >ibidi GmbH</td>
			<td >10902</td>
			<td >set up used to control the flow in the flow culture chambers. Note 1: the ibidi pumps were modified by the manufacturer to enable 200 mbar capacity. Note 2: can be replaced by pump system of other manufacturer, as long as same flow regimes can be applied.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Knives (no.10 sterile blades, individual foil pack) and scalpel handle (stainless steel, individually wrapped)</td>
			<td >Swann Morton</td>
			<td >0301; 0933</td>
			<td >to cut the silicone tubing in the correct size for the scaffold and to cut the suture material</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >LabVIEW Software</td>
			<td >National Instruments</td>
			<td >version 2018</td>
			<td >to control the stretch applied to the scaffolds</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Laminar flow biosafety cabinet with UV light</td>
			<td >Labconco</td>
			<td >302310001</td>
			<td >to ensure sterile working conditions. The UV is used to decontaminate everything that cannot be autoclaved, or touched after autoclaving</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Large and small petri dishes</td>
			<td >Greiner</td>
			<td >664-160</td>
			<td >for sterile working conditions</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >L-ascorbic acid 2-phosphate (vitamin C)</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >A8960</td>
			<td >cell culture medium supplement, important for collagen production</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >LED light cold source KL2500</td>
			<td >Zeiss</td>
			<td >Schott AG</td>
			<td >to aid in visualization for the time lapse of the scaffolds during monitoring of the stretch</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Luer (female and male) locks and connectors, white luer caps</td>
			<td >ibidi GmbH</td>
			<td >various, see (https://ibidi.com/26-flow-accessories)</td>
			<td >to close or connect parts of the bioreactor and the ibidi pump (autoclave at step 1, step 7)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Measuring amplifier (PICAS)</td>
			<td >PEEKEL instruments B.V.</td>
			<td >n.a.</td>
			<td >to amplify the signal from the pressure sensor and feedback to LabView</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Medium reservoir (large syringes 60 mL) and reservoir holders</td>
			<td >ibidi GmbH</td>
			<td >10974</td>
			<td >medium reservoir (autoclave at step 1, step 7)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Medium tubing with 4.25 mm outer diameter and 1 mm inner diameter</td>
			<td >Rubber BV</td>
			<td >1805</td>
			<td >to allow for a larger flow rate, the ibidi medium tubing with larger diameter is used. Note: the part of medium tubing guided through the fluidic unit valves are the same as the default ibidi medium tubing</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Motion Studio Software</td>
			<td >Idtvision</td>
			<td >2.15.00</td>
			<td >to make the high speed time lapse images for stretch monitoring</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Needle (19G)</td>
			<td >BD Microlance</td>
			<td >301700</td>
			<td >together with thin flexible tubing used to fill the hydraulic reservoir with ultrapure water without adding air bubbles</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Needle driver</td>
			<td >Adson</td>
			<td >2429218</td>
			<td >to handle the needle of the nylon suture through the silicone tube (autoclave at step 1, step 7)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Paper tissues</td>
			<td >Kleenex</td>
			<td >38044001</td>
			<td >for cleaning of the equipment with 70% ethanol</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Parafilm</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >P7793-1EA</td>
			<td >quick fix if leakage occurs</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Penicillin/streptomycin (P/S)</td>
			<td >Lonza</td>
			<td >DE17-602E</td>
			<td >cell culture medium supplement; prevent bacterial contamination</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >P4417-100TAB</td>
			<td >for storage and washing steps (autoclave at step 1)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Plastic containers (60 mL) with red screw caps</td>
			<td >Greiner</td>
			<td >206202</td>
			<td >to prepare the fibrinogen solution</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pneumatic cylinder</td>
			<td >Festo</td>
			<td >AEVC-20-10-I-P</td>
			<td >to actuate the Teflon bellow (clean with a paper tissue with 70% ethanol at step 1 and 7)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Polycaprolactone bisurea (PCL-BU) tubular scaffolds (3 mm inner diameter, 200 &#181;m wall thickness, 20 mm length)</td>
			<td >SyMO-Chem, Eindhoven, The Netherlands</td>
			<td >n.a.</td>
			<td >produced using electrospinning from 15% (w/w) chloroform (Sigma; 372978) polymer solutions. See Van Haaften et al Tissue Engineering Part C (2018) for more details</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pressure conduit without holes (for static control)</td>
			<td >Custom made, Department of Biomedical Engineering, Eindhoven University of Technology</td>
			<td >n.a.</td>
			<td >to mount electrospun tubes on silicon tubing (autoclave at step 1, step 7)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pressure sensor and transducer</td>
			<td >BD</td>
			<td >TC-XX and P 10 EZ</td>
			<td >the air pressure going to the pneumatic actuated pump is raised until it reaches the set pressure</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Proportional air pressure control valve and pressure sensor</td>
			<td >Festo</td>
			<td >MPPES-3-1/8-2-010, 159596</td>
			<td >provides compressed air to the pneumatic actuated pump</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI-1640)</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >A1049101</td>
			<td >cell culture medium for monocyte/macrophage</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Safe lock Eppendorf tubes (1.5 mL)</td>
			<td >Eppendorf</td>
			<td >30120086</td>
			<td >multiple applications (autoclave at step 1)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sodium dodecyl sulfate solution 20%</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >5030</td>
			<td >Used to clean materials, at a concentration of 0.1%.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Silicone O-rings</td>
			<td >Technirub</td>
			<td >1250S</td>
			<td >to prevent leakage (autoclave at step 1, step 7)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Silicone tubing (2.8 mm outer diameter, 400 um wall thickness)</td>
			<td >Rubber BV</td>
			<td >1805</td>
			<td >to mount the electrospun tubes on the pressure conduits (autoclave at step 1)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sterile tube (15 mL)</td>
			<td >Falcon</td>
			<td >352095</td>
			<td >multiple applications</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Suture, 5-0 prolene with pre-attached taper point needle</td>
			<td >Ethicon, Johnson&#38;Johnson</td>
			<td >EH7404H</td>
			<td >Prolene suture wire 5-0 (75cm length, TF taper point needle, 1/2 circle, 13 mm needle length)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Syringe (24 mL)</td>
			<td >B. Braun Melsungen AG</td>
			<td >2057932</td>
			<td >to add the ultrapure water or medium to the hydraulic reservoir or flow culture chamber</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Syringe filter (0.2 &#181;m)</td>
			<td >Satorius</td>
			<td >17597-K</td>
			<td >to filter the fibrinogen solution</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >T150 cell culture flask with filter cap</td>
			<td >Nunc</td>
			<td >178983</td>
			<td >to degas culture medium</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >T75 Cell culture flask with filter cap</td>
			<td >Nunc</td>
			<td >156499</td>
			<td >to culture static control samples</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Teflon bellow</td>
			<td >Custom made, Department of Biomedical Engineering, Eindhoven University of Technology</td>
			<td >n.a.</td>
			<td >to load the hydraulic reservoir (clean outside with a paper tissue with 70% ethanol at step 1 and 7)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tray (stainless steel)</td>
			<td >PolarWare</td>
			<td >15-248</td>
			<td >for easy transport of the fluidic culture chambers and the bioreactor from incubator to laminar flow cabinet and back (clean with a paper tissue with 70% ethanol before and after use)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tweezers</td>
			<td >Wironit</td>
			<td >4910</td>
			<td >sterile handling of individual parts (autoclave at step 1 and 7)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ultrapure water</td>
			<td >Stakpure</td>
			<td >Omniapure UV 18200002</td>
			<td >to correct for medium evaporation, mixed with aqua stabil mixed and used as hydraulic fluid. (autoclave ultrapure water at step 1)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >UV light</td>
			<td >Philips</td>
			<td >TUV 30W/G30 T8</td>
			<td >for decontamination of grafts and bioreactor parts before seeding</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a multi-cue bioreactor to evaluate the inflammatory and regenerative capacity of biomaterials under flow and stretch

O uso de biomateriais resorbáveis para induzir a regeneração diretamente no corpo é uma estratégia atraente do ponto de vista translacional. Tais materiais induzem uma resposta inflamatória após a implantação, que é o condutor da posterior resorção do material e da regeneração de novos tecidos. Essa estratégia, também conhecida como engenharia de tecidos in situ, é perseguida para obter substituições cardiovasculares, como enxertos vasculares projetados por tecidos. Tanto os processos inflamatórios quanto os regenerativos são determinados pelas pistas biomecânicas locais no andaime (ou seja, estresse de estiramento e calha). Aqui, descrevemos em detalhes o uso de um bioreator desenvolvido sob medida que permite exclusivamente a dissociação do estresse de estiramento e tesoura em um andaime tubular. Isso permite a avaliação sistemática e padronizada da capacidade inflamatória e regenerativa dos andaimes tubulares sob a influência de cargas mecânicas bem controladas, que demonstramos com base em um experimento dinâmico de co-cultura usando macrófagos humanos e miofibroblasts. As principais etapas práticas dessa abordagem — a construção e a configuração do bioreator, a preparação dos andaimes e a semeadura de células, a aplicação e a manutenção do fluxo de estiramento e cisalhamento e a colheita de amostras para análise — são discutidas detalhadamente.

Este bioreator foi desenvolvido para estudar os efeitos individuais e combinados do estresse da cisalhamento e do estiramento cíclico no crescimento do tecido vascular e remodelação em andaimes biomateriais 3D. O desenho do bioreator permite a cultivo de até oito construções vasculares sob várias condições de carregamento(Figura 1A). As construções vasculares são posicionadas em uma câmara de cultura de fluxo (Figura 1B) na qual tanto o trecho circu...

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A Multi-Cue Bioreactor to Evaluate the Inflammatory and Regenerative Capacity of Biomaterials under Flow and Stretch

O objetivo deste protocolo é executar uma co-cultura dinâmica de macrófagos humanos e miofibroblasts em andaimes eletroscarados tubulares para investigar a regeneração de tecidos conduzidos por materiais, usando um bioreator que permite o desacoplamento do estresse da tesoura e do estiramento cíclico.

Um Bioreator multi-cue para avaliar a capacidade inflamatória e regenerativa de biomateriais sob fluxo e estiramento

The use of resorbable biomaterials to induce regeneration directly in the body is an attractive strategy from a translational perspective. Such materials ...

So far, it has been really difficult to identify the cause and effect relationships between hemodynamics and vascular tissue regeneration. And this has because it's challenging to control the individual mechanical loads. This bioreactor enables us to mechanistically investigate the individual and combined effects of sheer stress and cyclic stretch on the regenerative potential of a broad variety of tissue engineered vascular grafts.Demonstrating this procedure will be Suzanne Koch, a PhD candidate in our group. And Dr.Tamar Wissing who is a postdoctoral researcher from our laboratory. To mount the electro spun scaffold onto the silicone tubing, thread a 4-0 prolene suture into one end of a piece of silicone tubing and out of the other.Make a small knot on both sides of the tube leaving approximately 10 centimeters of wire on both knots and make a third knot on top of the two. After removing a suture needle, trim the edges of the silicone tubing into a triangular shape and make a final knot at the end of the two 10 centimeter wires. Dip the electro spun scaffold in 30%ethanol and place the scaffold over one end of free suture wire.Next, gently stretch both sides of the silicone tubing and the 10 centimeter suture knot while second researcher uses tweezers with a smooth inner tip to gently slide the electro spun scaffold over the tubing. Slowly release the stretch on the silicone tubing while simultaneously smoothing the electro spun scaffold with the tweezers. And dip the scaffold and silicone tubing in ultra pure water two times.Construct the bottom compartment and make sure that the O-ring is properly placed. Place an adaptor bushing in the upper part of the bottom compartment and place the pressure conduit with holes through the bottom compartment. Lace the silicone O-ring around the lower end of the pressure conduit to prevent leakage.And screw the lower part of the bottom compartment to the upper part of the bottom compartment to secure the pressure conduit. Make sure that the lower engraved groove of the pressure conduit is approximately three to five millimeters above the edge of the adapter bushing of the bottom compartment. Pull the silicone tube with the electro spun scaffold over the pressure conduit and make a nod and the suture wire at the lower end of the electro spun scaffold, at the location of the engraved groove on the pressure conduit.Make a second nod at the opposite side to tightly secure the silicone tubing with the electro spun graft. And placing a scissor clamp equipped with a rule at the upper end of the silicone tubing, pull the scissor clamp upwards in a consistent manner and gently pull on the electric spawn scaffold to remove any wrinkles. Use a suture wire to make two knots at both ends of the scaffold at the upper engraved groove of the pressure conduit.When both knots have been made, release the scissor clamp and use a knife to remove any excess silicone tubing. Screw the nose cones on the screw thread of the pressure conduits for the samples that will be dynamically loaded. Dip the pressure conduit, tubing, and scaffold one time in 30%ethanol and two times in ultrapure water to pre-wet the setup.Place the glass tube over the pressure conduit and push gently on the bottom compartment to secure the glass tube in place. Then place the flow straightener, a silicone O-ring, and adapter bushing in the top compartment. And secure the compartment over the open end of the glass tube.Remove the male lure plug from the flow outlet, work in a sterile laminar flow cabinet. Open the white lure cap and place an ethanol soak tissue in front of the flow outlet. Deconstruct the flow culture chamber by taking off the glass tube with the top compartment.Place a vacuum pasture pipe add onto the electro spun scaffold to remove as much medium as possible. And add fibrinogen solution at a one-to-one ratio with the thrombin supplemented cell suspension. Pipette the solution up and down one time and immediately drip the solution over the full length of the scaffold.When all of the cells have been delivered, slowly move the scaffold from left to right and up and down to achieve an even distribution of the cells. When both sides of the scaffold have been seeded, carefully reconstruct the flow culture chamber by putting the glass tube and top compartment back. And place the flow culture chamber into the incubator to let the fiber solidify.To couple the bioreactor to the pump system, place the flow culture chamber on one of the eight screw threads on the bioreactor base. And place a host clip on the medium tubing. Remove the white lure cap, covering the flow inlet of the top compartment of the flow culture chamber and remove the female lure coupler of the medium tubing.Connect the medium tubing with one side of the flow inlet on the top compartment. And the other side with the flow outlet at the bottom compartment. Transfer the complete setup from the laminar flow cabinet to the incubator.And connect a fluidic units and the bioreactor base to the air pressure tubing and electric cable. Start the software and initialize the pumps. Start the medium flow for the samples one by one.Then change the strain pump parameters to the desired settings and start the strain. Monitor the stretch applied to the scaffold every other day. The monitoring of stretch and wall shear stress over longterm culture periods shows that these values can be maintained at relatively constant levels over a period of up to 20 days.After three days of hemodynamic loading, immunofluorescent staining reveals a homogenous distribution of monocyte derived macrophages and myofibroblasts throughout the scaffold. After 20 days of co-culture, cyclic stretch results in the deposition of more numerous and thicker collagen type 1 fibers. While in the combined hemodynamic load group, the cyclic stretch effect is overruled by sheer stress resulting in a less pronounced collagen type 1 deposition.After eight days of macrophage monoculture, fiber erosion and fiber cleavage are observed in all of the hemodynamic loading regimes with the most pronounced resorption observed in the static group, and the least pronounced resorption observed in the sheer stress group. Both cyclic stretch and a sheer stress impact the cytokine secretion profile of the co-culture setup. Interestingly, the combined effects of both loads show either dominance of one of the two loads or synergistic effects of both loads.Co-culture experiments also show that the mechanical environment and resulting loading dependent inflammatory environments modulate the phenotype of the myofibroblasts. Furthermore, the gene expression patterns of contractile marker alpha smooth muscle actin correlate with protein synthesis. The most important thing when performing this protocol is that's what the application of stretch, it's essential that your setup is leak-free.

Research

JoVE Journal

Engineering

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Engenharia

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