Name: a multi-cue bioreactor to evaluate the inflammatory and regenerative capacity of biomaterials under flow and stretch
Uploaded: 2020-12-10T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Multi-Cue Bioreactor to Evaluate the Inflammatory and Regenerative Capacity of Biomaterials under Flow and Stretch at JoVE.com

Este estudio cuenta con el apoyo financiero de ZonMw como parte del programa LSH 2Treat (436001003) y la Fundación Holandesa del Riñón (14a2d507). N.A.K. agradece el apoyo del Consejo Europeo de Investigación (851960). Agradecemos el Programa de Gravitación "Regeneración Impulsada por Materiales", financiado por la Organización de los Países Bajos para la Investigación Científica (024.003.013).

En los estudios descritos en este protocolo, se han utilizado macrófagos humanos primarios aislados de capas buffy de sangre periférica y miofibroblastos humanos aislados de la vena safena después de la cirugía coronaria de derivación44. Los abrigos buffy se obtuvieron de voluntarios sanos y anónimos que proporcionaron un consentimiento informado por escrito, que fue aprobado por el Comité de Ética Médica Institucional de Investigación sanquin. El uso de células de vena safena humana (H...

El biorreactor aquí descrito permite la evaluación sistemática de las contribuciones de los efectos individuales y combinados del esfuerzo cizallador y el estiramiento cíclico sobre la inflamación y la regeneración tisular en andamios tubulares reabsorbibles. Este enfoque también permite realizar una gran variedad de análisis sobre constructos vasculares, como se ejemplifica en la sección de resultados representativos. Estos resultados muestran el impacto distintivo de los diferentes regímenes de carga hemodin?...

La ingeniería de tejidos cardiovasculares (TE) se está llevando a cabo como una opción de tratamiento alternativa a las prótesis cardiovasculares permanentes utilizadas actualmente (por ejemplo, injertos vasculares, reemplazos de válvulas cardíacas), que son subóptimas para grandes cohortes de pacientes1,2,3,4. Las aplicaciones muy buscadas incluyen injertos vasculares de ingeniería tisular (TEVG)5,6 y válvulas cardíacas (TEHV)7,8. La mayoría de las veces, las metodologías cardiovasculares de TE hacen uso de biomateriales reabsorbibles (ya sean naturales o sintéticos) que sirven como un andamio instructivo para que se forme el nuevo tejido. La formación de nuevo tejido puede ser diseñada completamente in vitro, sesementando el andamio con células y culturando en un biorreactor antes de la implantación (TE in vitro)9,10,11,o directamente in situ, en el que el andamio sintético se implanta sin precultivo para inducir la formación de nuevo tejido directamente en el cuerpo (TE in situ)12,13,14. Para los enfoques de TE cardiovascular in vitro e in situ, la regeneración funcional exitosa depende predominantemente tanto de la respuesta inmune del huésped a la construcción implantada como de la carga biomecánica adecuada.
La importancia de la carga biomecánica para la TE cardiovascular es bien reconocida15. En el caso de los implantes cardiovasculares, las células que pueblan el andamio están expuestas a estiramientos cíclicos y tensiones de cizallamiento que surgen como resultado del entorno hemodinámico. Numerosos estudios han reportado el efecto estimulante del estiramiento (cíclico) en la formación de componentes de la matriz, como el colágeno16,17,18,19,glicosaminoglicanos (GAG)20y elastina21, 22,por varios tipos de células. Por ejemplo, Huang et al. demostraron que el estiramiento biaxial elevaba la deposición y organización de colágeno y elastina en TEVG in vitro mediante el uso de un biorreactor vascular23. Si bien el énfasis generalmente se encuentra en el estiramiento como la carga dominante, estos estudios a menudo hacen uso de biorreactores impulsados por flujo en los que la muestra también está expuesta al flujo de cizalla. Aunque se sabe relativamente poco sobre la influencia aislada de las tensiones de cizallamiento en la formación de tejidos y la inflamación en 3D, hay algunos datos disponibles. Por ejemplo, Hinderer et al. y Eoh et al. demostraron que el flujo de cizallamiento, además de una microestructura de andamio 3D, era importante para la formación de elastina madura por células del músculo liso vascular humano en un sistema modelo in vitro24,25. En conjunto, estos hallazgos ilustran la relevancia tanto del estiramiento cíclico como del estrés cizallamiento para la TE cardiovascular.
Otro determinante importante para el éxito o fracaso de los implantes TE es la respuesta inmune del huésped al injerto implantado26. Esto es particularmente importante para las estrategias de TE in situ impulsadas por materiales, que en realidad se basan en la respuesta inflamatoria aguda al andamio para iniciar los procesos posteriores de afluencia celular y formación y remodelación endógena de tejidos27. El macrófago es un iniciador crítico de la regeneración funcional del tejido, lo que ha sido demostrado por múltiples estudios28,29,30. Análoga a la cicatrización de heridas, la regeneración del tejido se rige por la señalización paracrina entre los macrófagos y las células productoras de tejido como los fibroblastos y los miofibroblastos31,32,33. Además de coordinar la nueva deposición de tejido, los macrófagos están involucrados en la reabsorción activa de material de andamio extraño34,35. Como tal, la respuesta in vitro de los macrófagos a un biomaterial se ha identificado como un parámetro predictivo para el éxito in vivo de los implantes36,37,38.
La respuesta de los macrófagos a un andamio implantado depende de las características de diseño del andamio, como la composición del material y la microestructura35,39,40. Además de las propiedades del andamio, la respuesta de los macrófagos a un andamio y su diafonía con miofibroblastos también se ve afectada por las cargas hemodinámicas. Por ejemplo, se demostró que el estiramiento cíclico es un importante modulador del fenotipo de macrófagos41,42,43,44 y la secreción de citoquinas43,44,45,46 en andamios electrospun 3D. Utilizando un sistema de coculto de macrófagos y células del músculo liso vascular, Battiston et al. demostraron que la presencia de macrófagos condujo a un aumento de los niveles de elastina y GAG y que los niveles moderados de estiramiento cíclico (1.07-1.10) estimularon la deposición de colágeno I y elastina47. En trabajos anteriores, hemos demostrado que el esfuerzo por cizallamiento es un determinante importante para el reclutamiento de monocitos en andamios electrospun 3D48,49,y que tanto el esfuerzo por cizallamiento como el estiramiento cíclico afectan la señalización paracrina entre los monocitos humanos y las células del estroma mesenquimal50. Fahy et al. demostraron que el flujo de cizallado aumentaba la secreción de citoquinas proinflamatorias por los monocitos humanos51.
En conjunto, la evidencia anterior muestra que una comprensión adecuada y el control sobre las cargas hemodinámicas es crucial para la TE cardiovascular, y que es importante considerar la respuesta inflamatoria para lograrlo. Se han descrito previamente numerosos biorreactores para el cultivo in vitro52,53,54,55,56,57,58 o ex vivo59,60,61 de tejidos cardiovasculares. Sin embargo, todos estos sistemas están diseñados para imitar las condiciones fisiológicas de carga hemodinámica tanto como sea posible. Si bien esto es muy valioso para el propósito de crear tejidos cardiovasculares in vitro o mantener cultivos ex vivo, tales sistemas no permiten estudios sistemáticos sobre los efectos individuales de las señales individuales. Esto se debe a que la aplicación tanto del estiramiento cíclico como del esfuerzo de cizallamiento en estos biorreactores es impulsada por el mismo flujo presurizado, que los une intrínsecamente. Si bien se han descrito microsistemas que permiten una manipulación mecánica multi-cue precisa para sustratos 2D62 o configuraciones de hidrogel3D 63,64, tales configuraciones no permiten la incorporación de andamios elastoméricos de biomateriales 3D.
Aquí, presentamos la aplicación de un sistema de biorreactor tubular que permite de manera única el desacoplamiento del esfuerzo por cizallamiento y el estiramiento cíclico y ayuda a investigar mecánicamente sus efectos individuales y combinados. Este sistema permite probar una amplia variedad de injertos vasculares de ingeniería tisular (por ejemplo, de origen sintético o natural, diferentes microarquicturas, varias porosidades). Para desacoplar eficazmente la aplicación de la tensión de cizallamiento y el estiramiento, los conceptos clave que utiliza el biorreactor son (1) la separación del control de la tensión de cizallamiento y el estiramiento utilizando distintos sistemas de bomba y (2) la estimulación de los andamios de una manera "de adentro hacia afuera" con dimensiones impulsadas computacionalmente. El flujo se aplica en la superficie exterior del andamio tubular mediante el uso de una bomba de flujo, mientras que el estiramiento circunferencial del andamio se induce mediante la expansión de un tubo de silicona en el que se monta el andamio mediante el uso de una bomba de deformación separada. Las dimensiones del tubo de silicona y el tubo de vidrio que contiene la construcción se eligen y validan cuidadosamente utilizando simulaciones computacionales de dinámica de fluidos, para garantizar que la tensión de cizallamiento en el andamio (debido al flujo) y el estiramiento circunferencial (debido a la expansión del tubo) no se afecten significativamente entre sí. Este diseño de adentro hacia afuera tiene varias razones prácticas. Si el estiramiento se aplica por la presión del fluido luminal (similar a la carga fisiológica), inherentemente requiere que el diseño de la muestra esté libre de fugas. Además, la presión requerida para estirar la muestra estaría completamente determinada por la rigidez de la muestra, que puede variar entre muestras y dentro de una muestra a lo largo del tiempo, lo que dificulta el control del estiramiento. Este biorreactor monta el injerto de ingeniería tisular alrededor de un tubo de silicona y permite la aplicación de tensión de cizallamiento de pared (WSS) en la pared externa del injerto y presuriza el injerto desde el interior. De esta manera, se pueden garantizar condiciones de carga iguales entre muestras y dentro de las muestras a lo largo del tiempo, y además, se permite que las muestras estén permeables, como es común para los andamios vasculares porosos19. Este biorreactor de adentro hacia afuera está específicamente diseñado para estudios sistemáticos sobre los efectos del cizallamiento y / o estiramiento, en lugar de la ingeniería de un vaso sanguíneo nativo in vitro, para el cual las configuraciones tradicionales de biorreactores vasculares son más adecuadas. Consulte la Figura 1A-B para los dibujos de diseño del biorreactor, y su correspondiente Tabla 1 para una descripción funcional y una justificación detrás de los principales componentes del biorreactor.
El uso del biorreactor está demostrado sobre la base de una serie de estudios recientes de nuestro grupo en los que investigamos las influencias individuales y combinadas del esfuerzo cizallador y el estiramiento cíclico sobre la inflamación y la formación de tejido en andamios electrospúdicos reabsorbibles para tejido cardiovascular in situ19,43,44. Con ese fin, utilizamos macrófagos humanos y miofibroblastos, ya sea en monocultivo o en cocultivo para simular las diversas fases de la cascada regenerativa in situ. Hemos demostrado que la secreción de citoquinas por parte de los macrófagos humanos se ve claramente afectada tanto por el estiramiento cíclico como por el esfuerzo de cizallamiento, afectando la deposición de la matriz y la organización por miofibroblastos humanos en estos andamios, tanto a través de la señalización paracrina como del contacto directo19,43,44. En particular, estos estudios revelaron que en el caso de la aplicación combinada de esfuerzo por cizallamiento y estiramiento, los efectos sobre la formación de tejidos y la inflamación están dominados por una de las dos cargas, o hay efectos sinérgicos de ambas cargas. Estos hallazgos ilustran la relevancia de desacoplamiento de ambas cargas para obtener una mejor comprensión de la contribución del entorno mecánico en los procesos de TE. Esta comprensión se puede aplicar para optimizar sistemáticamente los parámetros de diseño de andamios en regímenes de carga hemodinámicos relevantes. Además, los datos mecanicistas de tales entornos bien controlados pueden servir como entrada para los modelos numéricos que se están desarrollando para predecir el curso de la remodelación de tejidos in situ, como se informó recientemente para teVGs65 o TEHVs66,para mejorar aún más la capacidad predictiva.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >advanced Dulbecco&#8217;s modified EagleMedium (aDMEM)</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >12491-015</td>
			<td >cell culture medium for fibroblasts</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Aqua Stabil</td>
			<td >Julabo</td>
			<td >8940012</td>
			<td >prevent microorganism growth in bioreactor-hydraulic reservoir</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Bovine fibrinogen</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >F8630</td>
			<td >to prepare fibrinogen gel to seed the cells on the electrospun scaffold</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Bovine thrombin</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >T4648</td>
			<td >to prepare fibrinogen gel to seed the cells on the electrospun scaffold</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Centrifuge</td>
			<td >Eppendorf</td>
			<td >5804</td>
			<td >to spin down cells and conditioned medium</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Clamp scissor - &#34;kelly forceps&#34;</td>
			<td >Almedic</td>
			<td >P-422</td>
			<td >clamp the silicone tubing and apply pre-stretch to the scaffold so the scaffold can be sutured into the engraved groove (autoclave at step 1, step 7)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CO2 cell culture incubators</td>
			<td >Sanyo</td>
			<td >MCO-170AIC-PE</td>
			<td >for cell culturing</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Compressed air reservoir</td>
			<td >Festo</td>
			<td >CRVZS-5</td>
			<td >smoothing air pressure fluctuations and create time delays for pressure build-up</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Custom Matlab script to calculate the maximum stretches</td>
			<td >Matlab</td>
			<td >R2017. The Mathworks, Natick, MA</td>
			<td >calculate the minimum and maximum outer diameter of the electrospun scaffold</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Data acquisition board</td>
			<td >National Instruments</td>
			<td >BNC-2090</td>
			<td >data processing in between amplifier system and computer</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ethanol</td>
			<td >VWR</td>
			<td >VWRK4096-9005</td>
			<td >to keep sterile working conditions</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fetal bovine calf serum (FBS)</td>
			<td >Greiner</td>
			<td >758087</td>
			<td >cell culture medium supplement; serum-supplement</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Flow culture chamber compartments, consisting of a pressure conduit with engraved grooves and small holes to apply pressure on silicone tubing, a screw thread, nose cone, top compartment with flow inlet and bottom compartment flow outlet, adapter bushing</td>
			<td >Custom made, Department of Biomedical Engineering, Eindhoven University of Technology</td>
			<td >n.a.</td>
			<td >flow culture chamber compartments (autoclave at step 1, step 7)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Glass Pasteur pipet</td>
			<td >Assistant</td>
			<td >HE40567002</td>
			<td >apply vacuum on electrospun scaffold (autoclave at step 1)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Glass tubes of the flow culture chamber</td>
			<td >Custon made, Equipment &#38; Prototype Center, Eindhoven University of Technology</td>
			<td >n.a.</td>
			<td >part of the flow culture chamber (clean and store in 70% ethanol, at step 1 and 7)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >GlutaMax</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >35050061</td>
			<td >cell culture medium amino acid supplement, minimizes ammonia build-up</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >High speed camera</td>
			<td >MotionScope</td>
			<td >M-5</td>
			<td >to monitor the stretch during culture; time-lapse photographs of the scaffolds are captured at a frequency of 30 Hz for 6 sec (i.e. 3 stretch cycles)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >High speed camera lens - Micro-NIKKOR 55mm f/2.8 - lens</td>
			<td >Nikon</td>
			<td >JAA616AB</td>
			<td >to monitor the stretch during culture; time-lapse photographs of the scaffolds are captured at a frequency of 30 Hz for 6 sec (i.e. 3 stretch cycles)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hose clip</td>
			<td >ibidi GmbH</td>
			<td >10821</td>
			<td >block medium flow (autoclave at step 1, step 7)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hydraulic reservoir with 8 screw threads for 8 flow culture chambers</td>
			<td >Custom made, Department of Biomedical Engineering, Eindhoven University of Technology</td>
			<td >n.a.</td>
			<td >to apply pressure to the silicone mounted constructs (clean outside with a paper tissue with 70% ethanol, rinse reservoir with 70% ethanol followed by demi water, at step 1 and 7)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ibidi pump system (8x) including ibidi pump, PumpControl software, fluidic unit, perfusion set (medium tubing), air pressure tubing, drying bottles with orange silica beads</td>
			<td >ibidi GmbH</td>
			<td >10902</td>
			<td >set up used to control the flow in the flow culture chambers. Note 1: the ibidi pumps were modified by the manufacturer to enable 200 mbar capacity. Note 2: can be replaced by pump system of other manufacturer, as long as same flow regimes can be applied.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Knives (no.10 sterile blades, individual foil pack) and scalpel handle (stainless steel, individually wrapped)</td>
			<td >Swann Morton</td>
			<td >0301; 0933</td>
			<td >to cut the silicone tubing in the correct size for the scaffold and to cut the suture material</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >LabVIEW Software</td>
			<td >National Instruments</td>
			<td >version 2018</td>
			<td >to control the stretch applied to the scaffolds</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Laminar flow biosafety cabinet with UV light</td>
			<td >Labconco</td>
			<td >302310001</td>
			<td >to ensure sterile working conditions. The UV is used to decontaminate everything that cannot be autoclaved, or touched after autoclaving</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Large and small petri dishes</td>
			<td >Greiner</td>
			<td >664-160</td>
			<td >for sterile working conditions</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >L-ascorbic acid 2-phosphate (vitamin C)</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >A8960</td>
			<td >cell culture medium supplement, important for collagen production</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >LED light cold source KL2500</td>
			<td >Zeiss</td>
			<td >Schott AG</td>
			<td >to aid in visualization for the time lapse of the scaffolds during monitoring of the stretch</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Luer (female and male) locks and connectors, white luer caps</td>
			<td >ibidi GmbH</td>
			<td >various, see (https://ibidi.com/26-flow-accessories)</td>
			<td >to close or connect parts of the bioreactor and the ibidi pump (autoclave at step 1, step 7)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Measuring amplifier (PICAS)</td>
			<td >PEEKEL instruments B.V.</td>
			<td >n.a.</td>
			<td >to amplify the signal from the pressure sensor and feedback to LabView</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Medium reservoir (large syringes 60 mL) and reservoir holders</td>
			<td >ibidi GmbH</td>
			<td >10974</td>
			<td >medium reservoir (autoclave at step 1, step 7)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Medium tubing with 4.25 mm outer diameter and 1 mm inner diameter</td>
			<td >Rubber BV</td>
			<td >1805</td>
			<td >to allow for a larger flow rate, the ibidi medium tubing with larger diameter is used. Note: the part of medium tubing guided through the fluidic unit valves are the same as the default ibidi medium tubing</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Motion Studio Software</td>
			<td >Idtvision</td>
			<td >2.15.00</td>
			<td >to make the high speed time lapse images for stretch monitoring</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Needle (19G)</td>
			<td >BD Microlance</td>
			<td >301700</td>
			<td >together with thin flexible tubing used to fill the hydraulic reservoir with ultrapure water without adding air bubbles</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Needle driver</td>
			<td >Adson</td>
			<td >2429218</td>
			<td >to handle the needle of the nylon suture through the silicone tube (autoclave at step 1, step 7)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Paper tissues</td>
			<td >Kleenex</td>
			<td >38044001</td>
			<td >for cleaning of the equipment with 70% ethanol</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Parafilm</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >P7793-1EA</td>
			<td >quick fix if leakage occurs</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Penicillin/streptomycin (P/S)</td>
			<td >Lonza</td>
			<td >DE17-602E</td>
			<td >cell culture medium supplement; prevent bacterial contamination</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >P4417-100TAB</td>
			<td >for storage and washing steps (autoclave at step 1)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Plastic containers (60 mL) with red screw caps</td>
			<td >Greiner</td>
			<td >206202</td>
			<td >to prepare the fibrinogen solution</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pneumatic cylinder</td>
			<td >Festo</td>
			<td >AEVC-20-10-I-P</td>
			<td >to actuate the Teflon bellow (clean with a paper tissue with 70% ethanol at step 1 and 7)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Polycaprolactone bisurea (PCL-BU) tubular scaffolds (3 mm inner diameter, 200 &#181;m wall thickness, 20 mm length)</td>
			<td >SyMO-Chem, Eindhoven, The Netherlands</td>
			<td >n.a.</td>
			<td >produced using electrospinning from 15% (w/w) chloroform (Sigma; 372978) polymer solutions. See Van Haaften et al Tissue Engineering Part C (2018) for more details</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pressure conduit without holes (for static control)</td>
			<td >Custom made, Department of Biomedical Engineering, Eindhoven University of Technology</td>
			<td >n.a.</td>
			<td >to mount electrospun tubes on silicon tubing (autoclave at step 1, step 7)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pressure sensor and transducer</td>
			<td >BD</td>
			<td >TC-XX and P 10 EZ</td>
			<td >the air pressure going to the pneumatic actuated pump is raised until it reaches the set pressure</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Proportional air pressure control valve and pressure sensor</td>
			<td >Festo</td>
			<td >MPPES-3-1/8-2-010, 159596</td>
			<td >provides compressed air to the pneumatic actuated pump</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI-1640)</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >A1049101</td>
			<td >cell culture medium for monocyte/macrophage</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Safe lock Eppendorf tubes (1.5 mL)</td>
			<td >Eppendorf</td>
			<td >30120086</td>
			<td >multiple applications (autoclave at step 1)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sodium dodecyl sulfate solution 20%</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >5030</td>
			<td >Used to clean materials, at a concentration of 0.1%.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Silicone O-rings</td>
			<td >Technirub</td>
			<td >1250S</td>
			<td >to prevent leakage (autoclave at step 1, step 7)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Silicone tubing (2.8 mm outer diameter, 400 um wall thickness)</td>
			<td >Rubber BV</td>
			<td >1805</td>
			<td >to mount the electrospun tubes on the pressure conduits (autoclave at step 1)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sterile tube (15 mL)</td>
			<td >Falcon</td>
			<td >352095</td>
			<td >multiple applications</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Suture, 5-0 prolene with pre-attached taper point needle</td>
			<td >Ethicon, Johnson&#38;Johnson</td>
			<td >EH7404H</td>
			<td >Prolene suture wire 5-0 (75cm length, TF taper point needle, 1/2 circle, 13 mm needle length)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Syringe (24 mL)</td>
			<td >B. Braun Melsungen AG</td>
			<td >2057932</td>
			<td >to add the ultrapure water or medium to the hydraulic reservoir or flow culture chamber</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Syringe filter (0.2 &#181;m)</td>
			<td >Satorius</td>
			<td >17597-K</td>
			<td >to filter the fibrinogen solution</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >T150 cell culture flask with filter cap</td>
			<td >Nunc</td>
			<td >178983</td>
			<td >to degas culture medium</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >T75 Cell culture flask with filter cap</td>
			<td >Nunc</td>
			<td >156499</td>
			<td >to culture static control samples</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Teflon bellow</td>
			<td >Custom made, Department of Biomedical Engineering, Eindhoven University of Technology</td>
			<td >n.a.</td>
			<td >to load the hydraulic reservoir (clean outside with a paper tissue with 70% ethanol at step 1 and 7)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tray (stainless steel)</td>
			<td >PolarWare</td>
			<td >15-248</td>
			<td >for easy transport of the fluidic culture chambers and the bioreactor from incubator to laminar flow cabinet and back (clean with a paper tissue with 70% ethanol before and after use)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tweezers</td>
			<td >Wironit</td>
			<td >4910</td>
			<td >sterile handling of individual parts (autoclave at step 1 and 7)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ultrapure water</td>
			<td >Stakpure</td>
			<td >Omniapure UV 18200002</td>
			<td >to correct for medium evaporation, mixed with aqua stabil mixed and used as hydraulic fluid. (autoclave ultrapure water at step 1)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >UV light</td>
			<td >Philips</td>
			<td >TUV 30W/G30 T8</td>
			<td >for decontamination of grafts and bioreactor parts before seeding</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a multi-cue bioreactor to evaluate the inflammatory and regenerative capacity of biomaterials under flow and stretch

El uso de biomateriales reabsorbibles para inducir la regeneración directamente en el cuerpo es una estrategia atractiva desde una perspectiva traslacional. Tales materiales inducen una respuesta inflamatoria tras la implantación, que es el impulsor de la resorción posterior del material y la regeneración de nuevos tejidos. Esta estrategia, también conocida como ingeniería de tejidos in situ, se persigue para obtener reemplazos cardiovasculares como injertos vasculares de ingeniería tisular. Tanto los procesos inflamatorios como los regenerativos están determinados por las señales biomecánicas locales en el andamio (es decir, estiramiento y esfuerzo por cizallamiento). Aquí, describimos en detalle el uso de un biorreactor desarrollado a medida que permite de manera única el desacoplamiento de la tensión de estiramiento y cizallamiento en un andamio tubular. Esto permite la evaluación sistemática y estandarizada de la capacidad inflamatoria y regenerativa de los andamios tubulares bajo la influencia de cargas mecánicas bien controladas, que demostramos sobre la base de un experimento de cocultivo dinámico utilizando macrófagos humanos y miofibroblastos. Los pasos prácticos clave en este enfoque: la construcción y configuración del biorreactor, la preparación de los andamios y la siembra de células, la aplicación y el mantenimiento del flujo de estiramiento y cizallamiento, y la recolección de muestras para el análisis, se discuten en detalle.

Este biorreactor fue desarrollado para estudiar los efectos individuales y combinados del esfuerzo de cizallamiento y el estiramiento cíclico en el crecimiento y remodelación del tejido vascular en andamios de biomateriales 3D. El diseño del biorreactor permite cultivar hasta ocho construcciones vasculares bajo diversas condiciones de carga(Figura 1A). Los constructos vasculares se colocan en una cámara de cultivo de flujo(Figura 1B)en la que tanto el estira...

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A Multi-Cue Bioreactor to Evaluate the Inflammatory and Regenerative Capacity of Biomaterials under Flow and Stretch

El objetivo de este protocolo es ejecutar un cocultivo dinámico de macrófagos humanos y miofibroblastos en andamios electrospun tubulares para investigar la regeneración de tejidos impulsada por materiales, utilizando un biorreactor que permite el desacoplamiento del esfuerzo de cizallamiento y el estiramiento cíclico.

Un biorreactor multipíca para evaluar la capacidad inflamatoria y regenerativa de los biomateriales bajo flujo y estiramiento

The use of resorbable biomaterials to induce regeneration directly in the body is an attractive strategy from a translational perspective. Such materials ...

So far, it has been really difficult to identify the cause and effect relationships between hemodynamics and vascular tissue regeneration. And this has because it's challenging to control the individual mechanical loads. This bioreactor enables us to mechanistically investigate the individual and combined effects of sheer stress and cyclic stretch on the regenerative potential of a broad variety of tissue engineered vascular grafts.Demonstrating this procedure will be Suzanne Koch, a PhD candidate in our group. And Dr.Tamar Wissing who is a postdoctoral researcher from our laboratory. To mount the electro spun scaffold onto the silicone tubing, thread a 4-0 prolene suture into one end of a piece of silicone tubing and out of the other.Make a small knot on both sides of the tube leaving approximately 10 centimeters of wire on both knots and make a third knot on top of the two. After removing a suture needle, trim the edges of the silicone tubing into a triangular shape and make a final knot at the end of the two 10 centimeter wires. Dip the electro spun scaffold in 30%ethanol and place the scaffold over one end of free suture wire.Next, gently stretch both sides of the silicone tubing and the 10 centimeter suture knot while second researcher uses tweezers with a smooth inner tip to gently slide the electro spun scaffold over the tubing. Slowly release the stretch on the silicone tubing while simultaneously smoothing the electro spun scaffold with the tweezers. And dip the scaffold and silicone tubing in ultra pure water two times.Construct the bottom compartment and make sure that the O-ring is properly placed. Place an adaptor bushing in the upper part of the bottom compartment and place the pressure conduit with holes through the bottom compartment. Lace the silicone O-ring around the lower end of the pressure conduit to prevent leakage.And screw the lower part of the bottom compartment to the upper part of the bottom compartment to secure the pressure conduit. Make sure that the lower engraved groove of the pressure conduit is approximately three to five millimeters above the edge of the adapter bushing of the bottom compartment. Pull the silicone tube with the electro spun scaffold over the pressure conduit and make a nod and the suture wire at the lower end of the electro spun scaffold, at the location of the engraved groove on the pressure conduit.Make a second nod at the opposite side to tightly secure the silicone tubing with the electro spun graft. And placing a scissor clamp equipped with a rule at the upper end of the silicone tubing, pull the scissor clamp upwards in a consistent manner and gently pull on the electric spawn scaffold to remove any wrinkles. Use a suture wire to make two knots at both ends of the scaffold at the upper engraved groove of the pressure conduit.When both knots have been made, release the scissor clamp and use a knife to remove any excess silicone tubing. Screw the nose cones on the screw thread of the pressure conduits for the samples that will be dynamically loaded. Dip the pressure conduit, tubing, and scaffold one time in 30%ethanol and two times in ultrapure water to pre-wet the setup.Place the glass tube over the pressure conduit and push gently on the bottom compartment to secure the glass tube in place. Then place the flow straightener, a silicone O-ring, and adapter bushing in the top compartment. And secure the compartment over the open end of the glass tube.Remove the male lure plug from the flow outlet, work in a sterile laminar flow cabinet. Open the white lure cap and place an ethanol soak tissue in front of the flow outlet. Deconstruct the flow culture chamber by taking off the glass tube with the top compartment.Place a vacuum pasture pipe add onto the electro spun scaffold to remove as much medium as possible. And add fibrinogen solution at a one-to-one ratio with the thrombin supplemented cell suspension. Pipette the solution up and down one time and immediately drip the solution over the full length of the scaffold.When all of the cells have been delivered, slowly move the scaffold from left to right and up and down to achieve an even distribution of the cells. When both sides of the scaffold have been seeded, carefully reconstruct the flow culture chamber by putting the glass tube and top compartment back. And place the flow culture chamber into the incubator to let the fiber solidify.To couple the bioreactor to the pump system, place the flow culture chamber on one of the eight screw threads on the bioreactor base. And place a host clip on the medium tubing. Remove the white lure cap, covering the flow inlet of the top compartment of the flow culture chamber and remove the female lure coupler of the medium tubing.Connect the medium tubing with one side of the flow inlet on the top compartment. And the other side with the flow outlet at the bottom compartment. Transfer the complete setup from the laminar flow cabinet to the incubator.And connect a fluidic units and the bioreactor base to the air pressure tubing and electric cable. Start the software and initialize the pumps. Start the medium flow for the samples one by one.Then change the strain pump parameters to the desired settings and start the strain. Monitor the stretch applied to the scaffold every other day. The monitoring of stretch and wall shear stress over longterm culture periods shows that these values can be maintained at relatively constant levels over a period of up to 20 days.After three days of hemodynamic loading, immunofluorescent staining reveals a homogenous distribution of monocyte derived macrophages and myofibroblasts throughout the scaffold. After 20 days of co-culture, cyclic stretch results in the deposition of more numerous and thicker collagen type 1 fibers. While in the combined hemodynamic load group, the cyclic stretch effect is overruled by sheer stress resulting in a less pronounced collagen type 1 deposition.After eight days of macrophage monoculture, fiber erosion and fiber cleavage are observed in all of the hemodynamic loading regimes with the most pronounced resorption observed in the static group, and the least pronounced resorption observed in the sheer stress group. Both cyclic stretch and a sheer stress impact the cytokine secretion profile of the co-culture setup. Interestingly, the combined effects of both loads show either dominance of one of the two loads or synergistic effects of both loads.Co-culture experiments also show that the mechanical environment and resulting loading dependent inflammatory environments modulate the phenotype of the myofibroblasts. Furthermore, the gene expression patterns of contractile marker alpha smooth muscle actin correlate with protein synthesis. The most important thing when performing this protocol is that's what the application of stretch, it's essential that your setup is leak-free.

Research

JoVE Journal

Engineering

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Investigación

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