Name: a multi-cue bioreactor to evaluate the inflammatory and regenerative capacity of biomaterials under flow and stretch
Uploaded: 2020-12-10T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Multi-Cue Bioreactor to Evaluate the Inflammatory and Regenerative Capacity of Biomaterials under Flow and Stretch at JoVE.com

Denna studie stöds ekonomiskt av ZonMw som en del av LSH 2Treat-programmet (436001003) och Holländska njurfonden (14a2d507). N.A.K. erkänner stöd från Europeiska forskningsrådet (851960). Vi uppmärksammar tacksamt gravitationsprogrammet "Materials Driven Regeneration", finansierat av Nederländernas organisation för vetenskaplig forskning (024.003.013).

I de studier som beskrivs i detta protokoll har primära mänskliga makrofager isolerade från perifert blod buffy coats och mänskliga myofibroblaster isolerade från saphenous ven efter födans by-pass kirurgi använts44. De buffy coats erhölls från friska, anonymiserade frivilliga som gav skriftligt informerat samtycke, som godkändes av Sanquin Research Institutional Medical Ethical Committee. Användningen av humana vena saphena-celler (HVSC) var i enlighet med "Code Proper Secondary Use of...

Den bioreaktor som beskrivs häri möjliggör systematisk utvärdering av bidrag från individen och kombinerade effekter av sax stress och cykliska stretch på inflammation och vävnad regenerering i tubular resorbable byggnadsställningar. Detta tillvägagångssätt gör det också möjligt att utföra ett stort antal analyser på kärlkonstruktioner, vilket exemplifieras i avsnittet representativa resultat. Dessa resultat visar den distinkta effekten av de olika hemodynamiska lastningsregimerna (dvs. olika kombination...

Kardiovaskulär vävnadsteknik (TE) eftersträvas som ett alternativt behandlingsalternativ till de för närvarande använda permanenta kardiovaskulära proteserna (t.ex. kärltransplantat, hjärtklaffbyten), som är suboptimala för stora kohorter av patienter1,2,3,4. Mycket eftertraktade applikationer inkluderar vävnadskonstruerade kärltransplantat (TEVGs)5,6 och hjärtklaffar (TV-apparater)7,8. Oftast använder kardiovaskulära TE-metoder resorbable biomaterial (antingen naturliga eller syntetiska) som fungerar som en lärorik byggnadsställning för den nya vävnaden som ska bildas. Bildandet av ny vävnad kan antingen konstrueras helt in vitro, genom att så ställningen med celler och odling i en bioreaktor före implantation (in vitro TE)9,10,11, eller direkt på plats, där den syntetiska byggnadsställningen implanteras utan förodling för att inducera bildandet av ny vävnad direkt i kroppen (in situ TE)12,13,14. För både in vitro- och in situ kardiovaskulära TE-metoder är framgångsrik funktionell regenerering dominerande beroende av både värdens immunsvar på den implanterade konstruktionen och lämplig biomekanisk belastning.
Vikten av biomekanisk belastning för kardiovaskulär TE är väl erkänd15. När det gäller kardiovaskulära implantat utsätts cellerna som fyller ställningen för cyklisk stretch och saxspänningar som uppstår till följd av den hemodynamiska miljön. Många studier har rapporterat den stimulerande effekten av (cyklisk) sträckning på bildandet av matriskomponenter, såsom kollagen16,17,18,19,glykosaminoglykaner (GAGs)20, och elastin21,22, av olika celltyper. Till exempel visade Huang et al. att biaxial stretch förhöjde nedfallet och organisationen av kollagen och elastin i in vitro TEVGs med hjälp av en vaskulär bioreaktor23. Medan betoningen vanligtvis ligger på stretch som den dominerande belastningen, använder dessa studier ofta flödesdrivna bioreaktorer där provet också utsätts för saxflöde. Även om relativt lite är känt om den isolerade påverkan av skjuvspänningar på vävnadsbildning och inflammation i 3D, finns vissa data tillgängliga. Till exempel visade Hinderer et al. och Eoh et al. att savflödet, förutom en 3D-byggnadsställningsmikrostruktur, var viktigt för bildandet av mogna elastin av mänskliga vaskulära glatta muskelceller i ett in vitro-modellsystem24,25. Sammantaget illustrerar dessa resultat relevansen av både cyklisk stretch och shear stress för kardiovaskulär TE.
En annan viktig avgörande faktor för framgången eller misslyckandet med TE-implantat är värdens immunsvar på det implanterade transplantatet26. Detta är särskilt viktigt för materialdrivna IN situ TE-strategier, som faktiskt förlitar sig på det akuta inflammatoriska svaret på ställningen för att kickstarta de efterföljande processerna för cellulär tillströmning och endogen vävnadsbildning och ombyggnad27. Makrofaget är en kritisk initiativtagare till funktionell vävnadsregenerering, vilket har visats av flerastudier 28,29,30. Analogt med sårläkning styrs regenereringen av vävnad av parakrina signalering mellan makrofager och vävnadsproducerande celler som fibroblaster och myofibroblaster31,32,33. Förutom att samordna ny vävnad nedfall, makrofager är inblandade i aktiv resorption av främmande byggnadsställning material34,35. Som sådan har in vitro-makrofagsvaret på ett biomaterial identifierats som en prediktiv parameter för in vivo-framgång avimplantat 36,37,38.
Makrofatsvaret på en implanterad byggnadsställning är beroende av byggnadsställningar design funktioner som materialkomposition och mikrostruktur35,39,40. Förutom byggnadsställningar påverkas makrofatsvaret på en byggnadsställning och deras crosstalk med myofibroblaster också av hemodynamiska belastningar. Till exempel visade sig cyklisk sträcka vara en viktig modulator av makrofag fenotyp41,42,43,44 och utsöndring av cytokiner43,44,45,46 i 3D elektrospunställningar. Med hjälp av ett samkultursystem av makrofager och vaskulär glatt muskelceller visade Battiston et al. att förekomsten av makrofager ledde till ökade nivåer av elastin och GAGs och att måttliga nivåer av cyklisk stretch (1,07-1,10) stimulerade nedfallet av kollagen I och elastin47. I tidigare arbeten har vi visat att savstress är en viktig determinant för monocytrekrytering till 3D-elektrospunställningar48,49, och att både shear stress och cyklisk stretch påverkar parakrin signalering mellan mänskliga monocyter och mesenchymala stromal celler50. Fahy et al. visade att savflödet ökade utsöndring av proinflammatoriska cytokiner med mänskliga monocyter51.
Sammantaget visar ovanstående bevis att en adekvat förståelse för och kontroll över hemodynamiska belastningar är avgörande för kardiovaskulär TE, och att det är viktigt att överväga det inflammatoriska svaret för att uppnå detta. Många bioreaktorer har beskrivits tidigare för in vitro52,53 ,54,55,56,57,58 eller ex vivo59,60,61 kultur av kardiovaskulära vävnader. Alla dessa system är dock utformade för att efterlikna de fysiologiska hemodynamiska belastningsförhållandena så mycket som möjligt. Även om detta är mycket värdefullt för att skapa kardiovaskulära vävnader in vitro eller upprätthålla ex vivo kulturer, tillåter sådana system inte systematiska studier av de enskilda effekterna av enskilda signaler. Detta beror på att tillämpningen av både cyklisk stretch och savspänning i dessa bioreaktorer drivs av samma trycksatta flöde, som i sig länkar dem. Medan mikrosystem som möjliggör noggrann mekanisk manipulering med flera signaler har beskrivits för 2D-substrat62 eller 3D-hydrogelinställningar63,64, tillåter sådana inställningar inte införlivande av elastomeric 3D biomaterialställningar.
Här presenterar vi tillämpningen av ett rörformigt bioreaktorsystem som unikt möjliggör frikoppling av saxstress och cyklisk stretch och hjälper till att mekanistiskt undersöka deras individuella och kombinerade effekter. Detta system möjliggör testning av ett brett utbud av vävnadskonstruerade kärltransplantat (t.ex. syntetiskt eller naturligt ursprung, olika mikroarkitektur, olika porositeter). För att effektivt frikoppla tillämpningen av savspänning och sträckning är de viktigaste begreppen som bioreaktorn använder (1) separation av kontrollen av savspänning och sträckning med hjälp av distinkta pumpsystem och (2) stimulering av byggnadsställningarna på ett "utifrån och ut"-sätt med beräkningsdrivna dimensioner. Flödet appliceras på den rörformiga byggnadsställningens utsida genom användning av en flödespump, medan byggnadsställningens omkretssträcka induceras genom att utöka ett silikonrör på vilket ställningen är monterad genom användning av en separat belastningspump. Dimensionerna på silikonröret och glasröret som innehåller konstruktionen väljs noggrant och valideras med hjälp av simuleringar av beräkningsvätskans dynamik, för att säkerställa att savspänningen på ställningen (på grund av flöde) och den cirkumferentiella sträckan (på grund av rörexpansion) inte påverkar varandra nämnvärt. Denna inifrån och ut-design har flera praktiska skäl. Om stretch appliceras av det luminala vätsketrycket (liknar fysiologisk belastning) kräver det i sig att provdesignen är läckagefri. Dessutom skulle det tryck som krävs för att sträcka provet helt bestämmas av provets styvhet, som kan variera mellan proverna och inom ett prov över tiden, vilket gör det svårt att kontrollera sträckan. Denna bioreaktor monterar det vävnadskonstruerade transplantatet runt ett silikonrör och möjliggör väggskjuvspänning (WSS) på transplantatets yttervägg och pressar transplantatet från insidan. På så sätt kan lika belastningsförhållanden mellan prover och inom prover över tid säkerställas, och dessutom får proverna vara läckande, vilket är vanligt för porösa kärlställningar19. Denna inifrån och ut bioreaktor är särskilt avsedd för systematiska studier på effekterna av sax och/eller stretch, snarare än konstruktion av ett inhemskt liknande blodkärl in vitro, för vilket traditionella vaskulär bioreaktorinställningar är mer lämpliga. Se figur 1A–B för bioreaktordesignritningarna och motsvarande tabell 1 för en funktionell beskrivning och motivering bakom bioreaktorns huvudkomponenter.
Användningen av bioreaktorn demonstreras på grundval av en serie nyligen genomförda studier av vår grupp där vi undersökte de individuella och kombinerade influenserna av savstress och cyklisk sträckning på inflammation och vävnadsbildning i resorbable elektrospunställningar för in situ kardiovaskulärvävnad 19,43,44. För detta ändamål använde vi mänskliga makrofager och myofibroblaster antingen i mono- eller samkultur för att simulera de olika faserna av in situ regenerativ kaskad. Vi har visat att cytokin utsöndring av mänskliga makrofager påverkas tydligt av både cyklisk stretch och shear stress, påverkar matris nedfall och organisation av mänskliga myofibroblaster i dessa byggnadsställningar, både via parakrina signalering och direkt kontakt19,43,44. Dessa studier visade särskilt att vid kombinerad applicering av saxstress och stretch domineras effekterna på vävnadsbildning och inflammation antingen av en av de två belastningarna, eller det finns synergistiska effekter av båda belastningarna. Dessa resultat illustrerar relevansen av frikoppling av båda belastningarna för att få en bättre förståelse för den mekaniska miljöns bidrag till TE-processer. Denna förståelse kan tillämpas för att systematiskt optimera byggnadsställningars designparametrar i relevanta hemodynamiska lastningsregimer. Dessutom kan mekanistiska data från sådana välkontrollerade miljöer fungera som indata för numeriska modeller som utvecklas för att förutsäga kursen för in situ-vävnadsrenovering, som nyligen rapporterades för TEVGs65 eller TEHVs66, för att ytterligare förbättra prediktiv kapacitet.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >advanced Dulbecco&#8217;s modified EagleMedium (aDMEM)</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >12491-015</td>
			<td >cell culture medium for fibroblasts</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Aqua Stabil</td>
			<td >Julabo</td>
			<td >8940012</td>
			<td >prevent microorganism growth in bioreactor-hydraulic reservoir</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Bovine fibrinogen</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >F8630</td>
			<td >to prepare fibrinogen gel to seed the cells on the electrospun scaffold</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Bovine thrombin</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >T4648</td>
			<td >to prepare fibrinogen gel to seed the cells on the electrospun scaffold</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Centrifuge</td>
			<td >Eppendorf</td>
			<td >5804</td>
			<td >to spin down cells and conditioned medium</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Clamp scissor - &#34;kelly forceps&#34;</td>
			<td >Almedic</td>
			<td >P-422</td>
			<td >clamp the silicone tubing and apply pre-stretch to the scaffold so the scaffold can be sutured into the engraved groove (autoclave at step 1, step 7)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CO2 cell culture incubators</td>
			<td >Sanyo</td>
			<td >MCO-170AIC-PE</td>
			<td >for cell culturing</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Compressed air reservoir</td>
			<td >Festo</td>
			<td >CRVZS-5</td>
			<td >smoothing air pressure fluctuations and create time delays for pressure build-up</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Custom Matlab script to calculate the maximum stretches</td>
			<td >Matlab</td>
			<td >R2017. The Mathworks, Natick, MA</td>
			<td >calculate the minimum and maximum outer diameter of the electrospun scaffold</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Data acquisition board</td>
			<td >National Instruments</td>
			<td >BNC-2090</td>
			<td >data processing in between amplifier system and computer</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ethanol</td>
			<td >VWR</td>
			<td >VWRK4096-9005</td>
			<td >to keep sterile working conditions</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fetal bovine calf serum (FBS)</td>
			<td >Greiner</td>
			<td >758087</td>
			<td >cell culture medium supplement; serum-supplement</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Flow culture chamber compartments, consisting of a pressure conduit with engraved grooves and small holes to apply pressure on silicone tubing, a screw thread, nose cone, top compartment with flow inlet and bottom compartment flow outlet, adapter bushing</td>
			<td >Custom made, Department of Biomedical Engineering, Eindhoven University of Technology</td>
			<td >n.a.</td>
			<td >flow culture chamber compartments (autoclave at step 1, step 7)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Glass Pasteur pipet</td>
			<td >Assistant</td>
			<td >HE40567002</td>
			<td >apply vacuum on electrospun scaffold (autoclave at step 1)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Glass tubes of the flow culture chamber</td>
			<td >Custon made, Equipment &#38; Prototype Center, Eindhoven University of Technology</td>
			<td >n.a.</td>
			<td >part of the flow culture chamber (clean and store in 70% ethanol, at step 1 and 7)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >GlutaMax</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >35050061</td>
			<td >cell culture medium amino acid supplement, minimizes ammonia build-up</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >High speed camera</td>
			<td >MotionScope</td>
			<td >M-5</td>
			<td >to monitor the stretch during culture; time-lapse photographs of the scaffolds are captured at a frequency of 30 Hz for 6 sec (i.e. 3 stretch cycles)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >High speed camera lens - Micro-NIKKOR 55mm f/2.8 - lens</td>
			<td >Nikon</td>
			<td >JAA616AB</td>
			<td >to monitor the stretch during culture; time-lapse photographs of the scaffolds are captured at a frequency of 30 Hz for 6 sec (i.e. 3 stretch cycles)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hose clip</td>
			<td >ibidi GmbH</td>
			<td >10821</td>
			<td >block medium flow (autoclave at step 1, step 7)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hydraulic reservoir with 8 screw threads for 8 flow culture chambers</td>
			<td >Custom made, Department of Biomedical Engineering, Eindhoven University of Technology</td>
			<td >n.a.</td>
			<td >to apply pressure to the silicone mounted constructs (clean outside with a paper tissue with 70% ethanol, rinse reservoir with 70% ethanol followed by demi water, at step 1 and 7)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ibidi pump system (8x) including ibidi pump, PumpControl software, fluidic unit, perfusion set (medium tubing), air pressure tubing, drying bottles with orange silica beads</td>
			<td >ibidi GmbH</td>
			<td >10902</td>
			<td >set up used to control the flow in the flow culture chambers. Note 1: the ibidi pumps were modified by the manufacturer to enable 200 mbar capacity. Note 2: can be replaced by pump system of other manufacturer, as long as same flow regimes can be applied.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Knives (no.10 sterile blades, individual foil pack) and scalpel handle (stainless steel, individually wrapped)</td>
			<td >Swann Morton</td>
			<td >0301; 0933</td>
			<td >to cut the silicone tubing in the correct size for the scaffold and to cut the suture material</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >LabVIEW Software</td>
			<td >National Instruments</td>
			<td >version 2018</td>
			<td >to control the stretch applied to the scaffolds</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Laminar flow biosafety cabinet with UV light</td>
			<td >Labconco</td>
			<td >302310001</td>
			<td >to ensure sterile working conditions. The UV is used to decontaminate everything that cannot be autoclaved, or touched after autoclaving</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Large and small petri dishes</td>
			<td >Greiner</td>
			<td >664-160</td>
			<td >for sterile working conditions</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >L-ascorbic acid 2-phosphate (vitamin C)</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >A8960</td>
			<td >cell culture medium supplement, important for collagen production</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >LED light cold source KL2500</td>
			<td >Zeiss</td>
			<td >Schott AG</td>
			<td >to aid in visualization for the time lapse of the scaffolds during monitoring of the stretch</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Luer (female and male) locks and connectors, white luer caps</td>
			<td >ibidi GmbH</td>
			<td >various, see (https://ibidi.com/26-flow-accessories)</td>
			<td >to close or connect parts of the bioreactor and the ibidi pump (autoclave at step 1, step 7)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Measuring amplifier (PICAS)</td>
			<td >PEEKEL instruments B.V.</td>
			<td >n.a.</td>
			<td >to amplify the signal from the pressure sensor and feedback to LabView</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Medium reservoir (large syringes 60 mL) and reservoir holders</td>
			<td >ibidi GmbH</td>
			<td >10974</td>
			<td >medium reservoir (autoclave at step 1, step 7)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Medium tubing with 4.25 mm outer diameter and 1 mm inner diameter</td>
			<td >Rubber BV</td>
			<td >1805</td>
			<td >to allow for a larger flow rate, the ibidi medium tubing with larger diameter is used. Note: the part of medium tubing guided through the fluidic unit valves are the same as the default ibidi medium tubing</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Motion Studio Software</td>
			<td >Idtvision</td>
			<td >2.15.00</td>
			<td >to make the high speed time lapse images for stretch monitoring</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Needle (19G)</td>
			<td >BD Microlance</td>
			<td >301700</td>
			<td >together with thin flexible tubing used to fill the hydraulic reservoir with ultrapure water without adding air bubbles</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Needle driver</td>
			<td >Adson</td>
			<td >2429218</td>
			<td >to handle the needle of the nylon suture through the silicone tube (autoclave at step 1, step 7)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Paper tissues</td>
			<td >Kleenex</td>
			<td >38044001</td>
			<td >for cleaning of the equipment with 70% ethanol</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Parafilm</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >P7793-1EA</td>
			<td >quick fix if leakage occurs</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Penicillin/streptomycin (P/S)</td>
			<td >Lonza</td>
			<td >DE17-602E</td>
			<td >cell culture medium supplement; prevent bacterial contamination</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >P4417-100TAB</td>
			<td >for storage and washing steps (autoclave at step 1)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Plastic containers (60 mL) with red screw caps</td>
			<td >Greiner</td>
			<td >206202</td>
			<td >to prepare the fibrinogen solution</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pneumatic cylinder</td>
			<td >Festo</td>
			<td >AEVC-20-10-I-P</td>
			<td >to actuate the Teflon bellow (clean with a paper tissue with 70% ethanol at step 1 and 7)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Polycaprolactone bisurea (PCL-BU) tubular scaffolds (3 mm inner diameter, 200 &#181;m wall thickness, 20 mm length)</td>
			<td >SyMO-Chem, Eindhoven, The Netherlands</td>
			<td >n.a.</td>
			<td >produced using electrospinning from 15% (w/w) chloroform (Sigma; 372978) polymer solutions. See Van Haaften et al Tissue Engineering Part C (2018) for more details</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pressure conduit without holes (for static control)</td>
			<td >Custom made, Department of Biomedical Engineering, Eindhoven University of Technology</td>
			<td >n.a.</td>
			<td >to mount electrospun tubes on silicon tubing (autoclave at step 1, step 7)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pressure sensor and transducer</td>
			<td >BD</td>
			<td >TC-XX and P 10 EZ</td>
			<td >the air pressure going to the pneumatic actuated pump is raised until it reaches the set pressure</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Proportional air pressure control valve and pressure sensor</td>
			<td >Festo</td>
			<td >MPPES-3-1/8-2-010, 159596</td>
			<td >provides compressed air to the pneumatic actuated pump</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI-1640)</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >A1049101</td>
			<td >cell culture medium for monocyte/macrophage</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Safe lock Eppendorf tubes (1.5 mL)</td>
			<td >Eppendorf</td>
			<td >30120086</td>
			<td >multiple applications (autoclave at step 1)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sodium dodecyl sulfate solution 20%</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >5030</td>
			<td >Used to clean materials, at a concentration of 0.1%.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Silicone O-rings</td>
			<td >Technirub</td>
			<td >1250S</td>
			<td >to prevent leakage (autoclave at step 1, step 7)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Silicone tubing (2.8 mm outer diameter, 400 um wall thickness)</td>
			<td >Rubber BV</td>
			<td >1805</td>
			<td >to mount the electrospun tubes on the pressure conduits (autoclave at step 1)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sterile tube (15 mL)</td>
			<td >Falcon</td>
			<td >352095</td>
			<td >multiple applications</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Suture, 5-0 prolene with pre-attached taper point needle</td>
			<td >Ethicon, Johnson&#38;Johnson</td>
			<td >EH7404H</td>
			<td >Prolene suture wire 5-0 (75cm length, TF taper point needle, 1/2 circle, 13 mm needle length)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Syringe (24 mL)</td>
			<td >B. Braun Melsungen AG</td>
			<td >2057932</td>
			<td >to add the ultrapure water or medium to the hydraulic reservoir or flow culture chamber</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Syringe filter (0.2 &#181;m)</td>
			<td >Satorius</td>
			<td >17597-K</td>
			<td >to filter the fibrinogen solution</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >T150 cell culture flask with filter cap</td>
			<td >Nunc</td>
			<td >178983</td>
			<td >to degas culture medium</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >T75 Cell culture flask with filter cap</td>
			<td >Nunc</td>
			<td >156499</td>
			<td >to culture static control samples</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Teflon bellow</td>
			<td >Custom made, Department of Biomedical Engineering, Eindhoven University of Technology</td>
			<td >n.a.</td>
			<td >to load the hydraulic reservoir (clean outside with a paper tissue with 70% ethanol at step 1 and 7)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tray (stainless steel)</td>
			<td >PolarWare</td>
			<td >15-248</td>
			<td >for easy transport of the fluidic culture chambers and the bioreactor from incubator to laminar flow cabinet and back (clean with a paper tissue with 70% ethanol before and after use)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tweezers</td>
			<td >Wironit</td>
			<td >4910</td>
			<td >sterile handling of individual parts (autoclave at step 1 and 7)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ultrapure water</td>
			<td >Stakpure</td>
			<td >Omniapure UV 18200002</td>
			<td >to correct for medium evaporation, mixed with aqua stabil mixed and used as hydraulic fluid. (autoclave ultrapure water at step 1)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >UV light</td>
			<td >Philips</td>
			<td >TUV 30W/G30 T8</td>
			<td >for decontamination of grafts and bioreactor parts before seeding</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a multi-cue bioreactor to evaluate the inflammatory and regenerative capacity of biomaterials under flow and stretch

Användningen av resorbable biomaterial för att inducera regenerering direkt i kroppen är en attraktiv strategi ur ett translationellt perspektiv. Sådana material inducerar ett inflammatoriskt svar vid implantation, vilket är drivkraften för efterföljande resorption av materialet och regenerering av ny vävnad. Denna strategi, även känd som in situ vävnadsteknik, eftersträvas för att erhålla kardiovaskulära ersättningar såsom vävnadskonstruerade vaskulär ympkvistar. Både de inflammatoriska och regenerativa processerna bestäms av de lokala biomekaniska signalerna på ställningen (dvs. stretch och shear stress). Här beskriver vi i detalj användningen av en specialutvecklad bioreaktor som unikt möjliggör frikoppling av sträck- och savspänning på en rörformig byggnadsställning. Detta möjliggör systematisk och standardiserad utvärdering av den inflammatoriska och regenerativa kapaciteten hos rörformiga byggnadsställningar under påverkan av välkontrollerade mekaniska belastningar, vilket vi demonstrerar på grundval av ett dynamiskt samkulturexperiment med hjälp av mänskliga makrofager och myofibroblaster. De viktigaste praktiska stegen i detta tillvägagångssätt - konstruktion och inrättandet av bioreaktorn, beredning av byggnadsställningar och cellfröning, applicering och underhåll av sträck- och saxflöde och provskörd för analys - diskuteras i detalj.

Denna bioreaktor utvecklades för att studera de individuella och kombinerade effekterna av sax stress och cykliska stretch på vaskulär vävnad tillväxt och ombyggnad i 3D biomaterial byggnadsställningar. Utformningen av bioreaktorn möjliggör odling av upp till åtta kärlkonstruktioner under olika belastningsförhållanden(figur 1A). Kärlkonstruktionerna placeras i en flödeskulturkammare (figur 1B) där både den omkretssträcka och WSS kan styras obero...

Watch this Scientific Journal Video about A Multi-Cue Bioreactor to Evaluate the Inflammatory and Regenerative Capacity of Biomaterials under Flow and Stretch at JoVE.com

A Multi-Cue Bioreactor to Evaluate the Inflammatory and Regenerative Capacity of Biomaterials under Flow and Stretch

Målet med detta protokoll är att genomföra en dynamisk samkultur av mänskliga makrofager och myofibroblaster i rörformiga elektrospunställningar för att undersöka materialdriven vävnadsregenerering, med hjälp av en bioreaktor som möjliggör frikoppling av saxstress och cyklisk stretch.

En multi-cue bioreaktor för att utvärdera biomaterialens inflammatoriska och regenerativa kapacitet under flöde och sträckning

The use of resorbable biomaterials to induce regeneration directly in the body is an attractive strategy from a translational perspective. Such materials ...

So far, it has been really difficult to identify the cause and effect relationships between hemodynamics and vascular tissue regeneration. And this has because it's challenging to control the individual mechanical loads. This bioreactor enables us to mechanistically investigate the individual and combined effects of sheer stress and cyclic stretch on the regenerative potential of a broad variety of tissue engineered vascular grafts.Demonstrating this procedure will be Suzanne Koch, a PhD candidate in our group. And Dr.Tamar Wissing who is a postdoctoral researcher from our laboratory. To mount the electro spun scaffold onto the silicone tubing, thread a 4-0 prolene suture into one end of a piece of silicone tubing and out of the other.Make a small knot on both sides of the tube leaving approximately 10 centimeters of wire on both knots and make a third knot on top of the two. After removing a suture needle, trim the edges of the silicone tubing into a triangular shape and make a final knot at the end of the two 10 centimeter wires. Dip the electro spun scaffold in 30%ethanol and place the scaffold over one end of free suture wire.Next, gently stretch both sides of the silicone tubing and the 10 centimeter suture knot while second researcher uses tweezers with a smooth inner tip to gently slide the electro spun scaffold over the tubing. Slowly release the stretch on the silicone tubing while simultaneously smoothing the electro spun scaffold with the tweezers. And dip the scaffold and silicone tubing in ultra pure water two times.Construct the bottom compartment and make sure that the O-ring is properly placed. Place an adaptor bushing in the upper part of the bottom compartment and place the pressure conduit with holes through the bottom compartment. Lace the silicone O-ring around the lower end of the pressure conduit to prevent leakage.And screw the lower part of the bottom compartment to the upper part of the bottom compartment to secure the pressure conduit. Make sure that the lower engraved groove of the pressure conduit is approximately three to five millimeters above the edge of the adapter bushing of the bottom compartment. Pull the silicone tube with the electro spun scaffold over the pressure conduit and make a nod and the suture wire at the lower end of the electro spun scaffold, at the location of the engraved groove on the pressure conduit.Make a second nod at the opposite side to tightly secure the silicone tubing with the electro spun graft. And placing a scissor clamp equipped with a rule at the upper end of the silicone tubing, pull the scissor clamp upwards in a consistent manner and gently pull on the electric spawn scaffold to remove any wrinkles. Use a suture wire to make two knots at both ends of the scaffold at the upper engraved groove of the pressure conduit.When both knots have been made, release the scissor clamp and use a knife to remove any excess silicone tubing. Screw the nose cones on the screw thread of the pressure conduits for the samples that will be dynamically loaded. Dip the pressure conduit, tubing, and scaffold one time in 30%ethanol and two times in ultrapure water to pre-wet the setup.Place the glass tube over the pressure conduit and push gently on the bottom compartment to secure the glass tube in place. Then place the flow straightener, a silicone O-ring, and adapter bushing in the top compartment. And secure the compartment over the open end of the glass tube.Remove the male lure plug from the flow outlet, work in a sterile laminar flow cabinet. Open the white lure cap and place an ethanol soak tissue in front of the flow outlet. Deconstruct the flow culture chamber by taking off the glass tube with the top compartment.Place a vacuum pasture pipe add onto the electro spun scaffold to remove as much medium as possible. And add fibrinogen solution at a one-to-one ratio with the thrombin supplemented cell suspension. Pipette the solution up and down one time and immediately drip the solution over the full length of the scaffold.When all of the cells have been delivered, slowly move the scaffold from left to right and up and down to achieve an even distribution of the cells. When both sides of the scaffold have been seeded, carefully reconstruct the flow culture chamber by putting the glass tube and top compartment back. And place the flow culture chamber into the incubator to let the fiber solidify.To couple the bioreactor to the pump system, place the flow culture chamber on one of the eight screw threads on the bioreactor base. And place a host clip on the medium tubing. Remove the white lure cap, covering the flow inlet of the top compartment of the flow culture chamber and remove the female lure coupler of the medium tubing.Connect the medium tubing with one side of the flow inlet on the top compartment. And the other side with the flow outlet at the bottom compartment. Transfer the complete setup from the laminar flow cabinet to the incubator.And connect a fluidic units and the bioreactor base to the air pressure tubing and electric cable. Start the software and initialize the pumps. Start the medium flow for the samples one by one.Then change the strain pump parameters to the desired settings and start the strain. Monitor the stretch applied to the scaffold every other day. The monitoring of stretch and wall shear stress over longterm culture periods shows that these values can be maintained at relatively constant levels over a period of up to 20 days.After three days of hemodynamic loading, immunofluorescent staining reveals a homogenous distribution of monocyte derived macrophages and myofibroblasts throughout the scaffold. After 20 days of co-culture, cyclic stretch results in the deposition of more numerous and thicker collagen type 1 fibers. While in the combined hemodynamic load group, the cyclic stretch effect is overruled by sheer stress resulting in a less pronounced collagen type 1 deposition.After eight days of macrophage monoculture, fiber erosion and fiber cleavage are observed in all of the hemodynamic loading regimes with the most pronounced resorption observed in the static group, and the least pronounced resorption observed in the sheer stress group. Both cyclic stretch and a sheer stress impact the cytokine secretion profile of the co-culture setup. Interestingly, the combined effects of both loads show either dominance of one of the two loads or synergistic effects of both loads.Co-culture experiments also show that the mechanical environment and resulting loading dependent inflammatory environments modulate the phenotype of the myofibroblasts. Furthermore, the gene expression patterns of contractile marker alpha smooth muscle actin correlate with protein synthesis. The most important thing when performing this protocol is that's what the application of stretch, it's essential that your setup is leak-free.

Research

JoVE Journal

Engineering

Measuring Material Microstructure Under Flow Using 1-2 Plane Flow-Small Angle Neutron Scattering

Mätning Material Mikro Under Flow Använda 1-2 Plane Flow-Small Angle Neutron Scattering

A new small-angle neutron scattering (SANS) sample environment optimized for studying the microstructure of complex fluids under simple shear flow is ...

Experimental Protocol to Investigate Particle Aerosolization of a Product Under Abrasion and Under Environmental Weathering

Experimentellt protokoll för att undersöka partikel aerosolbildning av en produkt under nötning och enligt miljö Vittring

The present article presents an experimental protocol to investigate particle aerosolization of a product under abrasion and under environmental ...

Design and Use of a Full Flow Sampling System (FFS) for the Quantification of Methane Emissions

Design and Use of a Full Flow Sampling System FFS for the Quantification of Methane Emissions

Utformning och användning av en fullflödesprovtagningssystemet (FFS) för kvantifiering av metanutsläpp

The use of natural gas continues to grow with increased discovery and production of unconventional shale resources. At the same time, the natural gas ...

A Robotic Platform to Study the Foreflipper of the California Sea Lion

En Robotic plattform för att studera Foreflipper i Kalifornien sjölejon

The California sea lion (Zalophus californianus), is an agile and powerful swimmer. Unlike many successful swimmers (dolphins, tuna), they generate most ...

Solvent Bonding for Fabrication of PMMA and COP Microfluidic Devices

Lösningsmedelsbindning för framställning av PMMA och COP Mikrofluidikanordningar

Thermoplastic microfluidic devices offer many advantages over those made from silicone elastomers, but bonding procedures must be developed for each ...

In Situ Visualization of the Phase Behavior of Oil Samples Under Refinery Process Conditions

In Situ Visualization of the Phase Behavior of Oil Samples Under Refinery Process Conditions

In Situ Visualisering av fasbeteende av oljeprover under raffineringsprocessen Villkor

To help address production issues in refineries caused by the fouling of process units and lines, we have developed a setup as well as a method to ...

Scanning Light Scattering Profiler (SLPS) Based Methodology to Quantitatively Evaluate Forward and Backward Light Scattering from Intraocular Lenses

Scanning Light Scattering Profiler SLPS Based Methodology to Quantitatively Evaluate Forward and Backward Light Scattering from Intraocular Lenses

Scanning Light Scattering Profiler (SLPS) -baserad metodik för att kvantitativt utvärdera framåt och bakåtljusstrålning från intrakokulära linser

The scanning light scattering profiler (SLSP) methodology has been developed for the full-angle quantitative evaluation of forward and backward light ...

A Novel Biaxial Testing Apparatus for the Determination of Forming Limit under Hot Stamping Conditions

A Novel Biaxial testapparat för bestämning av Forming Limit enligt varmpressning Villkor

The hot stamping and cold die quenching process is increasingly used to form complex shaped structural components of sheet metals. Conventional ...

Microfluidic Imaging Flow Cytometry by Asymmetric-detection Time-stretch Optical Microscopy (ATOM)

Microfluidic Imaging Flow Cytometry by Asymmetric-detection Time-stretch Optical Microscopy ATOM

Mikrofluidisk Imaging Flödescytometri genom Asymmetrisk Detektering Tidssträckning Optisk Mikroskopi (ATOM)

Scaling the number of measurable parameters, which allows for multidimensional data analysis and thus higher-confidence statistical results, has been the ...

Flow-assisted Dielectrophoresis: A Low Cost Method for the Fabrication of High Performance Solution-processable Nanowire Devices

Flöde-assisted Dielectrophoresis: En låg kostnad metod för tillverkning av högpresterande lösning-bearbetningsbar nanotråd enheter

Flow-assisted dielectrophoresis (DEP) is an efficient self-assembly method for the controllable and reproducible positioning, alignment, and selection of ...