Name: studying tgf-&#946; signaling and tgf-&#946;-induced epithelial-to-mesenchymal transition in breast cancer and normal cells
Uploaded: 2020-10-27T14:30:00
Duration: 6 min 54 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Studying TGF-Î² Signaling and TGF-Î²-induced Epithelial-to-mesenchymal Transition in Breast Cancer and Normal Cells at JoVE.com

Wij erkennen de steun van de Chinese Scholarship Council (CSC) aan J.Z. en Cancer Genomics Centre Netherlands (CGC. NL) naar P.t.D.

1. Analyse van TGF-β-geïnduceerde SMAD2 fosforylering met behulp van westerse vlekken
OPMERKING: Premalignant menselijke borst MCF10A-Ras cellen werden gebruikt als een voorbeeld om TGF-β signalering reacties te onderzoeken33. In principe zijn de hieronder beschreven methoden ook van toepassing op andere TGF-β-responsieve cellijnen.
<ol><li>Kweek de borsteperiële cellijn MCF10A-Ras bij 37 °C in Dulbecco's gemodificeerde Eagle's medium (DMEM)/F12 met L-glutamine met 5% paardenserum, 20 ng/ml epidermale groeifactor (EFG), 10 mg/ml insuline, 100 ng/ml cholera-enterotoxine, 0,5 mg/ml hydrocortison en 1:100 penicilline-streptomycine (Pen-Strep).</li>
	<li>Probeer MCF10A-Ras cellen met 1 ml van 0,25% trypsine-EDTA gedurende 1 minuut en tel levensvatbare cellen met behulp van een celteller.</li>
	<li>Zaadcellen in 6-put platen met een dichtheid van 5×105 cellen/put.</li>
	<li>Behandel na nachtelijke groei cellen met TGF-β (5 ng/ml) of ligandbuffer (4 mM HCl, 0,1% vetzuurvrije runderserumalbumine (BSA)) gedurende 1 uur en verwijder vervolgens het kweekmedium en was de cellen voorzichtig twee keer met 1 ml fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).</li>
	<li>Koel cellen in 6-putplaten op ijs en voeg 150 μL voorgekoelde radio-immuunneerslagtest (RIPA) lysisbuffer (150 mM NaCl, 0,1% Triton X-100, 0,5% natriumdeoxycholaat, 0,1% SDS, 50 mM Tris-HCl pH 8,0 en vers toegevoegde mini proteaseremmercocktail). Laat de lysis 10 minuten op het ijs staan.</li>
	<li>Schraap hechtcellen van de schaal met behulp van een plastic celschraper en breng de celsuspensie voorzichtig over in een voorgekoelde microcentrifugebuis.</li>
	<li>Centrifugeer de cel gedurende 10 minuten bij 150 centrifugaalkracht (x g) bij 4 °C en breng het supernatant over in een verse microcentrifugebuis van 1,5 ml.</li>
	<li>Meet de eiwitconcentratie met behulp van een wasmiddel compatibele (DC) eiwittestkit.</li>
	<li>Laad 30 μg eiwit uit elk monster op een 10% natrium dodecylsulfaat polyacrylamide gel elektroforese (SDS-PAGE) gel en voer de gel gedurende 1,5-2 uur uit bij een spanning van 100 V.</li>
	<li>Breng de eiwitten van de gel over naar een 45-μm polyvinylideendifluoride (PVDF) membraan bij een spanning van 110 V gedurende 1-1,5 uur.</li>
	<li>Breng het PVDF-membraan over in een geschikte container met de eiwitzijde (de kant die naar de gel gericht was) omhoog en spoel het membraan kort af in gedestilleerd water.</li>
	<li>Gooi het water weg, voeg Ponceau S-oplossing toe en leg het membraan 1-2 minuten op een schommelplatform.</li>
	<li>Bevlek het membraan met gedestilleerd water door het snel te spoelen en vervolgens 1 minuut te wassen.</li>
	<li>Plaats vervolgens het PVDF-membraan op een lichtbak en maak een foto om te controleren op gelijke totale eiwitbelastingen.</li>
	<li>Was het membraan met Tris-gebufferde zoutoplossing met Tween 20 (TBST, 20 mM Tris-HCl, pH 7,4, 150 mM NaCl en 0,1% Tween 20) totdat er geen zichtbare vlekken zijn.</li>
	<li>Plaats het membraan in de blokkerende buffer (5% magere melk in TBST-oplossing) en incubeer het gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Was het membraan twee keer met TBST.</li>
	<li>Incubeer het membraan met primaire antilichamen tegen fosfo-SMAD2 (p-SMAD2; 1:1000, zelfgemaakt 34), totaal SMAD2/3 1:1000 en glyceraldehyde 3-fosfaatdehydrogenase (GAPDH; 1:1000), 's nachts bij 4 °C.</li>
	<li>Was het membraan twee keer met TBST en incubeer het membraan gedurende 2 uur met een secundair antilichaam tegen konijn of muis (1:5000).</li>
	<li>Incubeer het PVDF-membraan gedurende 30 seconden met westers ECL-substraat en detecteer het signaal met behulp van een beeldvormingssysteem.</li>
	<li>Herhaal de experimenten minstens drie keer om biologische drievouden te verkrijgen.</li>
</ol>2. Analyse van TGF-β-geïnduceerde SMAD3-afhankelijke transcriptionele reacties
<ol><li>Voer de SMAD3/SMAD4-afhankelijke CAGA12-luciferase transcriptional reporter assay uit.<ol>
<li>Kweek en trypsinize MCF10A-Ras cellen zoals beschreven in Stap 1. Zaadcellen in 24-putplaten op 5×104 cellen/put en laat de cellen 's nachts hechten.</li>
		<li>De dag na het zaaien, cotransfecteer de cellen in elke put met 100 ng van de TGF-β/SMAD3-inducible (CAGA)12 luciferase transcriptional reporter construct35 and 80 ng of the β-galactosidase expression construct using polyethylenimine (PEI). De transfectie van β-galactosidase wordt gebruikt om verschillen in transfectie-efficiëntie tussen verschillende putten te normaliseren. Stel elke experimentele groep in drievoud in.</li>
		<li>Na 24 uur incubatie verhongeren cellen met serumvrije DMEM-hoge glucose en voegen 6 uur later TGF-β (5 ng/ml) of ligandbuffer (4 mM HCl, 0,1% BSA) toe als voertuigcontrole aan de cellen.</li>
		<li>Na nog eens 24 uur incubatie, was cellen twee keer met voorverwarmde PBS.</li>
		<li>Voeg 120 μL/well 1× lysisbuffer toe en schud de plaat gedurende 20 minuten zachtjes bij 4 °C.</li>
		<li>Breng 30 μL lysaat over naar elke put van een 96-putige witte assay microplaat om luciferaseactiviteit te meten met behulp van een luminometer.</li>
		<li>Breng 50 μL lysaat over naar elke put van een 96-put transparante plaat om β-galactosidase-activiteit te meten.</li>
		<li>Normaliseer de luciferaseactiviteit tot de β-galactosidase-activiteit en herhaal de experimenten minstens drie keer om biologische drievouden te verkrijgen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Analyseer de expressie van TGF-β doelgenen met behulp van kwantitatieve real-time-polymerasekettingreactie (qRT-PCR).<ol>
<li>Kweek en trypsinize MCF10A-Ras cellen zoals beschreven in Stap 1. Zaadcellen in 6-putplaten op 5×105 cellen/put en laat de cellen 's nachts hechten.</li>
		<li>Behandel cellen met TGF-β (5 ng/ml) of ligandbuffer (4 mM HCl, 0,1% BSA) gedurende 6 uur en was de cellen vervolgens tweemaal met 1 ml PBS.</li>
		<li>Isoleer totaal RNA met behulp van een RNA-isolatiekit.</li>
		<li>Bepaal de RNA-concentratie met een NanoDrop en voer cDNA-synthese uit met 1 μg RNA met behulp van een eerste streng cDNA-synthesekit.</li>
		<li>Gebruik een real-time-PCR-detectiesysteem om kwantitatieve real-time-PCR (qRT-PCR) uit te voeren met tienvoudig verdunde cDNA in een 10 μL-reactiemengsel dat specifieke menselijke voorwaartse en omgekeerde primers voor GAPDH (voor normalisatie) bevat, SERPINE1 (codering van het PAI-1-eiwit, een TGF-β/SMAD-doelgen),SMAD7 (TGF-β/SMAD-doelgen) en qPCR Master Mix. Stel elke experimentele groep in drievoud in. OPMERKING: De primersequenties die worden gebruikt om menselijke doelgenen in qRT-PCR te detecteren, zijn opgenomen in tabel 1.</li>
		<li>Gebruik de volgende qPCR-reactieomstandigheden: initialisatie, 95 °C gedurende 3 minuten; denaturatie, 95 °C gedurende 10 seconden; gloeien, 60 °C gedurende 30 seconden; en verlenging, 80 °C gedurende 10 seconden; denaturatie, gloeien en verlengen worden 40 keer herhaald.</li>
		<li>Herhaal de experimenten minstens drie keer om biologische drievouden te verkrijgen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Analyse van TGF-β-geïnduceerde EMT
<ol><li>Analyseer de expressie van EMT-markers op eiwitniveau met behulp van western blotting. OPMERKING: De analyse van TGF-β-geïnduceerde EMT wordt getoond met behulp van muis NMuMG epitheelcellen als voorbeeld36,37.<ol>
<li>Kweek NMuMG-cellen bij 37 °C in DMEM-hoog glucosemedium aangevuld met 10% foetaal runderserum en 1:100 Pen-Strep. Gebruik methoden die worden beschreven in stap 1 voor eiwitisolatie en -detectie. OPMERKING: In dit experiment worden de volgende antilichamen gebruikt: E-cadherine, 1:1000; N-cadherin, 1:1000; Slak, 1:1000; Slak, 1:1000; Tubuline, 1:1000 (figuur 3).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Analyseer de expressie van EMT-markers op mRNA-niveau met behulp van kwantitatieve real-time-PCR zoals beschreven in stap 2.2. OPMERKING: Alle muisprimers die worden gebruikt voor qRT-PCR, inclusief CDH1 (codering van het E-cadherine-eiwit), SNAILen ZEB2 (figuur 3) zijn opgenomen in tabel 1.</li>
	<li>Analyseer het EMT-proces met behulp van indirecte immunofluorescentie en directe fluorescentiekleuring.<ol>
<li>Indirecte immunofluorescentiekleuring van E-cadherine<ol>
<li>Plaats steriele 18 mm-side vierkante glazen afdeklippen in 6-put platen (één afdeklip per put).</li>
			<li>Zaad 1×105 NMuMG cellen met 2 ml complete DMEM per 6-put plaat en laat de cellen 's nachts hechten.</li>
			<li>Beweeg de afdeklippen met hechtende cellen voorzichtig naar een nieuwe plaat met 6 putten en voeg 2 ml kweekmedium toe aan de putten.</li>
			<li>Behandel de cellen gedurende 2 dagen met TGF-β (5 ng/ml) of ligandbuffer (4 mM HCl, 0,1% BSA).</li>
			<li>Verwijder het kweekmedium en was de cellen voorzichtig twee keer met 1 ml voorverwarmde PBS.</li>
			<li>Fixeer de cellen door 1 ml paraformaldehyde van 4% toe te voegen en gedurende 30 minuten op kamertemperatuur te broeden. Was vervolgens de cellen twee keer voorzichtig met 1 ml PBS.</li>
			<li>Permeabiliseer de vaste cellen met 0,1% Triton X-100 gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur en was de cellen tweemaal met PBS.</li>
			<li>Blokkeer de cellen met 5% BSA in PBS gedurende 1 uur bij kamertemperatuur en was de cellen twee keer met PBS.</li>
			<li>Voeg het primaire antilichaam tegen E-cadherine (verdund 1:1000 in PBS) toe aan de bovenkant van elke deklip en incub gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.</li>
			<li>Verwijder het primaire antilichaam en was de afdeklip drie keer met PBS.</li>
			<li>Voeg het Alexa Fluor 555 secundaire antilichaam (verdund 1:500 in PBS) toe aan de bovenkant van elke coverslip en incubeert gedurende 1 uur bij kamertemperatuur terwijl het bedekt is met aluminiumfolie om te beschermen tegen licht.</li>
			<li>Verwijder het secundaire antilichaam en was de afdeklip drie keer met PBS.</li>
			<li>Monteer de afdeklip (cellen naar beneden gericht) op glazen dia's met behulp van montagemedium met 4′,6-diamidino-2-fenylindole (DAPI) en bewaar de gemonteerde dia's in een doos bij 4 °C, beschermd tegen licht.</li>
			<li>Observeer vlekken met SP8 confocale microscopie.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Directe fluorescentiekleuring van filamenteuze (F)-actine.<ol>
<li>Bereid monsters voor volgens stap 3.3.1.1. tot en met 3.3.1.9.</li>
			<li>Beits de cellen door Alexa Fluor 488 Phalloidin (1:1000) gedurende 1 uur op kamertemperatuur in het donker toe te voegen om filamenteuze actine (F-actine) te visualiseren.</li>
			<li>Was cellen drie keer met PBS.</li>
			<li>Monteer de coverslip op glazen dia's met behulp van montagemedium met DAPI en maak foto's met SP8 confocale microscopie.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

TGF-β/SMAD-signalering speelt een cruciale rol bij de progressie van borstkanker, omdat het de invasieve en uitzaaiingen van borstkankercellen kan bevorderen door EMT7te induceren. Hier beschreven we een logische workflow om TGF-β geïnitieerde signalering te onderzoeken van receptorgeïnduceerde SMAD-activering naar SMAD-gemedieerde transcriptie- en biologische reacties. We begonnen met het beschrijven van de analyse van SMAD2-fosforylering, gingen verder met TGF-β-geïnduceerde SMAD3-afhankelijke transcriptionele reacties en EMT-markerexpressie op zowel het gen- als eiwitniveau om de TGF-β / SMAD-signaleringsrespons te analyseren en onderzochten uiteindelijk TGF-β-geïnduceerde EMT. We gebruikten de CAGA12-luciferase transcriptional reporter met CAGA-boxen afgeleid van de PAI-1 promotor, om de activiteit van de TGF-β /SMAD signaleringsroute35te volgen. Deze reporter-constructie vereist SMAD3 en SMAD4 voor activering. Eerdere studies hebben aangetoond dat de knockdown van SMAD4 verzwakt tgf-β-geïnduceerde CAGA12-luciferase activiteit37. Naast de reporter-test is het bepalen van de fosforyleringsstatus van endogene SMADs, waaronder SMAD2 en SMAD3, een andere manier om de TGF-β signaleringsreactie te onderzoeken. Andere leden van de TGF-β familie, zoals groei - en differentiatiefactor (GDF)-8/myostatin en GDF-9, transduceren ook signalen via SMAD2/3-eiwitten door TβRI42,43,44in te schakelen . Naast de CAGA12-luciferase reporter zijn verschillende soortgelijke verslaggevers gebruikt om de activering van TGF-β signalering te detecteren. Een transcriptieverslaggever (SBE)4-Lux met responselementen afgeleid van de JunB-promotor kan bijvoorbeeld efficiënt worden geïnduceerd door TGF-β, activins en BMPs45.
Western blotting en qPCR werden gebruikt om TGF-β-geïnduceerde EMT te analyseren, wat klassieke methoden zijn om de expressie van epitheelmarkers (d.w.z. E-cadherine) en mesenchymal markers (d.w.z. N-cadherine, Snail, Slug en Zeb2) te onderzoeken. We hebben ook indirecte immunofluorescentiekleuring van E-cadherine en directe fluorescentiekleuring van F-actine uitgevoerd. Deze tests verder gevalideerd het mesenchymale fenotype van cellen na TGF-β behandeling. De beperking van immunofluorescentiekleuring is dat cellen vóór incubatie moeten worden gerepareerd met antilichamen en beeldvorming, en het is moeilijk om veranderingen in emt-markerexpressie in levende cellen te onderzoeken. Onlangs heeft het ontwerp van EMT reporter cell lines, zoals A549 lung adenocarcinoma-vimentin-RFP, het mogelijk gemaakt om de transformatie van epitheelcellen naar mesenchymale cellen in realtime te monitoren via de expressie van rood fluorescerend eiwit (RFP)-tagged vimentine. Dit platform kan worden gebruikt voor drugsscreening en nieuwe drugsontwikkeling46. LifeAct-kleurstof, een 17-aminozuurpeptide, dat F-actinestructuren in levende cellen kan bevlekken, wordt een waardevol hulpmiddel om het actinecytoskelet in realtime te visualiseren zonder de cellulaire processen te verstoren47. In deze studie gebruikten we twee kleine-molecuulremmers, SB431542 en GW788388, om hun remmende effect op TGF-β signalering en TGF-β-geïnduceerde EMT te valideren. Met name de GW788388 remt de TβRI- en TβRII-activiteit krachtig, terwijl SB431542 alleen een remmend effect heeft op TβRI (en ALK4 en ALK7). Eerdere studies toonden aan dat GW788388 krachtiger is in vivo dan SB43154240. Naast de remming van EMT verminderde GW788388 de expressie van fibrosemarkers in de nier en verminderde de orale toediening van GW788388 bij diabetische muizen de glomerulopathieaanzienlijk 25,48.
EMT speelt een essentiële rol bij het bevorderen van de plasticiteit van kankercellen en resulteert in geneesmiddelresistentie en uitzaaiingen 49. Daarom is het richten van EMT-afgeleide cellen met specifieke cytotoxische geneesmiddelen50 of het induceren van redifferentiatie via mesenchymal-to-epithelial transition (MET)51 voorgesteld als een aanpak om kankercelmetastasen en therapieresistentie te overwinnen. BMO draagt echter bij tot de proliferatie van verspreide kankercellen in verre organen52, wat contraproductief kan zijn bij het gebruik van de therapeutische omkering van EMT. Onlangs rapporteerde een nieuwe studie een therapeutische transdifferentiatiebenadering door emt-afgeleide borstkankercellen rechtstreeks te richten op differentiatie in adipocyten30. De studie van Ishay-Ronen et. al.30 gebruikt py2T murine epitheelkankercellen die een overgang naar mesenchymale cellen hadden ondergaan als reactie op langdurige behandeling met TGF-β. Ze toonden aan dat rosiglitazon in combinatie met MEK-remmers de epitheeldifferentiatie en adipogenese verbeterde. We ontdekten echter dat rosiglitazon alleen voldoende was om de transdifferentiatie van mesenchymale Py2T murinecellen in adipocyten te induceren.
Samengevat boden de methoden die in deze studie werden gebruikt een logische workflow om TGF-β signalering en TGF-β-geïnduceerde EMT te onderzoeken. De twee remmers, SB431542 en GW788388, kunnen TGF-β-geïnduceerde reacties en EMT blokkeren. Daarnaast hebben we ook aangetoond dat rosiglitazon alleen adipogenese induceert in bepaalde TGF-β geïnduceerde mesenchymale borstkankercellen. Hoewel we slechts verschillende borstkankercellijnen gebruikten om TGF-β reacties te onderzoeken, konden de hier beschreven methoden worden geëxtrapoleerd naar andere (kanker)cellen. Hier gebruikten we verschillende TGF-β concentraties om cellulaire reacties op te wekken. In de meeste celtypen oefent TGF-β zijn biologische activiteit uit in het concentratiebereik van 0,01-10 ng/ml53 en induceert signalering in een dosisresponspatroon. In primaire endotheelcellen, met inbegrip van boviene aorta-endotheelcellen, veroorzaakte TGF-β de substantiële expressie van gefosforyleerde SMAD2 bij 0,025 ng/ml, bereikte een maximum van 0,25 ng/ml en bleef op dit niveau in reactie op hogere concentraties53. In onze studie gebruikten we een hoge concentratie TGF-β (5 ng/ml) in MCF10A-Ras-cellen voor de transcriptionele reportertest om sterke reacties te verkrijgen. SMAD2-fosforylering en doelgenexpressie kunnen worden geïnduceerd door TGF-β in een lage dosis; zo gebruikten we 2,5 ng/ml TGF-β om cellen te behandelen. De meest geschikte werkconcentratie hangt echter af van het celtype en de geschatte effecten. Om de beste concentratie TGF-β te bepalen, wordt aanbevolen om de cellen met verschillende doses (van laag tot hoog) te behandelen.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61830/studying-tgf-signaling-tgf-induced-epithelial-to-mesenchymal">Studying TGF-&#946; Signaling and TGF-&#946;-induced Epithelial-to-mesenchymal Transition in Breast Cancer and Normal Cells</a>.&#160;NMuMG was mislabeled as&#160;cancer cells.
NMuMG cells are non-transformed epithelial breast cells established from a mouse mammary gland. NMuMG cells are frequently used as a model system to investigate TGF-&#946;-induced epithelial to mesenchymal transition (EMT). EMT is induced by TGF-&#946; in premalignant human MCF 10A-RAS (M2) cells and mouse MMTV-PyMT breast cancer cell line. The article has been updated to reflect this.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61830/studying-tgf-signaling-tgf-induced-epithelial-to-mesenchymal">Studying TGF-&#946; Signaling and TGF-&#946;-induced Epithelial-to-mesenchymal Transition in Breast Cancer and Normal Cells</a>.&#160;NMuMG was mislabeled as&#160;cancer cells.

Erratum: Studying TGF-&#946; Signaling and TGF-&#946;-induced Epithelial-to-mesenchymal Transition in Breast Cancer and Normal Cells

Het cytokine transformerende groeifactor-β (TGF-β) is het prototype van een grote groep structureel en functioneel gerelateerde regulerende polypeptiden, waaronder TGF-βs (d.w.z. TGF-β1, -β2 en -β3), botmorfogene eiwitten (BMPs) en activines1,2. Deze cytokinen spelen allemaal een belangrijke rol bij de embryonale ontwikkeling en bij het behoud van weefsel- en orgaanhomeostase3. De verkeerde regelgeving van TGF-β kan leiden tot een grote verscheidenheid aan ziekten, waaronder kanker4,5. TGF-β speelt een complexe, dubbele rol bij de progressie van kanker: in normale en premaligne epitheelcellen gedraagt TGF-β zich als een tumoronderdrukker door proliferatie te remmen en apoptose6,7te induceren; in het late stadium van tumorprogressie, wanneer cytostatische reacties worden geblokkeerd door de activering van oncogenen of verlies van tumoronderdrukkergenen, fungeert TGF-β als een tumorversterker door epitheel-mesenchymale overgang (EMT) in kankercellen te bevorderen, waardoor kankercelinvasie en uitzaaiingen mogelijk worden, inwerken op cellen in het micromilieu van de tumor en angiogenese en immuunontduikingstimuleren 8,9,10.
TGF-β wordt afgescheiden als een inactief precursormolecuul dat de volwassen carboxy-terminale TGF-β en latentie-geassocieerd peptide (LAP)11bevat. Dit kleine complex kan covalent worden gebonden door latente TGF-β-bindend eiwit (LTBP)12. De afgifte van volwassen TGF-β kan worden bemiddeld door de werking van specifieke proteasen die LAP splijten of door het mechanisch trekken van LAP in een integrin-afhankelijk proces13,14. Naast LTBP worden glycoproteïne A-herhalingen die overheersen (GARP) sterk uitgedrukt op het oppervlak van regulerende T-cellen (Tregs) en speelt het een vergelijkbare rol als LTBP bij het reguleren van de activering van TGF-β15,16. GARP bindt rechtstreeks aan latente TGF-β door disulfidekoppeling en niet-covalente associatie. De activering van TGF-β van het GARP/TGF-β complex vereist integrins17. Volwassen TGF-β bindt aan TGF-β serine/threonine kinase receptoren, d.w.z. TGF-β type I (TβRI) en TGF-β type II (TβRII) receptoren18 om signalering te initiëren. De binding van TGF-β aan TβRII bevordert de aanwerving van TβRI en de vorming van een heteromere complex. Vervolgens wordt TβRI gefosforyleerd door TβRII kinase op serine- en threonineresiduen in een kort glycine- en serinerijk (GS)-motief, wat resulteert in de activeringervan 19,20. Bij activering rekruteert en fosforyleert geactiveerde TβRI zijn substraten: de twee receptorspecifieke SMADs (R-SMADs) die SMAD2 en SMAD3 omvatten (Figuur 1). R-SMADs delen een vergelijkbare algehele structuur met twee zogenaamde Mad homologie domeinen, MH1 en MH2, die worden gescheiden door een proline-rijke linker regio (Figuur 2). Het DNA-bindingsmotief binnen het MH1-domein van SMAD3 is niet geconserveerd tussen SMAD2 en SMAD3, en SMAD2 kan DNA niet rechtstreeks binden vanwege twee invoegingen in zijn MH1-domein (exon 3 en L1). SMAD2 en SMAD3 kunnen worden geactiveerd door de fosforylering van het SSXS-motief in hun C-termini (figuur 2). Gefosforyleerde SMAD2/3 vormt heteromere complexen met een gemeenschappelijke SMAD-bemiddelaar, SMAD4, die transloceert in de kern om de transcriptie van doelgenen te moduleren (figuur 1)7,21. Deze canonieke SMAD-signaleringsroute is nauwkeurig gereguleerd en genereert specifieke cellulaire en weefselreacties zoals de regulatie van cel fate en tumorcelmetastasen en invasie22. Naast TGF-β-SMAD-signalering kunnen niet-SMAD-signaleringsroutes ook direct worden geactiveerd door receptoren om downstream cellulaire reacties te reguleren23.
Tijdens tumorprogressie zijn de activering van TGF-β-geïnduceerde SMAD-afhankelijke en SMAD-onafhankelijke trajecten nodig voor de inductie van EMT. EMT is een omkeerbaar proces waarbij tumorcellen dedifferentiate van een epitheelfenotype, dat wordt geassocieerd met het verlies van celcelcontacten en verminderde apicaal-basale polariteit, tot een mesenchymaal fenotype met verbeterde beweeglijkheid en invasievermogen24. EMT wordt gekenmerkt door een verhoogde expressie van mesenchymale markereiwitten, waaronder N-cadherine, vimentine, Zeb2 en Snail1/2, en de gelijktijdige downregulatie van epitheelmarkers, zoals E-cadherine en β-catenine (figuur 3)25. De overgang van een epitheel naar een mesenchymale toestand is echter vaak onvolledig en cellen krijgen gemengde epitheel- en mesenchymale (E/M) kenmerken. Een recent artikel van de International EMT association stelde voor om het proces van cellen die tussenliggende E/M fenotypische toestanden ondergaan te beschrijven als epitheel-mesenchymale plasticiteit (EMP)26. Deze plasticiteit verwijst naar gedeeltelijke EMT, een hybride E/M-status, een uitzaaibare EMT-toestand, een EMT-continuüm en een EMT-spectrum26. Tijdens EMT krijgen tumorcellen csc-eigenschappen (Cancer Stem Cell) en worden ze resistenter tegen door onthechting veroorzaakte apoptose27. Hoewel EMT verantwoordelijk is voor de verwerving van een invasief fenotype in primaire tumorcellen en de progressie van kanker stimuleert, is daarentegen aangetoond dat mesenchymale-epitheeltransitie (MET) een belangrijke rol speelt in de uitgroei van verspreide tumorcellen op verre gemetastaseerde locaties28,29. Een recente studie toonde aan dat EMT-afgeleide borstkankercellen kunnen worden omgezet in adipocyten, wat een kans zou kunnen bieden om uitzaaiingen te remmen en therapieresistentie in tumorcellen en teruggevallen kanker te overwinnen30. Vanwege de belangrijke rol van TGF-β signalering bij de activering van EMT bij kankerverwekkende borst, we presenteren gedetailleerde protocollen voor western blotting, een luciferase transcriptional reporter assay, kwantitatieve real-time-polymerase kettingreactie (qRT-PCR) en immunofluorescentie voor het onderzoek van TGF-β signalering, TGF-β-geïnduceerde EMT, en de transdifferentiatie van EMT-afgeleide murine borst epitheel tumorcellen in adipocyten. Deze technieken zijn de meest gebruikte analytische tools op het gebied van celbiologie. qRT-PCR wordt gebruikt om mRNA-expressieniveaus kwantitatief te detecteren, karakteriseren en kwantificeren. In vergelijking met kwantitatieve PCR (qPCR), een alternatieve techniek, kan de reverse transcription (RT)-PCR worden gebruikt om mRNA-expressie op semikwantitatieve wijze te bepalen31,32. Western blotting wordt gebruikt om specifieke eiwitniveaus in een bepaald cellysaatmonster te onderzoeken met voordelen van gevoeligheid en specificiteit, op een semi-kwantitatieve manier. Zo presenteren we een systematische workflow om veranderingen van genexpressie naar eiwitexpressie te analyseren om TGF-β-signalering te helpen onderzoeken die ook op andere signaleringsroutes kan worden toegepast.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagent</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18 mm-side square glass coverslips</td>
			<td>Menzel Gl&#228;ser</td>
			<td>631-1331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#8242;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Phalloidin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A12379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 555 secondary antibody</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-21422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-E-cadherin antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>610181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase(GAPDH) antibody</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>MAB374</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-N-cadherin antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>610920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Slug antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>9585</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-SMAD2/3 antibody</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>610842</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Snail antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>3879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Tubulin antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>2148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholera enterotoxin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clarity Western ECL Substrate</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1705060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DC protein assay kit</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>5000111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM-high glucose</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11965092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM-high glucose medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11965092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium (DMEM)/F12</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11039047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>epidermal growth factor (EGF)</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>01-107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>BioWest</td>
			<td>S1860-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GoTaq qPCR Master Mix</td>
			<td>PROMEGA</td>
			<td>A600X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>26050088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H0135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>91077C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11836153001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoSpin RNA II kit</td>
			<td>BIOKE&#180;</td>
			<td>740955</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin (Pen-Strep)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylenimine (PEI)</td>
			<td>Polyscience</td>
			<td>23966</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>IPVH00010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ponceau S solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>K1621</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skimmed milk</td>
			<td>Campina: Elk</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChemiDoc Imaging System</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>17001402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFX Connect Detection System</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1855201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminometer</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>2030-0050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ND-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

studying tgf-&#946; signaling and tgf-&#946;-induced epithelial-to-mesenchymal transition in breast cancer and normal cells

Het transformeren van groeifactor-β (TGF-β) is een afgescheiden multifunctionele factor die een sleutelrol speelt in intercellulaire communicatie. Verstoringen van TGF-β signalering kan leiden tot borstkanker. TGF-β lokt de effecten ervan uit op proliferatie en differentiatie via specifiek celoppervlak TGF-β type I- en type II-receptoren (d.w.z. TβRI en TβRII) die een intrinsiek serine/threoninekinasedomein bevatten. Bij TGF-β-geïnduceerde heteromere complexe vorming lokt geactiveerde TβRI intracellulaire signalering uit door fosforylaatende SMAD2 en SMAD3. Deze geactiveerde SMAD's vormen heteromere complexen met SMAD4 om specifieke doelgenen te reguleren, waaronder plasminogene activeringsremmer 1 (PAI-1, gecodeerd door het SERPINE1-gen). De inductie van epitheel-naar-mesenchymale overgang (EMT) maakt epitheelkankercellen op de primaire locatie of tijdens kolonisatie op verre locaties mogelijk om een invasief fenotype te krijgen en tumorprogressie te stimuleren. TGF-β fungeert als een krachtige inductor van borstkanker invasie door het drijven van EMT. Hier beschrijven we systematische methoden om TGF-β signalering en EMT-reacties te onderzoeken met behulp van premalignant menselijke MCF10A-RAS (M2) cellen en muis NMuMG epitheelcellen als voorbeelden. We beschrijven methoden om TGF-β-geïnduceerde SMAD2-fosforylering te bepalen door westerse blotting, SMAD3/SMAD4-afhankelijke transcriptieactiviteit met behulp van luciferaseverslaggeveractiviteit en SERPINE1-doelgenexpressie door kwantitatieve real-time-polymerasekettingreactie (qRT-PCR). Daarnaast worden methoden beschreven om TGF-β-geïnduceerde EMT te onderzoeken door veranderingen in morfologie, epitheel- en mesenchymale markerexpressie, filamenteuze actinekleuring en immunofluorescentiekleuring van E-cadherine te meten. Twee selectieve kleine molecule TGF-β receptorkinaseremmers, GW788388 en SB431542, werden gebruikt om TGF-β-geïnduceerde SMAD2-fosforylering, doelgenen en veranderingen in EMT-markerexpressie te blokkeren. Bovendien beschrijven we de transdifferentiatie van mesenchymale borst Py2T murine epitheeltumorcellen in adipocyten. Methoden om TGF-β-geïnduceerde signalering en EMT bij borstkanker te onderzoeken, kunnen bijdragen aan nieuwe therapeutische benaderingen voor borstkanker.

Analyse van TGF-β signalering De belangrijkste stap in TGF-β signalering is de fosforylering van de twee meest carboxy terminale serineresiduen in het SSXS-motief (figuur 2) door TβRI kinase38,39. Om TGF-β signaleringsreacties te onderzoeken, hebben we westerse vlekken van gefosforyleerde SMAD2 uitgevoerd. In de premalignant menselijke borst MCF10A-Ras cellen, de fosforylering van SMAD2 significant toegenomen in reactie op TGF-β stimulatie gedurende 1 uur, terwijl de expressie van de totale SMAD2/3 werd niet beïnvloed door TGF-β behandeling (Figuur 4A). Door gebruik te maken van de TGF-β-geïnduceerde SMAD3/4-aangedreven CAGA-luc transcriptional reporter assay, ontdekten we dat TGF-β de luciferase reporter in de MCF10A-Ras cellenlijn duidelijk geïnduceerd in vergelijking met niet-behandelde cellen (Figuur 4B). Bovendien merkten we op dat goed gekarakteriseerde directe transcriptionele gendoelen van TGF-β waaronder SMAD7 en SERPINE1 (codering van het PAI-1-eiwit), sterk werden uitgedrukt in TGF-β behandelde MCF10A-Ras-cellen (figuur 4C).
Analyse van TGF-β-geïnduceerde EMT We beoordeelden TGF-β-geïnduceerde EMT met verschillende methoden, zoals morfologische veranderingen, de expressie van EMT-markers bij het mRNA- en eiwitgehalte en immunofluorescentiekleuring van EMT-markers36. NMuMG epitheelcellen behandeld met TGF-β gedurende 1 en 2 dagen veranderden van een klassieke epitheelmorfologie in een spindelvormige mesenchymale morfologie, zoals blijkt uit fasecontrastmicroscopie (figuur 5A). In overeenstemming met de morfologische veranderingen, merkten we op dat TGF-β behandeling leidde tot een toename van de eiwitexpressie van mesenchymale markers, waaronder N-cadherine, Snail en Slug37 (Figuur 5B). E-cadherine, een epitheelmarker, werd daarentegen na 2 dagen behandeling met TGF-β in NMuMG-cellen gedereguleerd (figuur 5B). Daarnaast hebben we kwantitatieve real-time-polymerasekettingreactie (qRT-PCR) uitgevoerd om de genexpressie van EMT-markers te onderzoeken. CDH1 (codering van het E-cadherine-eiwit) werd aanzienlijk verlaagd, terwijl mesenchymal markers zoals SNAIL en Zinc finger E-box-binding homeobox 2 (ZEB2) aanzienlijk werden verhoogd na TGF-β stimulatie in NMuMG-cellen in vergelijking met onbehandelde cellen (figuur 5C). TGF-β-geïnduceerde EMT in NMuMG-cellen werd verder bevestigd door immunofluorescentiekleuring van E-cadherine. Bij TGF-β stimulatie gedurende 2 dagen, NMuMG cellen uitgedrukt minder E-cadherine dan cellen in de niet-geïnduceerde controlegroep, zoals geanalyseerd door confocale microscopie(figuur 5D). Bovendien, NMuMG cellen in de aanwezigheid van TGF-β gevormd meer actine stress vezels, zoals blijkt uit confocale microscopie(figuur 5E).
SB431542 en GW788388 remmen TGF-β signalering en TGF-β-geïnduceerde EMT SB431542 is een ATP-competitieve remmer van het kinasedomein van TβRI, ook wel activinereceptorachtige kinase 5 (ALK5) wordt vermeld, terwijl GW788388 de activiteit van TβRI en TβRII kinase remt. Beide remmers kunnen TGF-β receptor signaal40remmen. Zo behandelden we NMuMG-cellen met verschillende concentraties GW788388 in aanwezigheid van TGF-β gedurende 1 uur. Zoals verwacht remde GW788388 TGF-β-geïnduceerde SMAD2-fosforylering op een dosisafhankelijke manier (figuur 6A). Bovendien werd de TGF-β gemedieerde fosforylering van SMAD2 geblokkeerd door de behandeling met SB431542 (figuur 6A). Gefosforyleerde SMAD2/3 vormt een heteromere complex met SMAD4 en transloceert in de kern om de transcriptie van doelgenen te moduleren. Daarom onderzochten we de translocatie van SMAD2/3 in NMuMG-cellen door immunofluorescentiekleuring van SMAD2/3. De gegevens toonden aan dat zowel SB431542 als GW788388 de TGF-β-geïnduceerde nucleaire translocatie en accumulatie van SMAD2/3 in NMuMG-cellen aanzienlijk remden (figuur 6B). Bovendien werden de remmende effecten van SB431542 en GW788388 ook waargenomen in de mRNA-expressieniveaus van belangrijke TGF-β doelgenen die betrokken zijn bij EMT, waaronder PAI-1, SNAIL, E-cadherin en Fibronectin (figuur 6C). Deze gegevens suggereerden dat SB431542 en GW788388 TGF-β-signalering en TGF-β-geïnduceerde EMT blokkeerden.
Analyse van de transdifferentiatie van mesenchymale borstkankercellen in adipocyten EMT speelt een vitale rol bij het verbeteren van cellulaire plasticiteit bij kankers en resulteert in de ontwikkeling van therapieresistentie. Plasticiteit van kankercellen kan direct worden gericht en geremd met een transdifferentiatiebenadering, zoals geforceerde adipogenese30. We gebruikten Py2T murine borstkankercellen, die werden afgeleid van de borstklier van een muis mammary tumor virus-polyoom midden tumor-antigeen (MMTV-PyMT) transgene muis, als een cellulair model van EMT-geïnduceerde kankercel plasticiteit. Op basis van een vastgesteld protocol41,behandelden we EMT-afgeleide Py2T murine borstkankercellen met het antidiabetische medicijn rosiglitazon gedurende 10 dagen om adipogenese op te wekken. Adipogenese werd beoordeeld door lipidedruppels te visualiseren met behulp van olierode O-vlekken. Vetcellen werden gemakkelijk gedetecteerd in met rosiglitazon behandelde Py2T murine borstkankercellen (figuur 7), wat aantoonde dat behandeling met alleen rosiglitazon voldoende is om de transdifferentiatie van EMT-afgeleide borstkankercellen in adipocyten te bevorderen.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61830/61830fig01.jpg"> Figuur 1: TGF-β/SMAD signalering. TGF-β signalering initieert met de binding van TGF-β aan TGF-β type II-receptor (TβRII), een constitutief actieve kinase, die TGF-β type I-receptor (TβRI) fosforyleert. Activeer vervolgens TβRI kinasefosforylaten SMAD2/3. Een peptide dat het SSXS-motief van SMAD2 bevat met twee carboxy terminale gefosforyleerde serineresiduen werd gebruikt om polyklonale antisera te verkrijgen die fosfor-SMAD2 (p-SMAD2) herkennen. Daarom kan de analyse van p-SMAD2-expressie door western blotting worden gebruikt om de activering van de TGF-β signaleringsroute te bepalen. Gefosforyleerde SMAD2/3 kan heteromere complexen vormen met SMAD4, die vervolgens transloceren naar de kern om transcriptionele reacties te moduleren. De CAGA12-luciferase reporter assay en quantitative real time PCR (qRT-PCR) voor de mRNA expressie van TGF-β doelgenen zoals SMAD7 en SERPINE1 (coderende PAI-1 eiwit), kan worden gebruikt om TGF-β-geïnduceerde SMAD3-afhankelijke transcriptionele reacties te analyseren. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61830/61830fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61830/61830fig02.jpg"> Figuur 2: Schematische structuur van R-SMADs (SMAD2 en SMAD3). De MH1 (blauw) en MH2 (geel) domeinen worden geconserveerd onder R-SMADs, maar het linkergebied (grijs) is niet geconserveerd. Het MH1-domein van SMAD3 herbergt een DNA-bindend motief, terwijl SMAD2 DNA niet direct kan binden, vanwege een invoeging (exon 3) in zijn MH1-domein. Het MH2-domein bemiddelt SMAD-oligomerisatie, interactie met TGF-β receptoren en eiwitbinding en is betrokken bij transcriptionele regulatie. SMAD2 en SMAD3 kunnen worden geactiveerd door de fosforylering van het SSXS-motief (in rood) in hun C-termini. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61830/61830fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61830/61830fig03.jpg"> Figuur 3: TGF-β-geïnduceerde EMT. Tijdens TGF-β-geïnduceerde epitheel-mesenchymale overgang (EMT), ondergaan de cellen verlies van epitheel en verwerving van mesenchymale kenmerken met verbeterde celmotiliteit en invasievermogen. De inductie van EMT leidt tot de expressie van mesenchymal markers zoals N-cadherin, Zeb2 en Snail1/2, evenals de downregulatie van epitheelmarkers, waaronder E-cadherine, β-catenine en claudin-1. Het geaccumuleerde verlies of de toename van epitheel/mesenchymale (E/M) kenmerken zorgt ervoor dat een cel op een omkeerbare manier tussentoestanden invoert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61830/61830fig03large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61830/61830fig04.jpg"> Figuur 4: TGF-β signaleringsreacties in MCF10A-Ras cellen. (A) MCF10A-Ras-cellen werden gedurende 1 uur behandeld met of zonder TGF-β (2,5 ng/ml) en cellysaten waren immunoblot voor gefosforyleerde SMAD2 (p-SMAD2), totale SMAD2/3 en GAPDH (als belastingscontrole). De maatmarkering wordt rechts weergegeven. Con: Controlegroep zonder TGF-β behandeling. (B) Analyse van TGF-β (5 ng/ml) activiteit met behulp van de SMAD3–SMAD4-afhankelijke CAGA12-luciferase (LUC) transcriptional reporter in MCF10A-Ras cellen. De waarden worden genormaliseerd tot β-galactosidase (βGal) activiteit. Gegevens worden uitgedrukt als het gemiddelde ± s.d, n = 3. Student's t test, ***P ≤ 0.001 (C) qRT-PCR analyse van de TGF-β doelgenen SMAD7 en SERPINE1 (codering van het PAI-1 eiwit) in MCF10A-Ras cellen behandeld met TGF-β (2,5 ng/ml) gedurende 6 uur. GAPDH werd gebruikt als interne controle. Gegevens worden uitgedrukt als het gemiddelde ± s.d, n = 3. Student's t test, ***P ≤ 0.001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61830/61830fig04large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61830/61830fig05.jpg"> Figuur 5: TGF-β-geïnduceerde EMT in NMuMG-cellen. (A) Morfologie van NMuMG-cellen behandeld met TGF-β (2,5 ng/ml) gedurende 1 of 2 dagen. In aanwezigheid van TGF-β, NMuMG cellen getransdifferentieerd in een mesenchymal fenotype. Schaalbalk = 150 μm (B) NMuMG-cellen werden gedurende 2 dagen behandeld met of zonder TGF-β (5 ng/ml) en EMT-markers werden geanalyseerd door westerse vlekken. De maatmarkering is zoals aangegeven aan de rechterkant. Con: Controlegroep zonder TGF-β behandeling. (C) Genexpressieanalyse van EMT-markers (CDH1 (codeert voor het E-cadherine-eiwit),SNAIL en ZEB2) in NMuMG-cellen die gedurende 2 dagen zijn behandeld met TGF-β (5 ng/ml). GAPDH werd gebruikt als interne controle. De resultaten worden uitgedrukt als de gemiddelde ± s.d., n = 3. T-toets student, *P ≤ 0,05, **P ≤ 0,01, ***P ≤ 0,001. (D) NMuMG-cellen werden gekleurd door immunofluorescentie om de expressie van de epitheelmarker E-cadherine (rood) na behandeling met TGF-β (2,5 ng/ml) gedurende 2 dagen te detecteren. Nuclei werden tegengehouden met DAPI (blauw). Beelden werden gemaakt met confocale microscopie. Schaalbalk = 50 μm (E) NMuMG-cellen werden gekleurd met fluoresceïne-falloline (groen) om F-actine te visualiseren. Nuclei werden tegengehouden met DAPI (blauw). Schaalbalk = 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61830/61830fig05large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61830/61830fig06.jpg"> Figuur 6: TGF-βsignaling en TGF-β-geïnduceerde EMT werden geremd door SB431542 en GW788388. (A) NMuMG-cellen werden gedurende 1 uur behandeld met 10 μM SB431542 (SB) of de geïndiceerde concentraties GW788388 (GW) in de aan- of afwezigheid van TGF-β (5 ng/ml). De cellysaten waren immunoblotted voor p-SMAD2, SMAD2/3 en GAPDH. (B) NMuMG-cellen werden behandeld met 5 μM SB431542 (SB) of 10 μM GW788388 (GW) in de aan- of afwezigheid van 5 ng/ml TGF-β gedurende 1 uur en gekleurd door immunofluorescentie om de nucleaire translocatie van SMAD2/3 (groen) te detecteren. Beelden werden gemaakt met confocale microscopie. (C) Expressie van TGF-β doelgenen, waaronder PAI-1 en genen die coderen voor EMT-markers, waaronder SNAIL, E-Cadherin en Fibronectin, werden geanalyseerd door reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR) in NMuMG-cellen na SB- of GW-behandeling en TGF-β stimulatie gedurende 48 uur. GAPDH diende als laadcontrole. Controle geeft niet-behandelde cellen aan. Dit cijfer is gewijzigd van Petersen M. et al. 34 met toestemming van uitgever. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61830/61830fig06large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61830/61830fig07.jpg"> Figuur 7: EMT-afgeleide Py2T murine borstkankercellen kunnen worden geïnduceerd om zich te onderscheiden in adipocyten. Py2T murine borstkankercellen werden gestimuleerd met 2 ng/ml TGF-β gedurende 20 dagen om volledige EMT te induceren. Vervolgens werden de cellen gedurende 10 dagen behandeld met DMSO als voertuigcontrole of rosiglitazon (2 μM) om de differentiatie van mesenchymale kankercellen mogelijk te maken en adipogenese op te wekken. Het medium werd elke 2 dagen veranderd. Na 10 dagen behandeling werden cellen bevlekt met olierood O. Schaalbalk = 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61830/61830fig07large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Soort(en)</td>
			<td>Gennaam</td>
			<td colspan="2">Vooruit (5' tot 3')</td>
			<td colspan="2">Achteruit (5' tot 3')</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">Menselijke</td>
			<td>GAPDH</td>
			<td colspan="2">TGCACCACCAACTGCTTAGC</td>
			<td colspan="2">GGCATGGACTGTGGTCATGAG</td>
		</tr>
<tr>
<td>SMAD7</td>
			<td colspan="2">TCCAGATGCTGTGCCTTCC</td>
			<td colspan="2">GTCCGAATTGAGCTGTCCG</td>
		</tr>
<tr>
<td>SERPINE1</td>
			<td colspan="2">CACAAATCAGACGGCAGCACT</td>
			<td colspan="2">CATCGGGCGTGGTGAACTC</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="4">Muis</td>
			<td>GAPDH</td>
			<td colspan="2">TGGCAAAGTGGAGATTGTTGCC</td>
			<td colspan="2">AAGATGGTGATGGGCTTCCCG</td>
		</tr>
<tr>
<td>CDH1</td>
			<td colspan="2">ACCAAAGTGACGCTGAAGTC</td>
			<td colspan="2">GAGGATGTACTTGGCAATGG</td>
		</tr>
<tr>
<td>Slak</td>
			<td colspan="2">CAGCTGGCCAGGCTCTCGGT</td>
			<td colspan="2">GCGAGGGCCTCCGGAGCA</td>
		</tr>
<tr>
<td>ZEB2</td>
			<td colspan="2">TTCTGCAAGCCTCTGTAGCC</td>
			<td colspan="2">TTCTGGCCCCATTGCATCAT</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 1: Primers gebruikt voor qRT-PCR.

Watch this Scientific Journal Video about Studying TGF-Î² Signaling and TGF-Î²-induced Epithelial-to-mesenchymal Transition in Breast Cancer and Normal Cells at JoVE.com

Studying TGF-&#946; Signaling and TGF-&#946;-induced Epithelial-to-mesenchymal Transition in Breast Cancer and Normal Cells

We beschrijven een systematische workflow om TGF-β signalering en TGF-β-geïnduceerde EMT te onderzoeken door de eiwit- en genexpressie te bestuderen die betrokken zijn bij deze signaleringsroute. De methoden omvatten western blotting, een luciferase reporter assay, qPCR, en immunofluorescentie vlekken.

TGF-β Signalering en TGF-β-geïnduceerde Epitheel-naar-mesenchymale overgang bij borstkanker en normale cellen bestuderen

Transforming growth factor-&#946; (TGF-&#946;) is a secreted multifunctional factor that plays a key role in intercellular communication. Perturbations of ...

TGF-beta is a main driver of epithelial-to-mesenchymal transition, in short EMT, which can occur both in normal and in cancer cells. The methods that are described in our protocol allow researchers to measure the impact of modulators on both TGF-beta SMAD signaling and TGF-beta-induced EMT. The untransformed NMuMG cells, which were established from a mouse mammary gland, is a frequently used model system for TGF-beta-induced EMT.TGF-beta provokes in these cells, these NMuMG cells a very strong EMT response. A similar response can also be seen in breast cancer cells where it contributes to cancer progression. The combined staining of epithelial micro E-cadherin and organization of filamentous-actin helps to validate and better visualize the morphological changes that occur during epithelial-to-mesenchymal transition.The acquisition of a mesenchymal phenotype by cancer cells has been linked to an increased ability of cells to migrate, to invade, and to metastasize, as well as to chemotherapy resistance. This method may provide important insights into cancer progression, but also into other processes such as tissue fibrosis. While attempting this protocol, keep in mind that cell density should be well-controlled.High density of the cells makes epithelial-to-mesenchymal transition difficult. With this visual demonstration, researchers will get a good grasp on how to perform TGF-beta signaling and TGF-beta-induced EMT experiments. To perform indirect immunofluorescent staining of E-cadherin, begin by placing sterile 18 millimeter square glass coverslips in six-well plates, one coverslip per well.Seed 100, 000 NMuMG cells with two milliliters of complete DMEM into each well and allow the cells to adhere overnight. Non-transformed NMuMG cells are frequently used as a model system to investigate TGF-beta-induced EMT. On the next day, gently move the coverslips with adherent cells to a new six-well plate and add two milliliters of culture medium to the wells.Treat the cells with ligand buffer as a control or five nanograms per milliliter of TGF-beta for two days. The added ligand buffer should be the same volume as the added TGF-beta. After the treatment, remove the culture medium and gently wash the cells twice with one milliliter of pre-warmed PBS.Fix the cells by adding one milliliter of 4%paraformaldehyde and incubating for 30 minutes at room temperature, then gently wash the cells twice with one milliliter of PBS. Permeabilize the fixed cells with 0.1%Triton X-100 for 10 minutes at room temperature and wash the cells twice with PBS. Block the non-specific protein binding to cells with 5%BSA in PBS for one hour at room temperature, then repeat the washes with PBS.Add the primary antibody against E-cadherin to the top of each coverslip and incubate for one hour at room temperature. Remove the primary antibody and wash each coverslip with PBS three times. Add the Alexa Fluor 555 secondary antibody and the Alexa Fluor 488 phalloidin to the top of each coverslip.Then cover with aluminum foil and incubate for one hour at room temperature. Remove the secondary antibody and wash the coverslip three times with PBS. Mount the coverslip with the cells facing downward onto glass slides using mounting medium with DAPI and store the mounted slides in a box at four degrees Celsius protected from light.Observe the staining with SP8 confocal microscopy. In the MCF10A-Ras cell line, the phosphorylation of SMAD2 significantly increased in response to TGF-beta stimulation, while the expression of total SMAD2 and 3 was not affected. TGF-beta also markedly induced the luciferase reporter in the MCF10A-Ras cell line compared to non-treated cells.Well-characterized direct transcriptional gene targets of TGF-beta, including SMAD7 and SERPINE1, were highly expressed in TGF-beta-treated MCF10A-Ras breast cells. NMuMG epithelial cells treated with TGF-beta changed from a classic epithelial morphology to a spindle-shaped mesenchymal-like morphology. Consistent with the morphological changes, TGF-beta treatment led to an increase in the protein expression of mesenchymal markers.In contrast, E-cadherin, an epithelial marker, was down-regulated after two days of TGF-beta treatment. Quantitative real-time polymerase PCR was used to investigate the gene expression of EMT markers after TGF-beta stimulation. CDH1 was significantly decreased while mesenchymal markers were increased.Upon TGF-beta stimulation, NMuMG cells expressed less E-cadherin than the cells in the control group. Moreover, the cells formed more actin stress fibers in the presence of TGF-beta. Treatment with GW788388 inhibited TGF-beta-induced SMAD2 phosphorylation in a dose-dependent manner.Additionally, the TGF-beta-mediated phosphorylation of SMAD2 was blocked by SB-431542 treatment. Both SB-431542 and GW788388 significantly inhibited the TGF-beta-induced nuclear translocation and accumulation of SMAD2 and 3 in NMuMG cells. Following this procedure, immunofluorescent staining of other epithelial-to-mesenchymal macroproteins can be performed by changing the specific primary and secondary antibodies to investigate the expression level and the localization of these proteins within the cell.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Utilizing Functional Genomics Screening to Identify Potentially Novel Drug Targets in Cancer Cell Spheroid Cultures

Gebruik makend van Functional Genomics Screening om potentieel nieuwe drug targets in Cancer Cell Sferoïde Cultures Identificeer

The identification of functional driver events in cancer is central to furthering our understanding of cancer biology and indispensable for the discovery ...

Synthesis and Characterization of an Aspirin-fumarate Prodrug that Inhibits NF&#954;B Activity and Breast Cancer Stem Cells

Synthese en karakterisering van een Aspirine-fumaraat Prodrug dat NFKB Activity and Breast Kanker stamcellen Remt

Inflammation is a cancer hallmark that underlies cancer incidence and promotion, and eventually progression to metastasis. Therefore, adding an ...

Invasive Behavior of Human Breast Cancer Cells in Embryonic Zebrafish

Invasief gedrag van menselijke borstkankercellen in embryonale zebravis

In many cases, cancer patients do not die of a primary tumor, but rather because of metastasis. Although numerous rodent models are available for studying ...

Isolation of Human Endothelial Cells from Normal Colon and Colorectal Carcinoma - An Improved Protocol

Isolatie van menselijke endotheliale cellen van normale Colon en colorectaal carcinoom - een verbeterde Protocol

Primary cells isolated from human carcinomas are valuable tools to identify pathogenic mechanisms contributing to disease development and progression. In ...

Studying Normal Tissue Radiation Effects using Extracellular Matrix Hydrogels

Het bestuderen van normale weefsel straling effecten met behulp van extracellulaire matrix hydrogels

Radiation is a therapy for patients with triple negative breast cancer. The effect of radiation on the extracellular matrix (ECM) of healthy breast tissue ...

Characterize Disease-related Mutants of RAF Family Kinases by Using a Set of Practical and Feasible Methods

Karakteriseren ziekte-gerelateerde mutanten van RAF familie kinasen met behulp van een set van praktische en haalbare methoden

The rapidly accelerated fibrosarcoma (RAF) family kinases play a central role in cell biology and their dysfunction leads to cancers and developmental ...

Obtaining Cancer Stem Cell Spheres from Gynecological and Breast Cancer Tumors

Het verkrijgen van kanker stamcelbollen van gynaecologische en borstkankertumoren

Cancer stem cells (CSC) are a small population with self-renewal and plasticity which are responsible for tumorigenesis, resistance to treatment and ...

Differentiation of Mouse Breast Epithelial HC11 and EpH4 Cells

Differentiatie van muisborst epitheel HC11 en EpH4 Cellen

Cadherins play an important role in the regulation of cell differentiation as well as neoplasia. Here we describe the origins and methods of the induction ...

Studying Triple Negative Breast Cancer Using Orthotopic Breast Cancer Model

Studeren Triple Negatieve Borstkanker met behulp van Orthotopische Borstkanker Model

Triple-negative breast cancer (TNBC) is an aggressive breast cancer subtype with limited therapeutic options. When compared to patients with less ...

Orthotopic Transplantation of Breast Tumors as Preclinical Models for Breast Cancer

Orthotopische transplantatie van borsttumoren als preklinische modellen voor borstkanker

Preclinical models that faithfully recapitulate tumor heterogeneity and therapeutic response are critical for translational breast cancer research. ...