Name: studying tgf-&#946; signaling and tgf-&#946;-induced epithelial-to-mesenchymal transition in breast cancer and normal cells
Uploaded: 2020-10-27T14:30:00
Duration: 6 min 54 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Studying TGF-Î² Signaling and TGF-Î²-induced Epithelial-to-mesenchymal Transition in Breast Cancer and Normal Cells at JoVE.com

हम जे. जेड. और कैंसर जीनोमिक्स सेंटर नीदरलैंड (CGC) के लिए चीनी छात्रवृत्ति परिषद (सीएससी) के समर्थन को स्वीकार करते हैं । एनएल) से पीटी डी

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

TGF-β/SMAD सिग्नलिंग स्तन कैंसर की प्रगति में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है, क्योंकि यह EMT7उत्प्रेरण द्वारा स्तन कैंसर सेल आक्रामकता और मेटास्टेसिस को बढ़ावा दे सकता है । यहां, हमने रिसेप्टर-प्रेरित SMAD सक्रियण से SMAD-मध्यस्थता प्रतिलेखन और जैविक प्रतिक्रियाओं के लिए TGF-β-शुरू किए गए सिग्नलिंग की जांच करने के लिए एक तार्किक कार्यप्रवाह का वर्णन किया। हम SMAD2 फॉस्फोरिलेशन के विश्लेषण का वर्णन करके शुरू किया, TGF के साथ जारी-β-प्रेरित SMAD3-निर्भर ट्रांसक्रिप्शनल प्रतिक्रियाओं और दोनों जीन और प्रोटीन के स्तर पर EMT मार्कर अभिव्यक्ति के लिए TGF-β/SMAD संकेत प्रतिक्रिया का विश्लेषण, और अंत में TGF-β प्रेरित EMT की जांच की । हमने टीजीएफ-β/SMAD सिग्नलिंग पाथवे३५की गतिविधि की निगरानी के लिए, पाई-1 प्रमोटर से प्राप्त सीएजीए बक्से वाले CAGA 12-लूसिफ़ेरेस ट्रांसक्रिप्शनल रिपोर्टर का इस्तेमाल किया । इस रिपोर्टर निर्माण सक्रियण के लिए SMAD3 और SMAD4 की आवश्यकता है । पिछले अध्ययनों से पता चला है कि SMAD4 तनु TGF-β प्रेरित CAGA 12-लूसिफ़ेरेस गतिविधि३७के नॉकआउट । रिपोर्टर परख के अलावा, SMAD2 और SMAD3 सहित अंतर्जात SMADs के फॉस्फोरिलेशन स्थिति का निर्धारण, TGF-β संकेत प्रतिक्रिया की जांच करने के लिए एक और तरीका है । दरअसल, टीजीएफ-β परिवार के अन्य सदस्य, जैसे विकास और विभेदन कारक (जीडीएफ)-8/मायोस्टैटिन और जीडीएफ-9, टीआरआई42, 43, 44को उलझाने के द्वारा SMAD2/3 प्रोटीन के माध्यम से संकेतों को भी स्थानांतरित करतेहैं। सीएजीए 12-लूसिफेरेज रिपोर्टर के अलावा टीजीएफ-β सिग्नलिंग की सक्रियता का पता लगाने के लिए ऐसे ही कई रिपोर्टर्स का इस्तेमाल किया गया है । उदाहरण के लिए, जुंबे प्रमोटर से प्राप्त प्रतिक्रिया तत्वों के साथ एक ट्रांसक्रिप्शनल (एसबीई)4-लक्स रिपोर्टर को टीजीएफ-β, एक्टिविन और बीएमपीएस45द्वारा कुशलतापूर्वक प्रेरित किया जा सकता है।
पश्चिमी ब्लॉटिंग और क्यूपीसीआर का उपयोग टीजीएफ-β-प्रेरित ईएमटी का विश्लेषण करने के लिए किया गया था, जो एपिथेलियल मार्कर (यानी ई-कैडेरिन) और मेसेंचिमल मार्कर (यानी, एन-कैडेरिन, घोंघा, स्लग और जेब2) की अभिव्यक्ति की जांच करने के लिए क्लासिक तरीके हैं। हमने ई-कैडेरिन के अप्रत्यक्ष इम्यूनोफ्लोरेसेंस स्टेनिंग और एफ-ऐक्टिन के प्रत्यक्ष फ्लोरेसेंस स्टेनिंग का भी प्रदर्शन किया। इन परख ने टीजीएफ-β उपचार के बाद कोशिकाओं के मेसेन्चिमल फेनोटाइप को और मान्य किया। इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला की सीमा यह है कि कोशिकाओं को एंटीबॉडी और इमेजिंग के साथ इनक्यूबेशन से पहले तय करने की जरूरत है, और यह जीवित कोशिकाओं में EMT मार्कर अभिव्यक्ति में परिवर्तन की जांच करने के लिए मुश्किल है । हाल ही में, EMT रिपोर्टर सेल लाइनों के डिजाइन, जैसे A549 फेफड़े adenocarcinoma-vimentin-RFP, यह संभव लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन (RFP) टैग vimentin की अभिव्यक्ति के माध्यम से वास्तविक समय में mesenchymal कोशिकाओं के लिए epithelial कोशिकाओं के परिवर्तन की निगरानी करने के लिए बनाया गया है । इस मंच का उपयोग दवा स्क्रीनिंग और नई दवा विकास46के लिए किया जा सकता है। लाइफएक्ट डाई, एक 17-अमीनो-एसिड पेप्टाइड, जो जीवित कोशिकाओं में एफ-ऐक्टिन संरचनाओं को दाग सकता है, सेलुलर प्रक्रियाओं47के साथ हस्तक्षेप किए बिना वास्तविक समय में ऐक्टिन साइटोस्केलेटन की कल्पना करने के लिए एक मूल्यवान उपकरण बनता जा रहा है। इस अध्ययन में, हमने टीजीएफ-β सिग्नलिंग और टीजीएफ-β-प्रेरित ईएमटी पर उनके निरोधात्मक प्रभाव को मान्य करने के लिए दो छोटे अणु अवरोधकों, SB431542 और GW788388 का उपयोग किया। विशेष रूप से, GW788388 शक्तिशाली T <3>RI और TοRII गतिविधि को रोकता है, जबकि SB431542 केवल TοRI (और ALK4 और ALK7) पर एक निरोधात्मक प्रभाव पड़ता है । पिछले अध्ययनों से पता चला है कि GW788388 SB43154240की तुलना में वीवो में अधिक शक्तिशाली है। ईएमटी के अवरोध के अलावा, GW788388 ने गुर्दे में फाइब्रोसिस मार्कर की अभिव्यक्ति को कम कर दिया, और मधुमेह चूहों में GW788388 के मौखिक प्रशासन ने स्पष्ट रूप से ग्लोमेर्यूलोपैथी25,48में कमी की।
ईएमटी कैंसर सेल प्लास्टिसिटी को बढ़ावा देने में एक आवश्यक भूमिका निभाता है और दवा प्रतिरोध और मेटास्टेसिस 49में परिणाम देता है। इसलिए, विशिष्ट साइटोटॉक्सिक दवाओं50 के साथ ईएमटी-व्युत्पन्न कोशिकाओं को लक्षित करना या मेसेंचिमल-टू-एपिथेलियल ट्रांजिशन (एमईटी)51 के माध्यम से पुनर्संरुतीकरण को कैंसर सेल मेटास्टेसिस और चिकित्सा प्रतिरोध को दूर करने के लिए एक दृष्टिकोण के रूप में प्रस्तावित किया गया है। हालांकि, मेट दूर के अंगों52में प्रसारित कैंसर कोशिकाओं के प्रसार में योगदान देता है, जो ईएमटी के चिकित्सीय प्रतिवर्तन का उपयोग करते समय उल्टा हो सकता है। हाल ही में, एक नए अध्ययन ने सीधे एडीपोसाइट्स30में भेदभाव के लिए EMT-व्युत्पन्न स्तन कैंसर कोशिकाओं को लक्षित करके एक चिकित्सीय अंतरव्यवहार दृष्टिकोण की सूचना दी । इशाय-रोने एट की पढ़ाई । अल.30 ने Py2T मुरीन एपिथेलियल कैंसर कोशिकाओं का उपयोग किया जो टीजीएफ-β के साथ दीर्घकालिक उपचार के जवाब में मेसेंचिमल कोशिकाओं में संक्रमण से गुजरा था। उन्होंने दिखा दिया कि एमईके अवरोधकों के संयोजन में रोसिग्लिटाज़ोन ने एपिथेलियल भेदभाव और एडिपोजेनेसिस को बढ़ाया। हालांकि, हमने पाया कि अकेले रोसिग्लिटाज़ोन मेसेंचिमल पाइ2टी मुरीन कोशिकाओं के अंतर को एडीपोसाइट्स में प्रेरित करने के लिए पर्याप्त था।
संक्षेप में, इस अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले तरीकों ने टीजीएफ-β सिग्नलिंग और टीजीएफ-β-प्रेरित ईएमटी की जांच करने के लिए एक तार्किक कार्यप्रवाह प्रदान किया। दो अवरोधक, SB431542 और GW788388, टीजीएफ-β-प्रेरित प्रतिक्रियाओं और EMT को ब्लॉक कर सकते हैं । इसके अलावा, हमने अकेले रोसिग्लिटाज़ोन का भी प्रदर्शन किया, जो कुछ टीजीएफ-β-प्रेरित मेसेन्चिमल स्तन कैंसर कोशिकाओं में एडिपोजेनेसिस को प्रेरित करता है। हालांकि हम केवल कई स्तन कैंसर सेल लाइनों का इस्तेमाल किया TGF β प्रतिक्रियाओं की जांच, यहां वर्णित तरीकों अंय (कैंसर) कोशिकाओं को एक्सपेरिमेंट किया जा सकता है । यहां, हमने सेलुलर प्रतिक्रियाओं को प्रेरित करने के लिए विभिन्न टीजीएफ-β सांद्रता का उपयोग किया। अधिकांश सेल प्रकारों में, टीजीएफ-β 0.01-10 एनजी/एमएल53 की एकाग्रता सीमा में अपनी जैविक गतिविधि डालती है और खुराक-प्रतिक्रिया पैटर्न में सिग्नलिंग लाती है। प्राथमिक एंडोथेलियल कोशिकाओं में, गोजातीय महाधमनी एंडोथेलियल कोशिकाओं सहित, टीजीएफ-β ने 0.025 एनजी/एमएल पर फॉस्फोरलेटेड SMAD2 की पर्याप्त अभिव्यक्ति को प्रेरित किया, 0.25 एनजी/एमएल पर अधिकतम पहुंच गया, और उच्च सांद्रता53के जवाब में इस स्तर पर बने रहे। हमारे अध्ययन में, हमने मजबूत प्रतिक्रियाएं प्राप्त करने के लिए ट्रांसक्रिप्शनल रिपोर्टर परख के लिए MCF10A-Ras कोशिकाओं में TGF-β (5 एनजी/एमएल) की उच्च एकाग्रता का उपयोग किया। SMAD2 फॉस्फोरिलेशन और लक्ष्य जीन अभिव्यक्ति को कम खुराक पर टीजीएफ-β द्वारा प्रेरित किया जा सकता है; इस प्रकार, हमने कोशिकाओं के इलाज के लिए 2.5 एनजी/एमएल टीजीएफ-β का उपयोग किया। हालांकि, सबसे उपयुक्त काम एकाग्रता सेल प्रकार और अनुमानित प्रभावों पर निर्भर करती है। टीजीएफ-β की सबसे अच्छी एकाग्रता निर्धारित करने के लिए, विभिन्न खुराक (कम से उच्च) कोशिकाओं का इलाज करने की सिफारिश की जाती है।

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61830/studying-tgf-signaling-tgf-induced-epithelial-to-mesenchymal">Studying TGF-&#946; Signaling and TGF-&#946;-induced Epithelial-to-mesenchymal Transition in Breast Cancer and Normal Cells</a>.&#160;NMuMG was mislabeled as&#160;cancer cells.
NMuMG cells are non-transformed epithelial breast cells established from a mouse mammary gland. NMuMG cells are frequently used as a model system to investigate TGF-&#946;-induced epithelial to mesenchymal transition (EMT). EMT is induced by TGF-&#946; in premalignant human MCF 10A-RAS (M2) cells and mouse MMTV-PyMT breast cancer cell line. The article has been updated to reflect this.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61830/studying-tgf-signaling-tgf-induced-epithelial-to-mesenchymal">Studying TGF-&#946; Signaling and TGF-&#946;-induced Epithelial-to-mesenchymal Transition in Breast Cancer and Normal Cells</a>.&#160;NMuMG was mislabeled as&#160;cancer cells.

Erratum: Studying TGF-&#946; Signaling and TGF-&#946;-induced Epithelial-to-mesenchymal Transition in Breast Cancer and Normal Cells

साइटोकिन ट्रांसफॉर्मिंग ग्रोथ फैक्टर-β (टीजीएफ-β) टीजीएफ-एएनएस (यानी, टीजीएफ-1, -2 और -3), बोन मोर्फोजेनिक प्रोटीन (बीएमपीएस) और एक्टिव्स1,2सहित संरचनात्मक और कार्यात्मक रूप से संबंधित नियामक पॉलीपेप्टिड्स के एक बड़े समूह का प्रोटोटाइप है। ये साइटोकिन्स भ्रूणीय विकास और ऊतक और अंग हो्योस्टेसिस 3 को बनाए रखने में महत्वपूर्ण भूमिकानिभातेहैं । टीजीएफ-β के गलत तरीके से कैंसर4,5सहित कई तरह की बीमारियां हो सकती हैं । टीजीएफ-β कैंसर की प्रगति में एक जटिल, दोहरी भूमिका निभाता है: सामान्य और प्रेमलग्नंट एपिथेलियल कोशिकाओं में, टीजीएफ-β प्रसार को बाधित करके ट्यूमर-दमन के रूप में व्यवहार करता है और एपोप्टोसिस6,7को प्रेरित करता है; हालांकि, ट्यूमर प्रगति के अंतिम चरण में, जब साइटोस्टैटिक प्रतिक्रियाओं को ऑन्कोजीन की सक्रियता या ट्यूमर दबाने वाले जीन के नुकसान से अवरुद्ध कर दिया जाता है, टीजीएफ-β कैंसर कोशिकाओं में एपिथेलियल-टू-मेसेंचिमल संक्रमण (ईएमटी) को बढ़ावा देकर ट्यूमर बढ़ाने का काम करता है, जिससे कैंसर सेल आक्रमण और मेटास्टेसिस को सक्षम करता है, ट्यूमर माइक्रोएनवायरनमेंट में कोशिकाओं पर अभिनय, और एंजियोजेनेसिस और प्रतिरक्षा चोरी8,9,10को उत्तेजित करता है।
टीजीएफ-β को परिपक्व कार्बोक्सी-टर्मिनल टीजीएफ-β और विलंबता से जुड़े पेप्टाइड (एलएपी)11से युक्त एक निष्क्रिय अग्रदूत अणु के रूप में स्रावित किया जाता है। इस छोटे से परिसर को अव्यक्त टीजीएफ-β-बाइंडिंग प्रोटीन (एलटीबीपी)12से सहसंबद्ध किया जा सकता है । परिपक्व टीजीएफ-β की रिहाई विशिष्ट प्रोटीज की कार्रवाई द्वारा मध्यस्थता की जा सकती है जो लैप को क्लीव करती है या एक इंटीग्रीन-निर्भर प्रक्रिया13,14में गोद के यांत्रिक खींच द्वारा। एलटीबीपी के अलावा, ग्लाइकोप्रोटीन एक पुनरावृत्ति प्रमुख (जीएआरपी) नियामक टी कोशिकाओं (ट्रेग्स) की सतह पर अत्यधिक व्यक्त किया जाता है और टीजीएफ-β15, 16की सक्रियता को विनियमित करने में एलटीबीपी के समान भूमिका निभाता है। GARP सीधे डिसल्फाइड लिंकेज और नॉनकोवेलेंट एसोसिएशन के माध्यम से अव्यक्त टीजीएफ-β को बांधता है। GARP/TGF-β परिसर से टीजीएफ-β की सक्रियता के लिए इंटीग्रिटीज17की आवश्यकता होती है । परिपक्व टीजीएफ-β सिग्नलिंग शुरू करने के लिए टीजीएफ-β सेरीन/थ्रेनिन किनेज रिसेप्टर्स, यानी टीजीएफ-β टाइप I (TοRI) और टीजीएफ-β टाइप II (TοRII) रिसेप्टर्स18 से बांधता है । TGF-β T <3> के लिए TοRII के लिए बाध्यकारी TοRI की भर्ती और एक विषमता परिसर के गठन को बढ़ावा देता है । इसके बाद, Tsri को एक छोटी ग्लाइसिन-और सेरीन-रिच (जीएस) आकृति में सेरीन और थ्रेओनिन अवशेषों पर TsriI kinase द्वारा फॉस्फोरिलेटेड किया गया है, जिसके परिणामस्वरूप इसकी सक्रियता19,20है। सक्रियण पर, सक्रिय TοRI रंगरूटों और फॉस्फोरलेट अपने सब्सट्रेट्स: दो रिसेप्टर विशिष्ट SMADs (आर-SMADs) जिसमें SMAD2 और SMAD3(चित्रा 1)शामिल हैं । आर-SMADs दो तथाकथित पागल होमोलॉजी डोमेन, MH1 और MH2 के साथ एक समान समग्र संरचना साझा करते हैं, जो एक प्रोलाइन-रिच लिंकर क्षेत्र(चित्रा 2)से अलग हैं। SMAD3 के MH1 डोमेन के भीतर डीएनए बाध्यकारी आकृति SMAD2 और SMAD3 के बीच संरक्षित नहीं है, और SMAD2 सीधे अपने MH1 डोमेन (exon 3 और L1) में दो सम्मिलन के कारण डीएनए बांध नहीं सकते हैं । SMAD2 और SMAD3 को उनके सी-टर्मिनी(चित्रा 2)में एसएसएक्सएस आकृति के फॉस्फोरिलेशन द्वारा सक्रिय किया जा सकता है। फॉस्फोरिलेटेड SMAD2/3 एक आम SMAD मध्यस्थ, SMAD4 के साथ हेट्रोमेरिक परिसरों का रूप लेते हैं, जो लक्ष्य जीन(चित्र 1)7,21के प्रतिलेखन को संशोधित करने के लिए नाभिक में स्थानांतरित होते हैं। यह विहित SMAD सिग्नलिंग मार्ग ठीक विनियमित है और विशिष्ट सेलुलर और ऊतक प्रतिक्रियाओं जैसे सेल भाग्य और ट्यूमर सेल मेटास्टेसिस और आक्रमण22के विनियमन के रूप में उत्पन्न करता है । टीजीएफ-β-SMAD सिग्नलिंग के अलावा, डाउनस्ट्रीम सेलुलर प्रतिक्रियाओं को विनियमित करने के लिए रिसेप्टर्स द्वारा गैर-SMAD सिग्नलिंग रास्ते भी सीधे सक्रिय किए जा सकते हैं23।
ट्यूमर प्रगति के दौरान, ईएमटी के प्रेरण के लिए टीजीएफ-β-प्रेरित SMAD-निर्भर और SMAD-स्वतंत्र रास्ते की सक्रियता की आवश्यकता होती है। ईएमटी एक प्रतिवर्ती प्रक्रिया है जिसमें ट्यूमर कोशिकाएं एक एपिथेलियल फेनोटाइप से अलग होती हैं, जो सेल-सेल संपर्कों के नुकसान से जुड़ी होती है और एपिकल-बेसल ध्रुवीयता में कमी आती है, जो बढ़ी हुई गतिशीलता और आक्रमण क्षमता24के साथ एक मेसेंकिमल फेनोटाइप के लिए होती है। ईएमटी को एन-कैडेरिन, विमेंटिन, जेब2 और घोंघा/2 सहित मेसेंचिमल मार्कर प्रोटीन की बढ़ी हुई अभिव्यक्ति और ई-कैडेरिन और β-कैटेरिन(चित्र 3)25जैसे एपिथेलियल मार्कर के सहवर्ती डाउनरेगुलेशन की विशेषता है। हालांकि, एक एपिथेलियल से एक मेसेंचिमल राज्य में संक्रमण अक्सर अधूरा होता है, और कोशिकाओं को मिश्रित एपिथेलियल और मेसेंचिमल (ई/एम) विशेषताओं का लाभ होता है। इंटरनेशनल ईएमटी एसोसिएशन द्वारा हाल ही में एक पत्र में मध्यवर्ती ई/एम फेनोटाइपिक राज्यों से गुजरने वाली कोशिकाओं की प्रक्रिया को एपिथेलियल-मेसेनचिमल प्लास्टिसिटी (ईएमपी)26के रूप में वर्णन करने का प्रस्ताव किया गया था । यह प्लास्टिसिटी आंशिक ईएमटी, हाइब्रिड ई/एम स्थिति, एक मेटास्टेबल ईएमटी स्टेट, एक ईएमटी सातत्य और एक ईएमटी स्पेक्ट्रम26को संदर्भित करता है । ईएमटी के दौरान, ट्यूमर कोशिकाएं कैंसर स्टेम सेल (सीएससी) गुणों को प्राप्त करती हैं और टुकड़ी-प्रेरित एपोप्टोसिस27के लिए अधिक प्रतिरोधी हो जाती हैं। जबकि ईएमटी प्राथमिक ट्यूमर कोशिकाओं में एक आक्रामक फेनोटाइप के अधिग्रहण के लिए जिम्मेदार है और कैंसर की प्रगति को चलाता है,इसकेविपरीत, मेसेंचिमल-एपिथेलियल संक्रमण (मेट) को दूर मेटास्टैटिक साइटों28, 29पर प्रसारित ट्यूमर कोशिकाओं की वृद्धि में महत्वपूर्ण भूमिका निभाने के लिए दिखाया गया है। हाल ही में एक अध्ययन से पता चला है कि EMT-व्युत्पन्न स्तन कैंसर कोशिकाओं को adipocytes में स्थानांतरित किया जा सकता है, जो मेटास्टेसिस को बाधित करने और ट्यूमर कोशिकाओं में चिकित्सा प्रतिरोध को दूर करने और कैंसर30को समाप्त करने का अवसर प्रदान कर सकता है । स्तन कैंसरजनन में ईएमटी की सक्रियता में टीजीएफ-β सिग्नलिंग की महत्वपूर्ण भूमिका के कारण, हम पश्चिमी ब्लॉटिंग के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल, एक लूसिफ़ेरेस ट्रांसक्रिप्शनल रिपोर्टर परख, मात्रात्मक वास्तविक समय-बहुलक चेन रिएक्शन (क्यूआरटी-पीसीआर), और टीजीएफ-β सिग्नलिंग, टीजीएफ-β-प्रेरित ईएमटी की जांच के लिए इम्यूनोफ्लोरेसेंस, और एडीपो में ईएमटी-व्युत्पन्न मुरीन स्तन एपिथेलियल ट्यूमर सेप्टेस के स्थानांतरण के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। ये तकनीक सेल बायोलॉजी फील्ड में सबसे ज्यादा इस्तेमाल होने वाले एनालिटिकल टूल्स हैं । क्यूआरटी-पीसीआर का उपयोग मात्रात्मक तरीके से एमआरएनए अभिव्यक्ति के स्तर का पता लगाने, विशेषता और मात्रा निर्धारित करने के लिए किया जाता है। मात्रात्मक पीसीआर (क्यूपीसीआर), एक वैकल्पिक तकनीक की तुलना में, रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन (आरटी) -पीसीआर का उपयोग अर्ध-मात्रात्मक तरीके से एमआरएनए अभिव्यक्ति निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है31,32। पश्चिमी ब्लॉटिंग का उपयोग अर्ध-मात्रात्मक तरीके से संवेदनशीलता और विशिष्टता के फायदों के साथ दिए गए सेल lysate नमूने में विशिष्ट प्रोटीन के स्तर की जांच करने के लिए किया जाता है। इस प्रकार, हम टीजीएफ-β सिग्नलिंग की जांच करने में मदद करने के लिए जीन अभिव्यक्ति से प्रोटीन अभिव्यक्ति में परिवर्तन का विश्लेषण करने के लिए एक व्यवस्थित कार्यप्रवाह प्रस्तुत करते हैं जिसे अन्य सिग्नलिंग रास्तों पर भी लागू किया जा सकता है।

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagent</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18 mm-side square glass coverslips</td>
			<td>Menzel Gl&#228;ser</td>
			<td>631-1331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#8242;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Phalloidin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A12379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 555 secondary antibody</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-21422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-E-cadherin antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>610181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase(GAPDH) antibody</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>MAB374</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-N-cadherin antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>610920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Slug antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>9585</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-SMAD2/3 antibody</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>610842</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Snail antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>3879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Tubulin antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>2148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholera enterotoxin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clarity Western ECL Substrate</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1705060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DC protein assay kit</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>5000111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM-high glucose</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11965092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM-high glucose medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11965092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium (DMEM)/F12</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11039047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>epidermal growth factor (EGF)</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>01-107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>BioWest</td>
			<td>S1860-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GoTaq qPCR Master Mix</td>
			<td>PROMEGA</td>
			<td>A600X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>26050088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H0135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>91077C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11836153001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoSpin RNA II kit</td>
			<td>BIOKE&#180;</td>
			<td>740955</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin (Pen-Strep)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylenimine (PEI)</td>
			<td>Polyscience</td>
			<td>23966</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>IPVH00010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ponceau S solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>K1621</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skimmed milk</td>
			<td>Campina: Elk</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChemiDoc Imaging System</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>17001402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFX Connect Detection System</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1855201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminometer</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>2030-0050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ND-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

studying tgf-&#946; signaling and tgf-&#946;-induced epithelial-to-mesenchymal transition in breast cancer and normal cells

विकास कारक-β (टीजीएफ-β) को बदलना एक स्रावित बहुआयामी कारक है जो अंतरकोशिकीय संचार में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। टीजीएफ-β सिग्नलिंग के क्षोभ स्तन कैंसर का कारण बन सकते हैं। टीजीएफ-β विशिष्ट सेल सतह टीजीएफ-β प्रकार के माध्यम से प्रसार और भेदभाव पर इसके प्रभाव को प्रकाश में डालता है और द्वितीय रिसेप्टर्स (यानी, त्ग्री और ट्राइआरआईआई) टाइप करता है जिसमें एक आंतरिक सेरीन/थ्रेओनीन किनेज़ डोमेन होता है। टीजीएफ-β-प्रेरित हेट्रोमेरिक कॉम्प्लेक्स गठन पर, सक्रिय TοRI फॉस्फोरिटिंग SMAD2 और SMAD3 द्वारा इंट्रासेल्युलर सिग्नलिंग प्राप्त करता है। ये सक्रिय SMADs विशिष्ट लक्ष्य जीन को विनियमित करने के लिए SMAD4 के साथ विषममैरिक परिसर बनाते हैं, जिसमें प्लाज्मिनोजेन एक्टिवेशन अवरोधक 1 (पाई-1, SERPINE1 जीन द्वारा एन्कोड किया गया) शामिल है। एपिथेलियल-टू-मेसेंचिमल संक्रमण (ईएमटी) का प्रेरण प्राथमिक स्थल पर या दूर की साइटों पर उपनिवेशीकरण के दौरान एपिथेलियल कैंसर कोशिकाओं को एक आक्रामक फेनोटाइप हासिल करने और ट्यूमर प्रगति को चलाने की अनुमति देता है। TGF-β EMT ड्राइविंग द्वारा स्तन कैंसर आक्रमण के एक शक्तिशाली प्रेरक के रूप में कार्य करता है । यहां, हम उदाहरण के रूप में प्रेमलग्नंत मानव MCF10A-आरएएस (M2) कोशिकाओं और माउस एनएमएमजी एपिथेलियल कोशिकाओं का उपयोग करके टीजीएफ-β सिग्नलिंग और ईएमटी प्रतिक्रियाओं की जांच करने के लिए व्यवस्थित तरीकों का वर्णन करते हैं। हम पश्चिमी ब्लॉटिंग, SMAD3/SMAD4-निर्भर ट्रांसक्रिप्शनल गतिविधि द्वारा टीजीएफ-β-प्रेरित SMAD2 फॉस्फोरिलेशन का निर्धारण करने के तरीकों का वर्णन करते हैं, जो मात्रात्मक वास्तविक समय-बहुलक श्रृंखला प्रतिक्रिया (क्यूआरटी-पीसीआर) द्वारा लूसिफ़ेरेस रिपोर्टर गतिविधि और SERPINE1 लक्ष्य जीन अभिव्यक्ति का उपयोग करके है। इसके अलावा, आकृति विज्ञान, एपिथेलियल और मेसेंचिमल मार्कर अभिव्यक्ति, फिलामेंटस ऐक्टिन स्टेनिंग और ई-कैडेरिन के इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला में परिवर्तन को मापने के द्वारा टीजीएफ-β-प्रेरित ईएमटी की जांच करने के लिए तरीकों का वर्णन किया गया है। दो चयनात्मक छोटे अणु TGF-β रिसेप्टर kinase अवरोधकों, GW788388 और SB431542, TGF-β प्रेरित SMAD2 phosphorylation, लक्ष्य जीन और EMT मार्कर अभिव्यक्ति में परिवर्तन ब्लॉक करने के लिए इस्तेमाल किया गया । इसके अलावा, हम एडिपोसाइट्स में मेसेंचिमल स्तन Py2T मुरीन एपिथेलियल ट्यूमर कोशिकाओं के अंतर-अंतर का वर्णन करते हैं। स्तन कैंसर में टीजीएफ-β-प्रेरित सिग्नलिंग और ईएमटी की जांच करने के तरीके स्तन कैंसर के लिए नए चिकित्सीय दृष्टिकोणों में योगदान दे सकते हैं।

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Studying TGF-&#946; Signaling and TGF-&#946;-induced Epithelial-to-mesenchymal Transition in Breast Cancer and Normal Cells

हम इस सिग्नलिंग मार्ग में शामिल प्रोटीन और जीन अभिव्यक्ति का अध्ययन करके टीजीएफ-β सिग्नलिंग और टीजीएफ-β-प्रेरित ईएमटी की जांच करने के लिए एक व्यवस्थित कार्यप्रवाह का वर्णन करते हैं। इन तरीकों में वेस्टर्न ब्लॉटिंग, एक लूसिफ़ेरेस रिपोर्टर परख, क्यूपीसीआर और इम्यूनोफ्लोरेसेंस स्टेनिंग शामिल हैं ।

स्तन कैंसर और सामान्य कोशिकाओं में टीजीएफ-β सिग्नलिंग और टीजीएफ-β-प्रेरित एपिथेलियल-टू-मेसेन्चिमल संक्रमण का अध्ययन

Transforming growth factor-&#946; (TGF-&#946;) is a secreted multifunctional factor that plays a key role in intercellular communication. Perturbations of ...

TGF-beta is a main driver of epithelial-to-mesenchymal transition, in short EMT, which can occur both in normal and in cancer cells. The methods that are described in our protocol allow researchers to measure the impact of modulators on both TGF-beta SMAD signaling and TGF-beta-induced EMT. The untransformed NMuMG cells, which were established from a mouse mammary gland, is a frequently used model system for TGF-beta-induced EMT.TGF-beta provokes in these cells, these NMuMG cells a very strong EMT response. A similar response can also be seen in breast cancer cells where it contributes to cancer progression. The combined staining of epithelial micro E-cadherin and organization of filamentous-actin helps to validate and better visualize the morphological changes that occur during epithelial-to-mesenchymal transition.The acquisition of a mesenchymal phenotype by cancer cells has been linked to an increased ability of cells to migrate, to invade, and to metastasize, as well as to chemotherapy resistance. This method may provide important insights into cancer progression, but also into other processes such as tissue fibrosis. While attempting this protocol, keep in mind that cell density should be well-controlled.High density of the cells makes epithelial-to-mesenchymal transition difficult. With this visual demonstration, researchers will get a good grasp on how to perform TGF-beta signaling and TGF-beta-induced EMT experiments. To perform indirect immunofluorescent staining of E-cadherin, begin by placing sterile 18 millimeter square glass coverslips in six-well plates, one coverslip per well.Seed 100, 000 NMuMG cells with two milliliters of complete DMEM into each well and allow the cells to adhere overnight. Non-transformed NMuMG cells are frequently used as a model system to investigate TGF-beta-induced EMT. On the next day, gently move the coverslips with adherent cells to a new six-well plate and add two milliliters of culture medium to the wells.Treat the cells with ligand buffer as a control or five nanograms per milliliter of TGF-beta for two days. The added ligand buffer should be the same volume as the added TGF-beta. After the treatment, remove the culture medium and gently wash the cells twice with one milliliter of pre-warmed PBS.Fix the cells by adding one milliliter of 4%paraformaldehyde and incubating for 30 minutes at room temperature, then gently wash the cells twice with one milliliter of PBS. Permeabilize the fixed cells with 0.1%Triton X-100 for 10 minutes at room temperature and wash the cells twice with PBS. Block the non-specific protein binding to cells with 5%BSA in PBS for one hour at room temperature, then repeat the washes with PBS.Add the primary antibody against E-cadherin to the top of each coverslip and incubate for one hour at room temperature. Remove the primary antibody and wash each coverslip with PBS three times. Add the Alexa Fluor 555 secondary antibody and the Alexa Fluor 488 phalloidin to the top of each coverslip.Then cover with aluminum foil and incubate for one hour at room temperature. Remove the secondary antibody and wash the coverslip three times with PBS. Mount the coverslip with the cells facing downward onto glass slides using mounting medium with DAPI and store the mounted slides in a box at four degrees Celsius protected from light.Observe the staining with SP8 confocal microscopy. In the MCF10A-Ras cell line, the phosphorylation of SMAD2 significantly increased in response to TGF-beta stimulation, while the expression of total SMAD2 and 3 was not affected. TGF-beta also markedly induced the luciferase reporter in the MCF10A-Ras cell line compared to non-treated cells.Well-characterized direct transcriptional gene targets of TGF-beta, including SMAD7 and SERPINE1, were highly expressed in TGF-beta-treated MCF10A-Ras breast cells. NMuMG epithelial cells treated with TGF-beta changed from a classic epithelial morphology to a spindle-shaped mesenchymal-like morphology. Consistent with the morphological changes, TGF-beta treatment led to an increase in the protein expression of mesenchymal markers.In contrast, E-cadherin, an epithelial marker, was down-regulated after two days of TGF-beta treatment. Quantitative real-time polymerase PCR was used to investigate the gene expression of EMT markers after TGF-beta stimulation. CDH1 was significantly decreased while mesenchymal markers were increased.Upon TGF-beta stimulation, NMuMG cells expressed less E-cadherin than the cells in the control group. Moreover, the cells formed more actin stress fibers in the presence of TGF-beta. Treatment with GW788388 inhibited TGF-beta-induced SMAD2 phosphorylation in a dose-dependent manner.Additionally, the TGF-beta-mediated phosphorylation of SMAD2 was blocked by SB-431542 treatment. Both SB-431542 and GW788388 significantly inhibited the TGF-beta-induced nuclear translocation and accumulation of SMAD2 and 3 in NMuMG cells. Following this procedure, immunofluorescent staining of other epithelial-to-mesenchymal macroproteins can be performed by changing the specific primary and secondary antibodies to investigate the expression level and the localization of these proteins within the cell.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Utilizing Functional Genomics Screening to Identify Potentially Novel Drug Targets in Cancer Cell Spheroid Cultures

उपयोग कार्यात्मक जीनोमिक्स स्क्रीनिंग कैंसर सेल उपगोल संस्कृतियों में संभावित उपन्यास ड्रग लक्ष्यों की पहचान करने के लिए

The identification of functional driver events in cancer is central to furthering our understanding of cancer biology and indispensable for the discovery ...

Synthesis and Characterization of an Aspirin-fumarate Prodrug that Inhibits NF&#954;B Activity and Breast Cancer Stem Cells

संश्लेषण और एक एस्पिरिन-fumarate प्रोड्रग की विशेषता है कि NFκB गतिविधि और स्तन कैंसर स्टेम कोशिकाओं को रोकता है

Inflammation is a cancer hallmark that underlies cancer incidence and promotion, and eventually progression to metastasis. Therefore, adding an ...

Invasive Behavior of Human Breast Cancer Cells in Embryonic Zebrafish

भ्रूणीय Zebrafish में मानव स्तन कैंसर की कोशिकाओं के आक्रामक व्यवहार

In many cases, cancer patients do not die of a primary tumor, but rather because of metastasis. Although numerous rodent models are available for studying ...

Isolation of Human Endothelial Cells from Normal Colon and Colorectal Carcinoma - An Improved Protocol

सामान्य बृहदांत्र और कोलोरेक्टल कार्सिनोमा से मानव Endothelial कोशिकाओं का अलगाव-एक बेहतर प्रोटोकॉल

Primary cells isolated from human carcinomas are valuable tools to identify pathogenic mechanisms contributing to disease development and progression. In ...

Studying Normal Tissue Radiation Effects using Extracellular Matrix Hydrogels

Extracellular मैट्रिक्स hydrogels का उपयोग कर सामान्य ऊतक विकिरण प्रभाव का अध्ययन

Radiation is a therapy for patients with triple negative breast cancer. The effect of radiation on the extracellular matrix (ECM) of healthy breast tissue ...

Characterize Disease-related Mutants of RAF Family Kinases by Using a Set of Practical and Feasible Methods

व्यावहारिक और संभावित तरीकों का एक सेट का उपयोग करके आरएएफ परिवार Kinases के रोग से संबंधित उत्परिवर्ती विशेषता

The rapidly accelerated fibrosarcoma (RAF) family kinases play a central role in cell biology and their dysfunction leads to cancers and developmental ...

Obtaining Cancer Stem Cell Spheres from Gynecological and Breast Cancer Tumors

स्त्री रोग और स्तन कैंसर ट्यूमर से कैंसर स्टेम सेल क्षेत्रों प्राप्त करना

Cancer stem cells (CSC) are a small population with self-renewal and plasticity which are responsible for tumorigenesis, resistance to treatment and ...

Differentiation of Mouse Breast Epithelial HC11 and EpH4 Cells

माउस स्तन एपिथेलियल एचसी11 और ईपीएच 4 कोशिकाओं का भेदभाव

Cadherins play an important role in the regulation of cell differentiation as well as neoplasia. Here we describe the origins and methods of the induction ...

Studying Triple Negative Breast Cancer Using Orthotopic Breast Cancer Model

ऑर्थोटोपिक स्तन कैंसर मॉडल का उपयोग कर ट्रिपल नकारात्मक स्तन कैंसर का अध्ययन

Triple-negative breast cancer (TNBC) is an aggressive breast cancer subtype with limited therapeutic options. When compared to patients with less ...

Orthotopic Transplantation of Breast Tumors as Preclinical Models for Breast Cancer

स्तन कैंसर के लिए प्रीक्लिनिकल मॉडल के रूप में स्तन ट्यूमर का आर्थोटोपिक प्रत्यारोपण

Preclinical models that faithfully recapitulate tumor heterogeneity and therapeutic response are critical for translational breast cancer research. ...