Name: quantitative proteomics workflow using multiple reaction monitoring based detection of proteins from human brain tissue
Uploaded: 2021-08-28T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Proteomics Workflow using Multiple Reaction Monitoring Based Detection of Proteins from Human Brain Tissue at JoVE.com

نعترف بمشروع MHRD-UAY (UCHHATAR AVISHKAR YOJANA)، #34_IITB المشروع إلى مرفق SS و MASSFIITB في IIT Bombay بدعم من إدارة التكنولوجيا الحيوية (BT/PR13114/INF/22/206/2015) لإجراء جميع التجارب المتعلقة بالتصلب المتعدد.
ونعرب عن شكرنا الخاص للسيد ريشابه ياداف على إنتاج وتحرير الفيديو بأكمله والسيد نيشانت نيروكار على عمله في تحرير الصوت.

تتضمن هذه الدراسة عينات من أنسجة الدماغ من المشاركين البشريين، تمت مراجعتها والموافقة عليها من قبل TMH وIITB IEC - (IITB-IEC/2018/019). وقدم المشاركون موافقتهم المستنيرة والمكتوبة على المشاركة في هذه الدراسة.
1 استخراج البروتين من أنسجة الدماغ
<ol><li>تزن حوالي 50 ملغ من أنسجة الدماغ وغسل ال...

<ol>
	<li>Picotti, P., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selected+reaction+monitoring-based+proteomics:+Workflows,+potential,+pitfalls+and+future+directions.">Selected reaction monitoring-based proteomics: Workflows, potential, pitfalls and future directions.</a> Nature Methods. , (2012).</li><li>Carr, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+peptide+measurements+in+biology+and+medicine:+Best+practices+for+mass+spectrometry-based+assay+development+using+a+fit-for-purpose+approach.">Targeted peptide measurements in biology and medicine: Best practices for mass spectrometry-based assay development using a fit-for-purpose approach.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 13 (3), 907-917 (2014).</li><li>Pitt, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+and+applications+of+liquid+chromatography-mass+spectrometry+in+clinical+biochemistry.">Principles and applications of liquid chromatography-mass spectrometry in clinical biochemistry.</a> The Clinical biochemist Reviews. 30 (1), 19-34 (2009).</li><li>Hosp, F., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Primer+on+Concepts+and+Applications+of+Proteomics+in+Neuroscience.">A Primer on Concepts and Applications of Proteomics in Neuroscience.</a> Neuron. 96 (3), 558-571 (2017).</li><li>Scopes, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+protein+by+spectrophotometry+at+205+nm.">Measurement of protein by spectrophotometry at 205 nm.</a> Analytical Biochemistry. , (1974).</li><li>Kusebauch, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+SRMAtlas:+A+Resource+of+Targeted+Assays+to+Quantify+the+Complete+Human+Proteome.">Human SRMAtlas: A Resource of Targeted Assays to Quantify the Complete Human Proteome.</a> Cell. , (2016).</li><li>MacLean, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skyline:+an+open+source+document+editor+for+creating+and+analyzing+targeted+proteomics+experiments.">Skyline: an open source document editor for creating and analyzing targeted proteomics experiments.</a> Bioinformatics. 26 (7), 966-968 (2010).</li><li>Gerber, S. A., Rush, J., Stemman, O., Kirschner, M. W., Gygi, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absolute+quantification+of+proteins+and+phosphoproteins+from+cell+lysates+by+tandem+MS.">Absolute quantification of proteins and phosphoproteins from cell lysates by tandem MS.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2003).</li><li>Escher, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+iRT,+a+normalized+retention+time+for+more+targeted+measurement+of+peptides.">Using iRT, a normalized retention time for more targeted measurement of peptides.</a> Proteomics. , (2012).</li><li>Gillette, M. A., Carr, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+peptides+and+proteins+in+biomedicine+by+targeted+mass+spectrometry.">Quantitative analysis of peptides and proteins in biomedicine by targeted mass spectrometry.</a> Nature Methods. 10 (1), 28-34 (2013).</li><li>Whiteaker, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+targeted+proteomics-based+pipeline+for+verification+of+biomarkers+in+plasma.">A targeted proteomics-based pipeline for verification of biomarkers in plasma.</a> Nature Biotechnology. , (2011).</li><li>H&#252;ttenhain, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproducible+quantification+of+cancer-associated+proteins+in+body+fluids+using+targeted+proteomics.">Reproducible quantification of cancer-associated proteins in body fluids using targeted proteomics.</a> Science Translational Medicine. 4 (142), 94 (2012).</li><li>Mermelekas, G., Vlahou, A., Zoidakis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SRM/MRM+targeted+proteomics+as+a+tool+for+biomarker+validation+and+absolute+quantification+in+human+urine.">SRM/MRM targeted proteomics as a tool for biomarker validation and absolute quantification in human urine.</a> Expert Review of Molecular Diagnostics. 15 (11), 1441-1454 (2015).</li><li>Koldamova, R. P., Lefterov, I. M., Lefterova, M. I., Lazo, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apolipoprotein+A-I+directly+interacts+with+amyloid+precursor+protein+and+inhibits+A&#946;+aggregation+and+toxicity.">Apolipoprotein A-I directly interacts with amyloid precursor protein and inhibits A&#946; aggregation and toxicity.</a> Biochemistry. , (2001).</li><li>Jiang, S. X., Slinn, J., Aylsworth, A., Hou, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vimentin+participates+in+microglia+activation+and+neurotoxicity+in+cerebral+ischemia.">Vimentin participates in microglia activation and neurotoxicity in cerebral ischemia.</a> Journal of Neurochemistry. , (2012).</li><li>Liu, L. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nicotinamide+Phosphoribosyltransferase+May+Be+Involved+in+Age-Related+Brain+Diseases.">Nicotinamide Phosphoribosyltransferase May Be Involved in Age-Related Brain Diseases.</a> PLoS ONE. , (2012).</li><li>Abbatiello, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+guidelines+for+publication+of+manuscripts+describing+development+and+application+of+targeted+mass+spectrometry+measurements+of+peptides+and+proteins.">New guidelines for publication of manuscripts describing development and application of targeted mass spectrometry measurements of peptides and proteins.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 16 (3), 327-328 (2017).</li></ol>

واعتبرت تقنيات مثل الكيمياء المناعية والنشاف الغربية كالمعايير الذهبية للتحقق من صحة أهداف البروتين لسنوات عديدة. هذه الأساليب تجد استخدام حتى اليوم مع تعديلات طفيفة في البروتوكول والاعتماد قليلا على التكنولوجيا مما يجعلها مرهقة جدا ومملة. وإلى جانب ذلك، فإنها تنطوي أيضا على استخدام ا?...

خلال العقد الماضي، ساعدت التطورات السريعة في قياس الطيف الكتلي (MS) إلى جانب زيادة فهم تقنيات الكروماتوغرافيا بشكل كبير في النهوض بالبروتيوميات القائمة على التصلب المتعدد. لطالما عانت التقنيات الجزيئية القائمة على البيولوجيا مثل النشاف الغربي والكيمياء المناعية من مشكلات الاستنساخ ، وبطء وقت التحول ، والتباين بين المراقبين وعدم قدرتها على تحديد البروتينات بدقة ، على سبيل المثال لا الحصر. وتحقيقا لهذه الغاية، فإن الحساسية الفائقة لنهج البروتيوميات عالية الإنتاجية لا تزال توفر لعلماء الأحياء الجزيئية أداة بديلة وأكثر موثوقية في سعيهم لفهم أفضل لأدوار البروتينات في الخلايا. ومع ذلك ، فإن نهج بروتيوميات البنادق (اكتساب البيانات المعتمدة أو DDA) غالبا ما تفشل في اكتشاف البروتينات المنخفضة الوفيرة في الأنسجة المعقدة إلى جانب كونها تعتمد بشكل كبير على حساسية ودقة الأداة. على مدى العامين الماضيين ، وقد تم تطوير مختبرات في جميع أنحاء العالم تقنيات مثل الحصول على البيانات المستقلة (DIA) التي تتطلب زيادة القدرة الحاسوبية والبرمجيات الموثوقة التي يمكن التعامل مع هذه مجموعات البيانات المعقدة للغاية. ومع ذلك، هذه التقنيات لا تزال العمل في التقدم وليس سهل الاستعمال جدا. توفر نهج البروتيوميات المستهدفة القائمة على التصلب المتعدد توازنا مثاليا بين الطبيعة العالية الإنتاجية لنهج التصلب المتعدد وحساسية نهج البيولوجيا الجزيئية مثل ELISA. تركز تجربة البروتيوميات الشاملة المستهدفة المستندة إلى قياس الطيف على اكتشاف البروتينات أو الببتيدات التي تحركها الفرضية من تجارب البروتيوميات القائمة على الاكتشاف أو من خلال الأدب المتاح1،2. رصد التفاعل المتعدد (MRM) هو واحد من هذه النهج التصلب المتعدد المستهدفة التي تستخدم مطياف كتلة رباعية جنبا إلى جنب للكشف الدقيق والتحديد الكمي للبروتينات / الببتيدات من عينات معقدة. توفر هذه التقنية حساسية وخصوصية أعلى على الرغم من أنها تتطلب استخدام أداة منخفضة الدقة.
يتكون رباعي القطب من 4 قضبان متوازية ، مع توصيل كل قضيب بالقضيب المعاكس قطريا. يتم إنشاء حقل متقلب بين قضبان quadrupole عن طريق تطبيق RF بالتناوب والجهد DC. يتأثر مسار الأيونات داخل الكوادروبول بوجود نفس الفولتية عبر قضبان مقابلة. من خلال تطبيق RF على الجهد DC، يمكن تثبيت مسار الأيونات. هذه الخاصية من quadrupole التي تسمح لاستخدامها كمرشح الشامل الذي يمكن أن تسمح انتقائي الأيونات محددة لتمرير من خلال. اعتمادا على الحاجة، يمكن تشغيل رباعي في وضع ثابت أو وضع المسح الضوئي. يسمح الوضع الثابت فقط لأيونات ذات m/z محددة بالمرور ، مما يجعل الوضع انتقائيا للغاية ومحددا لأيون الاهتمام. من ناحية أخرى، يسمح وضع المسح الضوئي لليونات عبر نطاق m/z بأكمله بالمرور. وهكذا، يمكن أن تعمل مطيافات الكتلة الرباعية الترادفية في 4 طرق ممكنة: 1) أول رباعي يعمل في الوضع الثابت بينما يعمل الثاني في وضع المسح الضوئي؛ و(ب) الأعمدة الرباعية الأولى التي تعمل في الوضع الساكن بينما تعمل الثانية في وضع المسح الضوئي؛ و(ب) الأعمدة الرباعية المطيافية للكتلة. ii) رباعية الأولى تعمل في وضع المسح الضوئي في حين أن التشغيل الثاني في وضع ثابت؛ 3) كل من quadrupoles تعمل في وضع المسح الضوئي؛ و4) كل من quadrupoles تعمل في وضع ثابت3. وفي تجربة نموذجية لMM، تعمل الأعمدة الرباعية في الوضع الساكن مما يسمح برصد سلائف محددة ومنتجاتها الناتجة بعد التجزؤ. وهذا يجعل هذه التقنية حساسة جدا وانتقائية مما يسمح للقياس الكمي الدقيق.
بالنسبة لعلماء الأحياء الجزيئية، فإن أنسجة الدماغ البشرية وخلاياها هي كنز. هذه الوحدات الرائعة من جهاز مثير للاهتمام من أي وقت مضى من جسم الإنسان يمكن أن توفر رؤى الجزيئية والخلوية في أدائها. يمكن التحقيقات Proteomic من أنسجة الدماغ لا تساعدنا فقط على فهم الأداء الجهازي للدماغ السليم ولكن أيضا المسارات الخلوية التي تحصل على dysregulated عندما تسببها بعض الأمراض4. ومع ذلك ، فإن أنسجة الدماغ مع كل عدم التجانس هو جهاز معقد جدا لتحليل ويتطلب نهجا منسقا لفهم أفضل للتغيرات على المستوى الجزيئي. يصف العمل التالي سير العمل بأكمله بدءا من استخراج البروتينات من أنسجة الدماغ ، وإنشاء وتحسين طرق فحص MRM ، إلى التحقق من الأهداف(الشكل 1). هنا، سلطنا الضوء بشكل منهجي على الخطوات الرئيسية المشاركة في تجربة ناجحة على أساس MRM باستخدام أنسجة الدماغ البشري بهدف إدخال هذه التقنية وتحدياتها إلى مجتمع بحثي أوسع.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile (MS grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A/0620/21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>TC194-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Fischer Scienific</td>
			<td>BP510-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid (MS grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>147930250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1149-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol (MS grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Q13827</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Fischer Scienific</td>
			<td>BP214-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol (MS grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A456-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS grade water</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>51140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>TL1006-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Roche Diagnostics</td>
			<td>11873580001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>DF6D661300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCEP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>646547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Merck</td>
			<td>648310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin (MS grade)</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>90058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Merck</td>
			<td>MB1D691237</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Supplies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypersil Gold C18 column</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>25002-102130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipettes</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F167380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stage tips</td>
			<td>MilliPore</td>
			<td>ZTC18M008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zirconia/Silica beads</td>
			<td>BioSpec products</td>
			<td>11079110z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bead beater (Homogeniser)</td>
			<td>Bertin Minilys</td>
			<td>P000673-MLYS0-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader (spectrophotometer)</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>MultiSkan Go</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td>Eutech</td>
			<td>CyberScan pH 510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Probe Sonicator</td>
			<td>Sonics Materials, Inc</td>
			<td>VCX 130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking Drybath</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>88880028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TSQ Altis mass spectrometer</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>TSQ02-10002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>uHPLC - Vanquish</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>VQF01-20001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum concentrator</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>Savant ISS 110</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative proteomics workflow using multiple reaction monitoring based detection of proteins from human brain tissue

التحليل البروتيوميكي لأنسجة الدماغ البشري على مدى العقد الماضي قد عزز بشكل كبير فهمنا للدماغ. ومع ذلك، لا تزال الاضطرابات المرتبطة بالدماغ مساهما رئيسيا في الوفيات في جميع أنحاء العالم، مما يستلزم الحاجة إلى فهم أكبر لعلم الأحياء المرضية. التقنيات التقليدية القائمة على الأجسام المضادة مثل النشاف الغربي أو الكيمياء المناعية تعاني من انخفاض الإنتاجية إلى جانب كونها كثيفة العمالة ونوعية أو شبه كمية. حتى النهج التقليدية بندقية الكتلة القائمة على الطيف تفشل في تقديم أدلة قاطعة لدعم فرضية معينة. نهج البروتيوميات المستهدفة هي إلى حد كبير فرضية مدفوعة وتختلف عن النهج التقليدية بروتيوميات البندقية التي كانت طويلة في الاستخدام. رصد رد الفعل المتعدد هو أحد هذه النهج المستهدف الذي يتطلب استخدام مطياف كتلة خاص يسمى مطياف الكتلة الرباعية الترادفية أو مطياف الكتلة الرباعي الثلاثي. في الدراسة الحالية، سلطنا الضوء بشكل منهجي على الخطوات الرئيسية التي ينطوي عليها تنفيذ سير عمل البروتيوميات الكتلي الترادفي الناجح القائم على قياس الطيف باستخدام أنسجة الدماغ البشري بهدف إدخال سير العمل هذا إلى مجتمع بحثي أوسع.

قمنا بإجراء تقدير كمي نسبي ل 3 بروتينات من 10 عينات، 5 عينات من كل مجموعة من المرضى الذين يعانون من تشوهات في الدماغ. وشملت هذه البروتينات Apolipoprotein A-I (APOA-I), فيمينتين (VIM) ونيكوتيناميد فوسفوريبوسيل ترانسفيراز (NAMPT) التي من المعروف أن أداء أدوار متنوعة في خلايا الدماغ. تم إجراء تحليل البيانات بعد ?...

Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Proteomics Workflow using Multiple Reaction Monitoring Based Detection of Proteins from Human Brain Tissue at JoVE.com

Quantitative Proteomics Workflow using Multiple Reaction Monitoring Based Detection of Proteins from Human Brain Tissue

يهدف البروتوكول إلى إدخال استخدام مطياف كتلة رباعي القطب ثلاثي لرصد التفاعل المتعدد (MRM) من البروتينات من العينات السريرية. لقد قدمنا سير عمل منهجي بدءا من إعداد العينات إلى تحليل البيانات للعينات السريرية مع جميع الاحتياطات اللازمة التي يتعين اتخاذها.

سير العمل البروتيومي الكمي باستخدام رصد التفاعل المتعدد القائم على الكشف عن البروتينات من أنسجة الدماغ البشري

The proteomic analysis of the human brain tissue over the last decade has greatly enhanced our understanding of the brain. However, brain related ...

وسرعان ما أصبحت النهج البروتيومية المستهدفة الطريقة المفضلة للتحقق من صحة البروتينات من التجارب القصيرة الأجل القائمة على البروتيوميات أو من التجارب القائمة على البيولوجيا الجزيئية. ورصد التفاعل المتعدد هو أحد هذه النهج المستهدف الذي يستخدم على نحو متزايد للكشف عن البروتينات المستمدة من العينات البيولوجية وتحديدها كميا. في هذه الدراسة مشينا من خلال مختلف الخطوات المشاركة في الكشف عن وقياس البروتينات من أنسجة الدماغ البشرية بهدف تعريف القراء على المتطلبات الأساسية لتجربة MRM.تزن حوالي 50 ملغ من أنسجة الدماغ، وغسل الأنسجة مع 300 ميكرولتر من المالحة 1x الفوسفات المخزنة. يتم تنفيذ هذه الخطوة لإزالة أي دم على السطح الخارجي للأنسجة ، وبالتالي فمن المستحسن إزالة أكبر قدر ممكن من الدم. بعد يغسل مع برنامج تلفزيوني، إضافة 300 ميكرولتر من العازلة تحلل إلى أنبوب يحتوي على الأنسجة.Lyse الأنسجة باستخدام سونيكاتور التحقيق مع الحفاظ على أنبوب على حمام الجليد. الاستمرار في تجانس الأنسجة باستخدام الخافض حبة لتحلل تماما الأنسجة. الطرد المركزي محتويات الأنبوب في 6000 غرام لمدة 15 دقيقة في أربع درجات مئوية.نقل supernatant في أنبوب جديد وتخلط بشكل متجانس. خذ a aliquot صغيرة من supernatant، وقياس محتوى البروتين باستخدام المقايسة البروتين القياسية. هنا نعرض مثالا على تقدير البروتين باستخدام برادفورد اساي.خذ 50 ميكروغرام من البروتين في أنبوب الطرد المركزي الدقيق وتقليل المحتويات عن طريق إضافة TCEP بحيث يكون التركيز النهائي 20 ملليمولار. احتضان المحتويات في 37 درجة لمدة ساعة واحدة. بعد الحضانة ، يقلل من البروتينات المخفضة عن طريق إضافة iodoacetamide إلى الأنبوب ، بحيث يكون التركيز النهائي 40 ملليمولار.احتضان الأنبوب في الظلام لمدة 30 دقيقة. الآن إضافة العازلة B إلى الأنبوب تحتوي على البروتينات المنخفضة و alkylated بحيث التركيز النهائي لليوريا هو أقل من واحد الأضراس. إضافة التريبسين في 1 كما إلى 30 نسبة الإنزيم إلى البروتين واحتضان الأنابيب بين عشية وضحاها في 37 درجة مع اهتزاز مستمر.بعد الهضم، ركز الببتيدات المهضومة في مركز فراغ. في هذه الخطوة، يمكن إعادة تشكيل الببتيدات وإزالة تحلها أو تخزينها عند ناقص 80 للاستخدام في المستقبل. يعد تحلية المياه، أو تنظيف الببتيد، أمرا ضروريا قبل تحميل العينات على أي مرض التصلب المتعدد LC-MS. يمكن أن تسد الأملاح والملوثات الأخرى في العينة العمود وتؤثر على حساسية الجهاز على المدى الطويل.يمكن تنفيذ هذه العملية باستخدام تلميحات أو أعمدة C18 STAGE المتاحة تجاريا. هنا قمنا بتصوير سير العمل لتحلية الببتيد باستخدام تلميح C18 STAGE. بعد تحلية، وتجفيف الببتيدات في تركيز فراغ.إعادة تشكيل هذه الببتيدات النظيفة والمضي قدما في القياس الكمي باستخدام طريقة النطاقات. لهذا، قم بتحميل اثنين ميكرولتر من العينة في لوحة ميكرودرروب وحساب التركيز كما هو مبين في الشريحة. إعداد قائمة الانتقال خطوة حاسمة في تجربة SRM أو MRM.تحتوي قائمة الانتقال على جميع المعلومات المطلوبة من مطياف الكتلة لمراقبة الانتقال. ويشمل ذلك قيم m by z لأيونات السلائف والمنتجات، وطاقة التصادم في المرحلة الانتقالية، وقطبية الأداة، والنطاق الزمني للحصول على البيانات. قم بإعداد قائمة الانتقال باستخدام Skyline.إعداد بروتيوم الخلفية باستخدام ملف فاستا البروتيوم الإنسان من UniProt وتأكد من أنه يتم تحديده تحت علامة التبويب الخلفية من إعدادات الببتيد. في علامة التبويب تصفية، حدد الحد الأدنى للطول 8 والحد الأقصى للطول 25. استمر في استخدام الإعدادات الافتراضية إذا لم تكن هناك تعديلات أخرى في الببتيدات.بمجرد إجراء إعدادات الببتيد ، انقر على إعدادات الانتقال. ضمن علامة التبويب تصفية تعيين رسوم السلائف كما 2 و 3. تعيين رسوم الأيونات ك 1 وتعيين أنواع الأيونات إلى y.يمكن تحديد أيونات المنتجات حسب اختيار المستخدم. اترك كافة المعلمات كإعدادات افتراضية. الآن إدراج معرفات الانضمام من البروتينات المستهدفة المختارة.ويمكن القيام بذلك عن طريق النقر على تحرير علامة التبويب ثم اختيار إدراج ولصق أخيرا معرفات الانضمام. سيتم تعيين معرفات إلى البروتينات في البروتيوم الخلفية وقائمة الانتقال التي تم إنشاؤها استنادا إلى إعدادات الببتيد والانتقال التي تم تعيينها في وقت سابق. تصدير قائمة الانتقال هذه.تأكد من اختيار الأداة المناسبة بالنقر فوق الخيار المنسدل لنوع الأداة. في هذه الحالة، فإن الأداة هي ثيرمو ألتيس. نظرا لأن قائمة الانتقالات غير المعرفة تحتوي على عدد كبير جدا من الانتقالات، احتفظ بحد أقصى قدره 350 انتقالا فقط لكل قائمة وتصدير كطرق متعددة.يتم استخدام نظام المذيبات الثنائية. المذيبات A هي 1٪ FA والمذيب B هو 80٪ ACN. حافظ على معدل التدفق عند 450 ميكرولتر في الدقيقة والتدرج كما هو موضح.تعيين درجة حرارة حجرة العمود في 45 درجة مئوية. لمزيد من التفاصيل حول العمود ونظام LC، راجع النص. تأكد من أن إعدادات التصلب المتعدد في TSQ Altis كما هو موضح هنا.استيراد قائمة انتقال واحدة لإنشاء أسلوب جديد. نقترح أن تبقي القرار لquadrupole 1 وquadrupole 3 في 7. ويمكن تحسين هذه الخطوات إذا لزم الأمر.لضمان التناسق في التشغيل وبالتالي جودة البيانات، قم بإعداد تسلسل التشغيل كما هو موضح. تبدأ مع اثنين من الفراغات، راجع النص لتكوين خليط فارغ، تليها ضوء معيار مراقبة الجودة BSA من التركيز المعروف لرصد أي اختلاف في استجابة اليوم الحكيم للصك. يجب أن يكون مراقبة الجودة القيام به قبل العينات.السطر التالي حتى جميع العينات مع الفراغات في ما بين. حقن كميات متساوية من كل عينة، وهو ما يمثل 25 إلى 1 نانوغرام من الببتيدات لكل حقنة. لجعل أسلوب المكرر تشغيل أولا أساليب غير معرفة مقابل عينات كاملة.استيراد النتائج إلى Skyline والتحقق يدويا من كل الببتيد. لكل الببتيد، حدد واحد السلائف تظهر قمم جيدة باستمرار في جميع العينات. حذف السلائف والببتيدات التي لا تظهر قمم جيدة.تأكد من أن جميع القمم مشروحة بشكل صحيح. لتحديد الذروة الصحيحة وزيادة صقل التحولات تحت كل مقدمة ، يمكن استخدام مكتبة. المكتبة هي مجموعة من البيانات الطيفية MS-MS المتطابقة مع الببتيدات والتحولات للبيانات التجريبية الحالية.اختر القمم التي تحتوي على قيم DART P أقرب إلى 1 وقم بإزالة الانتقالات التي لا تتطابق مع المكتبة. تشير قيمة DART P إلى مدى أهمية المباراة بين الذروة التجريبية وذروة المكتبة. بعد جولة أو جولتين من التحسين، ستكون القائمة المكررة جاهزة.يمكن تشغيل هذه القائمة المكررة لعينات فردية. استيراد أشواط المكرر في الأفق وقمم التعليقات التوضيحية بشكل صحيح. استخدم علامة التبويب التعليق التوضيحي ضمن إعدادات المستند لإضافة تعليق توضيحي على كل عينة في شبكة المستند بعناية.استخدم ميزة مقارنة المجموعة لإنشاء مقارنات بين الشرط 1 والشرط 2 من تجربتك. وهذا سيعطي الجدول مع قيم P المعدلة وقيم التغيير أضعاف بين المجموعتين. على حد علمنا، هذه هي الدراسة الأولى التي تستخدم استخدام MRM للكشف عن الببتيدات للبروتينات Apolipoprotein A-1، فيمنتين، ونيكوتيناميد فوسفوريبوسيل ترانسفيراز في عينات أنسجة الدماغ البشرية.يمكن أن يؤثر تحسين المعلمات المختلفة مثل تدرج LC ووقت الإسهاب ووقت الدورة وطاقة الاصطدام بشكل كبير على نجاح تجربة MRM. ونحن نعتقد أن هذه التقنية يمكن استخدامها لتطوير أنماط من المؤشرات الحيوية مع القدرة على التمييز بين الظروف السريرية المختلفة والأمراض.

Research

JoVE Journal

Biology

A Chromatin Assay for Human Brain Tissue

والفحص الكروماتين لأنسجة المخ الإنسان

Chronic neuropsychiatric illnesses such as schizophrenia, bipolar disease and autism are thought to result from a combination of genetic and environmental ...

Neuronal Nuclei Isolation from Human Postmortem Brain Tissue

عزل النواة من الخلايا العصبية البشرية تشريح أنسجة المخ

Neurons in the human brain become postmitotic largely during prenatal development, and thus maintain their nuclei throughout the full lifespan. However, ...

Monitoring Acupuncture Effects on Human Brain by fMRI

رصد تأثيرات الوخز بالإبر في الدماغ بواسطة الرنين المغناطيسي الوظيفي الإنسان

Functional MRI is used to study the effects of acupuncture on the BOLD response and the functional connectivity of the human brain.  Results demonstrate ...

Identification of protein complexes with quantitative proteomics in S. cerevisiae

تحديد بروتين المجمعات مع كمية البروتينات في البيرة س.

Lipids are the building blocks of cellular membranes that function as barriers and in compartmentalization of cellular processes, and recently, as ...

Obtaining High Quality RNA from Single Cell Populations in Human Postmortem Brain Tissue

الحصول على جودة عالية من الحمض النووي الريبي بالسكان خلية واحدة في الإنسان تشريح أنسجة المخ

We proposed to investigate the gray matter reduction in the superior temporal gyrus seen in schizophrenia patients, by interrogating gene expression ...

High-throughput Crystallization of Membrane Proteins Using the Lipidic Bicelle Method

الإنتاجية العالية للبروتينات غشاء البلورة باستخدام أسلوب Bicelle Lipidic

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane ...

A Quantitative Fitness Analysis Workflow

تحليل كمي لياقة سير العمل

Quantitative Fitness Analysis (QFA) is an experimental and computational workflow for comparing fitnesses of microbial cultures grown in parallel1,2,3,4. ...

Proteomic Sample Preparation from Formalin Fixed and Paraffin Embedded Tissue

إعداد نموذج البروتين من الفورمالين الثابتة والبارافين جزءا لا يتجزأ من نسيج

Preserved clinical material is a unique source for proteomic investigation of human disorders. Here we describe an optimized protocol allowing large scale ...

Identification of Protein Interaction Partners in Mammalian Cells Using SILAC-immunoprecipitation Quantitative Proteomics

تحديد الشركاء التفاعل البروتين في خلايا الثدييات عن طريق SILAC مناعي الكمي البروتيوميات

Quantitative proteomics combined with immuno-affinity purification, SILAC immunoprecipitation, represent a powerful means for the discovery of novel ...

Selected Reaction Monitoring Mass Spectrometry for Absolute Protein Quantification

رد الفعل المحدد رصد الطيف الكتلي لالمطلق البروتين الكمي

Absolute quantification of target proteins within complex biological samples is critical to a wide range of research and clinical applications. This ...