Name: quantitative proteomics workflow using multiple reaction monitoring based detection of proteins from human brain tissue
Uploaded: 2021-08-28T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Proteomics Workflow using Multiple Reaction Monitoring Based Detection of Proteins from Human Brain Tissue at JoVE.com

Vi anerkender MHRD-UAY Project (UCHHATAR AVISHKAR YOJANA), projekt #34_IITB til SS og MASSFIITB Facility hos IIT Bombay støttet af Institut for Bioteknologi (BT/PR13114/INF/22/206/2015) til at udføre alle MS-relaterede eksperimenter.
Vi vil gerne rette en særlig tak til Mr. Rishabh Yadav for at lave og redigere hele videoen og Mr. Nishant Nerurkar for hans arbejde med at redigere lyden.

Denne undersøgelse omfatter hjernevævsprøver fra menneskelige deltagere, gennemgået og godkendt af TMH og IITB IEC - (IITB-IEC/2018/019). Deltagerne gav deres informerede og skriftlige samtykke til at deltage i denne undersøgelse.
1 Proteinudvinding fra hjernevæv
<ol><li>Der vejes ca. 50 mg hjernevæv, og vævet vaskes med 300 μL 1x fosfatbuffer saltvand (PBS) ved hjælp af en mikropipette. BEMÆRK: Dette trin udføres for at fjerne blod på vævets ydre overflade og skal om nødve...

<ol>
	<li>Picotti, P., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selected+reaction+monitoring-based+proteomics:+Workflows,+potential,+pitfalls+and+future+directions.">Selected reaction monitoring-based proteomics: Workflows, potential, pitfalls and future directions.</a> Nature Methods. , (2012).</li><li>Carr, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+peptide+measurements+in+biology+and+medicine:+Best+practices+for+mass+spectrometry-based+assay+development+using+a+fit-for-purpose+approach.">Targeted peptide measurements in biology and medicine: Best practices for mass spectrometry-based assay development using a fit-for-purpose approach.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 13 (3), 907-917 (2014).</li><li>Pitt, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+and+applications+of+liquid+chromatography-mass+spectrometry+in+clinical+biochemistry.">Principles and applications of liquid chromatography-mass spectrometry in clinical biochemistry.</a> The Clinical biochemist Reviews. 30 (1), 19-34 (2009).</li><li>Hosp, F., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Primer+on+Concepts+and+Applications+of+Proteomics+in+Neuroscience.">A Primer on Concepts and Applications of Proteomics in Neuroscience.</a> Neuron. 96 (3), 558-571 (2017).</li><li>Scopes, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+protein+by+spectrophotometry+at+205+nm.">Measurement of protein by spectrophotometry at 205 nm.</a> Analytical Biochemistry. , (1974).</li><li>Kusebauch, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+SRMAtlas:+A+Resource+of+Targeted+Assays+to+Quantify+the+Complete+Human+Proteome.">Human SRMAtlas: A Resource of Targeted Assays to Quantify the Complete Human Proteome.</a> Cell. , (2016).</li><li>MacLean, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skyline:+an+open+source+document+editor+for+creating+and+analyzing+targeted+proteomics+experiments.">Skyline: an open source document editor for creating and analyzing targeted proteomics experiments.</a> Bioinformatics. 26 (7), 966-968 (2010).</li><li>Gerber, S. A., Rush, J., Stemman, O., Kirschner, M. W., Gygi, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absolute+quantification+of+proteins+and+phosphoproteins+from+cell+lysates+by+tandem+MS.">Absolute quantification of proteins and phosphoproteins from cell lysates by tandem MS.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2003).</li><li>Escher, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+iRT,+a+normalized+retention+time+for+more+targeted+measurement+of+peptides.">Using iRT, a normalized retention time for more targeted measurement of peptides.</a> Proteomics. , (2012).</li><li>Gillette, M. A., Carr, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+peptides+and+proteins+in+biomedicine+by+targeted+mass+spectrometry.">Quantitative analysis of peptides and proteins in biomedicine by targeted mass spectrometry.</a> Nature Methods. 10 (1), 28-34 (2013).</li><li>Whiteaker, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+targeted+proteomics-based+pipeline+for+verification+of+biomarkers+in+plasma.">A targeted proteomics-based pipeline for verification of biomarkers in plasma.</a> Nature Biotechnology. , (2011).</li><li>H&#252;ttenhain, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproducible+quantification+of+cancer-associated+proteins+in+body+fluids+using+targeted+proteomics.">Reproducible quantification of cancer-associated proteins in body fluids using targeted proteomics.</a> Science Translational Medicine. 4 (142), 94 (2012).</li><li>Mermelekas, G., Vlahou, A., Zoidakis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SRM/MRM+targeted+proteomics+as+a+tool+for+biomarker+validation+and+absolute+quantification+in+human+urine.">SRM/MRM targeted proteomics as a tool for biomarker validation and absolute quantification in human urine.</a> Expert Review of Molecular Diagnostics. 15 (11), 1441-1454 (2015).</li><li>Koldamova, R. P., Lefterov, I. M., Lefterova, M. I., Lazo, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apolipoprotein+A-I+directly+interacts+with+amyloid+precursor+protein+and+inhibits+A&#946;+aggregation+and+toxicity.">Apolipoprotein A-I directly interacts with amyloid precursor protein and inhibits A&#946; aggregation and toxicity.</a> Biochemistry. , (2001).</li><li>Jiang, S. X., Slinn, J., Aylsworth, A., Hou, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vimentin+participates+in+microglia+activation+and+neurotoxicity+in+cerebral+ischemia.">Vimentin participates in microglia activation and neurotoxicity in cerebral ischemia.</a> Journal of Neurochemistry. , (2012).</li><li>Liu, L. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nicotinamide+Phosphoribosyltransferase+May+Be+Involved+in+Age-Related+Brain+Diseases.">Nicotinamide Phosphoribosyltransferase May Be Involved in Age-Related Brain Diseases.</a> PLoS ONE. , (2012).</li><li>Abbatiello, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+guidelines+for+publication+of+manuscripts+describing+development+and+application+of+targeted+mass+spectrometry+measurements+of+peptides+and+proteins.">New guidelines for publication of manuscripts describing development and application of targeted mass spectrometry measurements of peptides and proteins.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 16 (3), 327-328 (2017).</li></ol>

Teknikker som Immunohistochemistry og vestlig blotting blev betragtet som guldstandarder for validering af proteinmål i mange år. Disse metoder finder anvendelse selv i dag med mindre ændringer i protokollen og ringe afhængighed af teknologi, hvilket gør dem meget besværlige og kedelige. Derudover involverer de også brug af dyre antistoffer, som ikke altid viser den samme specificitet på tværs af partier og kræver stor ekspertise. Derudover har kun en lille brøkdel af proteiner, der er identificeret ved hjæl...

I løbet af det sidste årti har den hurtige udvikling inden for massespektrometri (MS) kombineret med øget forståelse af kromatografiteknikker i høj grad bidraget til at fremme MS-baserede proteomik. Molekylærbiologi-baserede teknikker såsom vestlige blotting og immunohistochemistry har længe lidt af reproducerbarhed spørgsmål, langsom ekspeditionstid, inter-observatør variation og deres manglende evne til præcist at kvantificere proteiner, for at nævne nogle få. Til dette formål fortsætter den overlegne følsomhed af højoverførselsproteomics tilgange med at tilbyde molekylærbiologer et alternativt og mere pålideligt værktøj i deres søgen efter bedre at forstå proteinernes roller i celler. Men shotgun proteomics tilgange (Data afhængige Acquisition eller DDA) ofte undlader at opdage lav rigelige proteiner i komplekse væv ud over at være stærkt afhængige af følsomhed og opløsning af instrumentet. I løbet af de sidste par år har laboratorier rundt om i verden udviklet teknikker som Data Independent Acquisition (DIA), der kræver øget computerkraft og pålidelig software, der kan håndtere disse meget komplekse datasæt. Disse teknikker er dog stadig et igangværende arbejde og ikke særlig brugervenlige. Målrettede MS-baserede proteomics tilgange giver en perfekt balance mellem den høje gennemstrømning karakter af MS tilgange og følsomheden af molekylærbiologi tilgange som ELISA. Et målrettet massespektrometribaseret proteomics-eksperiment fokuserer på at detektere hypotesedrevne proteiner eller peptider fra opdagelsesbaserede shotgun proteomics-eksperimenter eller gennem tilgængelig litteratur1,2. Multiple Reaction Monitoring (MRM) er en sådan målrettet MS-tilgang, der bruger et tandem firedobbelt massespektrometer til nøjagtig detektion og kvantificering af proteiner / peptider fra komplekse prøver. Teknikken giver højere følsomhed og specificitet på trods af, at det kræver brug af et instrument med lav opløsning.
En quadrupole er lavet af 4 parallelle stænger, med hver stang forbundet til diagonalt modsatte stang. Et svingende felt skabes mellem de firedobbelte stænger ved at anvende vekslende RF- og DC-spændinger. Ionernes bane inde i quadrupole påvirkes af tilstedeværelsen af de samme spændinger på tværs af modsatte stænger. Ved at anvende RF til DC spænding, kan bane af ioner stabiliseres. Det er denne egenskab af quadrupole, der gør det muligt at bruge det som en masse filter, som selektivt kan lade specifikke ioner til at passere igennem. Afhængigt af behovet kan en firdoblet betjenes i enten statisk tilstand eller scanningstilstand. Den statiske tilstand tillader kun ioner med en bestemt m/ z at passere igennem, hvilket gør tilstanden meget selektiv og specifik for interessen. Scanningstilstanden på den anden side gør det muligt for ioner på tværs af hele m/ z-området at passere igennem. Således kan tandem firdobbelen massespektrometre fungere på 4 mulige måder: i) den første firdobbelige drift i statisk tilstand, mens den anden opererer i scanningstilstand; ii) den første firdobbeler, der kører i scanningstilstand, mens den anden arbejder i statisk tilstand iii) begge quadrupoles, der opererer i scanningstilstand; og iv) begge quadrupoles, der opererer i statisk tilstand3. I et typisk MRM-eksperiment opererer begge quadrupoler i statisk tilstand, så specifikke prækursorer og deres resulterende produkter efter fragmentering kan overvåges. Dette gør teknikken meget følsom og selektiv, hvilket giver mulighed for nøjagtig kvantificering.
For molekylærbiologer er det menneskelige hjernevæv og dets celler en guldgrube. Disse bemærkelsesværdige enheder af et stadigt interessant organ i den menneskelige krop kan give molekylær og cellulær indsigt i dens funktion. Proteomic undersøgelser af hjernevævet kan ikke kun hjælpe os med at forstå den systemiske funktion af en sund hjerne, men også de cellulære veje, der bliver dysreguleret, når de påføres af en vis sygdom4. Hjernevævet med al dets heterogenitet er imidlertid et meget komplekst organ at analysere og kræver en samordnet tilgang til en bedre forståelse af ændringerne på molekylært niveau. Følgende arbejde beskriver hele arbejdsgangen, der starter lige fra udvinding af proteiner fra hjernevæv, oprettelse og optimering af metoderne til MRM-analyse til validering af målene (Figur 1). Her har vi systematisk fremhævet de store skridt, der er involveret i et vellykket MRM-baseret eksperiment ved hjælp af menneskeligt hjernevæv med det formål at introducere teknikken og dens udfordringer til et bredere forskningsmiljø.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile (MS grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A/0620/21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>TC194-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Fischer Scienific</td>
			<td>BP510-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid (MS grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>147930250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1149-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol (MS grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Q13827</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Fischer Scienific</td>
			<td>BP214-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol (MS grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A456-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS grade water</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>51140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>TL1006-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Roche Diagnostics</td>
			<td>11873580001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>DF6D661300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCEP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>646547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Merck</td>
			<td>648310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin (MS grade)</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>90058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Merck</td>
			<td>MB1D691237</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Supplies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypersil Gold C18 column</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>25002-102130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipettes</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F167380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stage tips</td>
			<td>MilliPore</td>
			<td>ZTC18M008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zirconia/Silica beads</td>
			<td>BioSpec products</td>
			<td>11079110z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bead beater (Homogeniser)</td>
			<td>Bertin Minilys</td>
			<td>P000673-MLYS0-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader (spectrophotometer)</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>MultiSkan Go</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td>Eutech</td>
			<td>CyberScan pH 510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Probe Sonicator</td>
			<td>Sonics Materials, Inc</td>
			<td>VCX 130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking Drybath</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>88880028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TSQ Altis mass spectrometer</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>TSQ02-10002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>uHPLC - Vanquish</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>VQF01-20001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum concentrator</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>Savant ISS 110</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative proteomics workflow using multiple reaction monitoring based detection of proteins from human brain tissue

Den proteomic analyse af det menneskelige hjernevæv i løbet af det sidste årti har i høj grad forbedret vores forståelse af hjernen. Men hjernerelaterede lidelser fortsætter med at være en stor bidragyder af dødsfald rundt om i verden, hvilket kræver behovet for endnu større forståelse af deres patobiologi. Traditionelle antistofbaserede teknikker som vestlig blotting eller immunohistochemistry lider af at være lav gennemstrømning ud over at være arbejdskrævende og kvalitativ eller semi-kvantitativ. Selv konventionelle massespektrometri-baserede shotgun tilgange undlader at give afgørende beviser til støtte for en vis hypotese. Målrettede proteomics tilgange er stort set hypotese drevet og adskiller sig fra de konventionelle shotgun proteomics tilgange, der har været længe i brug. Flere reaktionsovervågning er en sådan målrettet tilgang, der kræver brug af et specielt massespektrometer kaldet tandem firedobbelt massespektrometer eller tredobbelt firdobbelt massespektrometer. I den aktuelle undersøgelse har vi systematisk fremhævet de vigtigste skridt, der er involveret i at udføre en vellykket tandem firedobbelt massespektrometri-baseret proteomics workflow ved hjælp af humant hjernevæv med det formål at introducere denne arbejdsgang til et bredere forskningsmiljø.

Vi udførte relativ kvantificering af 3 proteiner fra 10 prøver, 5 prøver fra hver gruppe af patienter med abnormiteter i hjernen. Disse proteiner omfattede Apolipoprotein A-I (APOA-I), Vimentin (VIM) og Nicotinamide phosphoribosyltransferase (NAMPT), som er kendt for at udføre forskellige roller i hjernecellerne. Post-run analyse af data blev udført ved hjælp af Skyline-daglige (Ver 20.2.1.286). I alt 10 peptider svarende til 3 proteiner blev overvåget. Disse omfattede 3 peptider for APOA-I, 4 peptider for VIM og ...

Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Proteomics Workflow using Multiple Reaction Monitoring Based Detection of Proteins from Human Brain Tissue at JoVE.com

Quantitative Proteomics Workflow using Multiple Reaction Monitoring Based Detection of Proteins from Human Brain Tissue

Protokollen har til formål at indføre brugen af et tredobbelt firdobbelt massespektrometer til multireaktionsovervågning (MRM) af proteiner fra kliniske prøver. Vi har leveret en systematisk arbejdsgang fra prøveforberedelse til dataanalyse for kliniske prøver med alle de nødvendige forholdsregler, der skal træffes.

Kvantitativ Proteomics Workflow ved hjælp af flere reaktionsovervågningsbaserede detektioner af proteiner fra humant hjernevæv

The proteomic analysis of the human brain tissue over the last decade has greatly enhanced our understanding of the brain. However, brain related ...

Målrettede proteomic tilgange er hurtigt ved at blive den foretrukne metode til validering af proteiner fra kortsigtede proteomics-baserede eksperimenter eller fra molekylærbiologi-baserede eksperimenter. Overvågning af flere reaktioner er en sådan målrettet tilgang, som i stigende grad anvendes til at påvise og kvantificere proteiner fra biologiske prøver. I denne undersøgelse har vi gennemgået de forskellige trin, der er involveret i påvisning og kvantificering af proteiner fra humant hjernevæv med det formål at introducere læserne til de grundlæggende krav i et MRM-eksperiment.Vejer omkring 50 mg hjernevæv, og vask vævet med 300 mikroliter af 1x fosfat-buffered saltvand. Dette trin udføres for at fjerne blod på vævets ydre overflade, og derfor er det tilrådeligt at fjerne så meget blod som muligt. Efter vask med PBS tilsættes 300 mikroliter lysis buffer til røret, der indeholder vævet.Lys vævet ved hjælp af en sonde sonicator og samtidig holde røret på et isbad. Fortsæt med væv homogenisering ved hjælp af en perle tæppebanker til helt lyse vævet. Centrifuge indholdet af røret ved 6000 g i 15 minutter ved fire grader celsius.Supernatanten overføres til et friskrør og blandes homogent. Tag en lille aliquot af supernatanten, og kvantificere proteinindholdet ved hjælp af en standard proteinanalyse. Her viser vi et eksempel på protein skøn ved hjælp af Bradford Assay.Tag 50 mikrogram protein i et mikrocentrifugerør, og reducer indholdet ved at tilsætte TCEP, således at den endelige koncentration er 20 millimolar. Inkuber indholdet ved 37 grader i en time. Efter inkubationen alkylerer de reducerede proteiner ved at tilsætte iodoacetamid til røret, således at den endelige koncentration er 40 millimolar.Inkubat røret i mørke i 30 minutter. Nu tilsættes Buffer B til røret indeholdt reducerede og alkyleret proteiner således, at den endelige koncentration af urinstof er mindre end én kindtand. Tilsæt trypsin i 1 med hensyn til 30 enzym-til-protein-forhold og inkuber rørene natten over ved 37 grader med konstant rysten.Efter fordøjelsen skal du koncentrere de fordøjede peptider i en vakuumkoncentrator. På dette trin kan peptider enten rekonstitueres og afsalteres eller opbevares ved minus 80 til fremtidig brug. Afsaltning eller oprensning af peptid er afgørende, før prøverne indlæses på en LC-MS. Salte og andre forurenende stoffer i prøven kan tilstoppe kolonnen og påvirke instrumentets følsomhed i det lange løb.Denne proces kan udføres ved hjælp af kommercielt tilgængelige C18 STAGE tips eller kolonner. Her har vi afbildet arbejdsgangen for peptidafsaltning ved hjælp af et C18 STAGE tip. Efter afsaltning tørres peptider i en vakuumkoncentrator.Rekonstruere disse rene peptider og gå videre til kvantificering ved hjælp af Scopes metode. Til dette skal prøvens mikroliter indlæses i en mikrodråbeplade, og koncentrationen beregnes som vist på diaset. Forberedelse af overgangslister er et afgørende skridt i et SRM- eller MRM-eksperiment.En overgangsliste indeholder alle de oplysninger, der kræves af massespektrometeret for at overvåge overgangen. Dette omfatter m by z-værdierne for prækursoren og produktionerne, kollisionsenergien i overgangen, instrumentets polaritet og tidsintervallet for dataindsamling. Forbered overgangslisten ved hjælp af Skyline.Forbered en baggrundsproteom ved hjælp af Human Proteome Fasta-filen fra UniProt, og sørg for, at den er valgt under fanen Baggrund under Peptide-indstillinger. Angiv en minimumlængde på 8 og en maksimal længde på 25 under fanen Filter. Fortsæt med at bruge standardindstillingerne, hvis der ikke er andre ændringer i peptider.Når peptidindstillingerne er foretaget, skal du klikke på Overgangsindstillinger. Angiv prækursorgebyrer som 2 og 3 under fanen Filter. Angiv Ion-gebyrer som 1, og angiv Ion-typer til y.Produktioner kan vælges afhængigt af brugerens valg. Lad alle parametrene være som standard. Indsæt nu tiltrædelses-id'erne for de valgte målproteiner.Dette kan gøres ved at klikke på fanen Rediger og derefter vælge Indsæt og til sidst indsætte tiltrædelses-id'erne. Id'erne vil blive knyttet til proteinerne i baggrunden proteome og en overgang liste oprettet baseret på peptid og overgang indstillinger, der tidligere. Eksporter denne overgangsliste.Sørg for, at det rigtige instrument er valgt ved at klikke på rullemenuen Instrumenttype. I dette tilfælde er instrumentet Thermo Altis. Da den udefinerede overgangsliste har for mange overgange, skal du holde en grænse på kun 350 overgange pr. liste og eksportere som flere metoder.Der anvendes et binært opløsningsmiddelsystem. Opløsningsmiddel A er 1%FA og Solvent B er 80%ACN. Hold strømningshastigheden på 450 mikroliter pr. minut og gradienten som vist.Indstil kolonnerummets temperatur ved 45 grader Celsius. Yderligere oplysninger om kolonne- og remburssystem finder du i teksten. Sørg for, at MS-indstillingerne i TSQ Altis er som vist her.Importer en enkelt overgangsliste for at oprette en ny metode. Vi foreslår at holde opløsningen for quadrupole 1 og quadrupole 3 ved 7. Disse kan optimeres yderligere, hvis det er nødvendigt.For at sikre ensartethed i løbetøjper og dermed datakvaliteten skal du forberede din løbesekvens som vist. Start med et par emner, henvises til teksten til sammensætning af blank blanding, efterfulgt af en QC standard lys BSA af kendt koncentration til at overvåge enhver variation i den dag-kloge reaktion af instrumentet. QC gjort bør være lige før prøverne.Næste linje op alle prøverne med blanke i mellem. Der injiceres lige store mængder af hver prøve, som tegner sig for 25-1 nanogram peptider pr. injektion. For at lave en raffineret metode skal du først køre de udefinerede metoder mod hele prøver.Importér resultater til Skyline, og kontroller hver peptid manuelt. For hver peptid skal du vælge en forløber, der viser konsekvent gode toppe i alle prøverne. Slet prækursorer og peptider, der ikke viser gode toppe.Sørg for, at alle toppe er kommenteret korrekt. For at vælge den rigtige top og yderligere forfine overgangene under hver forløber, kan et bibliotek bruges. Et bibliotek er et sæt MS-MS spektrale data, der matches med peptider og overgange af de aktuelle eksperimentelle data.Vælg toppe, der har DART P-værdier tættere på 1, og fjern overgange, der ikke svarer til biblioteket. En DART P-værdi angiver, hvor god kampen er mellem den eksperimentelle top og bibliotekets top. Efter en eller to runder af optimering, vil en raffineret liste være klar.Denne raffinerede liste kan køres for individuelle prøver. Importér de raffinerede løber ind Skyline og kommentere toppe ordentligt. Brug fanen Anmærkning under Dokumentindstillinger til at anmærke hvert eksempel i dokumentgitteret omhyggeligt.Brug funktionen Gruppesammenligning til at oprette sammenligninger mellem betingelse 1 og betingelse 2 i eksperimentet. Dette giver tabel med justerede P-værdier og fold ændringsværdier mellem de to grupper. Så vidt vi ved, er dette den første undersøgelse, der anvender brugen af MRM til at detektere peptider for proteinerne Apolipoprotein A-1, Vimentin og Nicotinamide phosphoribosyltransferase i humane hjernevævsprøver.Optimering af forskellige parametre såsom LC-gradient, opholdstid, cyklustid og kollisionsenergi kan i høj grad påvirke succesen af et MRM-eksperiment. Vi mener, at denne teknik kan bruges til at udvikle mønstre af biomarkører med evne til at skelne mellem forskellige kliniske tilstande og sygdomme.

Research

JoVE Journal

Biology

A Chromatin Assay for Human Brain Tissue

Chronic neuropsychiatric illnesses such as schizophrenia, bipolar disease and autism are thought to result from a combination of genetic and environmental ...

Neuronal Nuclei Isolation from Human Postmortem Brain Tissue

Neurons in the human brain become postmitotic largely during prenatal development, and thus maintain their nuclei throughout the full lifespan. However, ...

Monitoring Acupuncture Effects on Human Brain by fMRI

Functional MRI is used to study the effects of acupuncture on the BOLD response and the functional connectivity of the human brain.  Results demonstrate ...

Identification of protein complexes with quantitative proteomics in S. cerevisiae

Lipids are the building blocks of cellular membranes that function as barriers and in compartmentalization of cellular processes, and recently, as ...

Obtaining High Quality RNA from Single Cell Populations in Human Postmortem Brain Tissue

We proposed to investigate the gray matter reduction in the superior temporal gyrus seen in schizophrenia patients, by interrogating gene expression ...

High-throughput Crystallization of Membrane Proteins Using the Lipidic Bicelle Method

High-throughput krystallisering af membranproteiner Brug af Lipidic Bicelle Metode

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane ...

A Quantitative Fitness Analysis Workflow

En kvantitativ Fitness Analyse Workflow

Quantitative Fitness Analysis (QFA) is an experimental and computational workflow for comparing fitnesses of microbial cultures grown in parallel1,2,3,4. ...

Proteomic Sample Preparation from Formalin Fixed and Paraffin Embedded Tissue

Proteomiske Prøveforberedelse fra formalin Faste og Paraffin Embedded Tissue

Preserved clinical material is a unique source for proteomic investigation of human disorders. Here we describe an optimized protocol allowing large scale ...

Identification of Protein Interaction Partners in Mammalian Cells Using SILAC-immunoprecipitation Quantitative Proteomics

Identifikation af Protein Interaction Partnere i pattedvrceller Brug SILAC-immunpræcipitations Kvantitative Proteomics

Quantitative proteomics combined with immuno-affinity purification, SILAC immunoprecipitation, represent a powerful means for the discovery of novel ...

Selected Reaction Monitoring Mass Spectrometry for Absolute Protein Quantification

Valgt Reaktion Overvågning massespektrometri for Absolute Protein Kvantificering

Absolute quantification of target proteins within complex biological samples is critical to a wide range of research and clinical applications. This ...