Name: quantitative proteomics workflow using multiple reaction monitoring based detection of proteins from human brain tissue
Uploaded: 2021-08-28T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Proteomics Workflow using Multiple Reaction Monitoring Based Detection of Proteins from Human Brain Tissue at JoVE.com

We erkennen MHRD-UAY Project (UCHHATAR AVISHKAR YOJANA), project #34_IITB aan SS en MASSFIITB Facility bij IIT Bombay ondersteund door het Department of Biotechnology (BT/PR13114/INF/22/206/2015) om alle MS-gerelateerde experimenten uit te voeren.
We danken mr. Rishabh Yadav voor het maken en bewerken van de hele video en mr. Nishant Nerurkar voor zijn werk bij het bewerken van de audio.

Deze studie omvat hersenweefselmonsters van menselijke deelnemers, beoordeeld en goedgekeurd door TMH en IITB IEC - (IITB-IEC/2018/019). De deelnemers gaven hun geïnformeerde en schriftelijke toestemming om deel te nemen aan dit onderzoek.
1 Eiwitextractie uit hersenweefsel
<ol><li>Weeg ongeveer 50 mg hersenweefsel en was het weefsel met 300 μL 1x fosfaatbufferoplossing (PBS) met behulp van een micropipet. OPMERKING: Deze stap wordt uitgevoerd om bloed op het buitenoppervlak van het wee...

<ol>
	<li>Picotti, P., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selected+reaction+monitoring-based+proteomics:+Workflows,+potential,+pitfalls+and+future+directions.">Selected reaction monitoring-based proteomics: Workflows, potential, pitfalls and future directions.</a> Nature Methods. , (2012).</li><li>Carr, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+peptide+measurements+in+biology+and+medicine:+Best+practices+for+mass+spectrometry-based+assay+development+using+a+fit-for-purpose+approach.">Targeted peptide measurements in biology and medicine: Best practices for mass spectrometry-based assay development using a fit-for-purpose approach.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 13 (3), 907-917 (2014).</li><li>Pitt, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+and+applications+of+liquid+chromatography-mass+spectrometry+in+clinical+biochemistry.">Principles and applications of liquid chromatography-mass spectrometry in clinical biochemistry.</a> The Clinical biochemist Reviews. 30 (1), 19-34 (2009).</li><li>Hosp, F., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Primer+on+Concepts+and+Applications+of+Proteomics+in+Neuroscience.">A Primer on Concepts and Applications of Proteomics in Neuroscience.</a> Neuron. 96 (3), 558-571 (2017).</li><li>Scopes, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+protein+by+spectrophotometry+at+205+nm.">Measurement of protein by spectrophotometry at 205 nm.</a> Analytical Biochemistry. , (1974).</li><li>Kusebauch, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+SRMAtlas:+A+Resource+of+Targeted+Assays+to+Quantify+the+Complete+Human+Proteome.">Human SRMAtlas: A Resource of Targeted Assays to Quantify the Complete Human Proteome.</a> Cell. , (2016).</li><li>MacLean, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skyline:+an+open+source+document+editor+for+creating+and+analyzing+targeted+proteomics+experiments.">Skyline: an open source document editor for creating and analyzing targeted proteomics experiments.</a> Bioinformatics. 26 (7), 966-968 (2010).</li><li>Gerber, S. A., Rush, J., Stemman, O., Kirschner, M. W., Gygi, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absolute+quantification+of+proteins+and+phosphoproteins+from+cell+lysates+by+tandem+MS.">Absolute quantification of proteins and phosphoproteins from cell lysates by tandem MS.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2003).</li><li>Escher, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+iRT,+a+normalized+retention+time+for+more+targeted+measurement+of+peptides.">Using iRT, a normalized retention time for more targeted measurement of peptides.</a> Proteomics. , (2012).</li><li>Gillette, M. A., Carr, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+peptides+and+proteins+in+biomedicine+by+targeted+mass+spectrometry.">Quantitative analysis of peptides and proteins in biomedicine by targeted mass spectrometry.</a> Nature Methods. 10 (1), 28-34 (2013).</li><li>Whiteaker, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+targeted+proteomics-based+pipeline+for+verification+of+biomarkers+in+plasma.">A targeted proteomics-based pipeline for verification of biomarkers in plasma.</a> Nature Biotechnology. , (2011).</li><li>H&#252;ttenhain, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproducible+quantification+of+cancer-associated+proteins+in+body+fluids+using+targeted+proteomics.">Reproducible quantification of cancer-associated proteins in body fluids using targeted proteomics.</a> Science Translational Medicine. 4 (142), 94 (2012).</li><li>Mermelekas, G., Vlahou, A., Zoidakis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SRM/MRM+targeted+proteomics+as+a+tool+for+biomarker+validation+and+absolute+quantification+in+human+urine.">SRM/MRM targeted proteomics as a tool for biomarker validation and absolute quantification in human urine.</a> Expert Review of Molecular Diagnostics. 15 (11), 1441-1454 (2015).</li><li>Koldamova, R. P., Lefterov, I. M., Lefterova, M. I., Lazo, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apolipoprotein+A-I+directly+interacts+with+amyloid+precursor+protein+and+inhibits+A&#946;+aggregation+and+toxicity.">Apolipoprotein A-I directly interacts with amyloid precursor protein and inhibits A&#946; aggregation and toxicity.</a> Biochemistry. , (2001).</li><li>Jiang, S. X., Slinn, J., Aylsworth, A., Hou, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vimentin+participates+in+microglia+activation+and+neurotoxicity+in+cerebral+ischemia.">Vimentin participates in microglia activation and neurotoxicity in cerebral ischemia.</a> Journal of Neurochemistry. , (2012).</li><li>Liu, L. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nicotinamide+Phosphoribosyltransferase+May+Be+Involved+in+Age-Related+Brain+Diseases.">Nicotinamide Phosphoribosyltransferase May Be Involved in Age-Related Brain Diseases.</a> PLoS ONE. , (2012).</li><li>Abbatiello, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+guidelines+for+publication+of+manuscripts+describing+development+and+application+of+targeted+mass+spectrometry+measurements+of+peptides+and+proteins.">New guidelines for publication of manuscripts describing development and application of targeted mass spectrometry measurements of peptides and proteins.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 16 (3), 327-328 (2017).</li></ol>

Technieken zoals immunohistochistry en westerse blotting werden beschouwd als de gouden normen voor validatie van eiwitdoelen voor vele jaren. Deze methoden vinden gebruik zelfs vandaag met kleine wijzigingen in het protocol en weinig afhankelijkheid van technologie waardoor ze zeer omslachtig en vervelend. Daarnaast gaat het ook om het gebruik van dure antilichamen die niet altijd dezelfde specificiteit vertonen in batches en veel expertise vereisen. Bovendien heeft slechts een klein deel van de eiwitten die zijn geïd...

In de afgelopen tien jaar hebben snelle ontwikkelingen in massaspectrometrie (MS) in combinatie met een beter begrip van chromatografietechnieken sterk bijgedragen aan de vooruitgang van op MS gebaseerde proteomica. Moleculaire biologie-gebaseerde technieken zoals westerse blotting en immunohistochologie hebben lang geleden aan reproduceerbaarheidsproblemen, trage doorlooptijd, variabiliteit tussen waarnemers en hun onvermogen om eiwitten nauwkeurig te kwantificeren, om er maar een paar te noemen. Daartoe blijft de superieure gevoeligheid van proteomics-benaderingen met hoge doorvoer moleculair biologen een alternatief en betrouwbaarder hulpmiddel bieden in hun zoektocht naar een beter begrip van de rollen van eiwitten in cellen. Echter, shotgun proteomics benaderingen (Data dependent Acquisition of DDA) vaak niet te detecteren lage overvloedige eiwitten in complexe weefsels naast sterk afhankelijk van de gevoeligheid en resolutie van het instrument. In de afgelopen jaren hebben laboratoria over de hele wereld technieken ontwikkeld zoals Data Independent Acquisition (DIA) die meer rekenkracht en betrouwbare software vereisen die deze zeer complexe datasets aankan. Deze technieken zijn echter nog steeds een werk in uitvoering en niet erg gebruiksvriendelijk. Gerichte MS-gebaseerde proteomics-benaderingen bieden een perfecte balans tussen de hoge doorvoer van MS-benaderingen en de gevoeligheid van moleculaire biologiebenaderingen zoals ELISA. Een gericht op massaspectrometrie gebaseerd proteomics-experiment richt zich op het detecteren van hypothesegestuurde eiwitten of peptiden uit op ontdekking gebaseerde proteomics-experimenten of via beschikbare literatuur1,2. Multiple Reaction Monitoring (MRM) is zo'n gerichte MS-benadering die een tandemviervoudige massaspectrometer gebruikt voor nauwkeurige detectie en kwantificering van eiwitten /peptiden uit complexe monsters. De techniek biedt een hogere gevoeligheid en specificiteit, ondanks het gebruik van een instrument met lage resolutie.
Een viervoeter is gemaakt van 4 parallelle staven, waarbij elke staaf is verbonden met de diagonaal tegenoverliggende staaf. Tussen de viervoudige staven ontstaat een fluctuerend veld door afwisselend RF- en DC-spanningen toe te passen. De baan van de ionen in de viervoeter wordt beïnvloed door de aanwezigheid van dezelfde spanningen over tegenovergestelde staven. Door de RF op gelijkspanning aan te brengen, kan het traject van de ionen worden gestabiliseerd. Het is deze eigenschap van de viervoeter die het mogelijk maakt om te worden gebruikt als een massafilter dat selectief specifieke ionen kan laten passeren. Afhankelijk van de behoefte kan een quadrupole worden bediend in de statische modus of de scanmodus. De statische modus laat alleen ionen met een gespecificeerde m/z door, waardoor de modus zeer selectief en specifiek is voor het ion van belang. De scanmodus daarentegen laat ionen over het hele m/z-bereik passeren. Tandemviervoudige massaspectrometers kunnen dus op 4 mogelijke manieren werken: i) de eerste viervoeter werkt in de statische modus terwijl de tweede in scanmodus werkt; ii) de eerste viervoeter die in de scanmodus werkt, terwijl de tweede in de statische modus werkt; iii) beide quadrupoles die in de scanmodus werken; en iv) beide viervoeters die in statische modus werken3. In een typisch MRM-experiment werken beide quadrupolen in de statische modus, waardoor specifieke precursoren en de daaruit voortvloeiende producten na fragmentatie kunnen worden gecontroleerd. Dit maakt de techniek zeer gevoelig en selectief waardoor nauwkeurige kwantificering mogelijk is.
Voor moleculair biologen zijn het menselijk hersenweefsel en zijn cellen een schatkamer. Deze opmerkelijke eenheden van een steeds interessanter orgaan van het menselijk lichaam kunnen moleculaire en cellulaire inzichten geven in de werking ervan. Proteomische onderzoeken van het hersenweefsel kunnen ons niet alleen helpen de systemische werking van een gezond brein te begrijpen, maar ook de cellulaire paden die ontregeld raken wanneer ze worden toegebracht door een ziekte4. Het hersenweefsel met al zijn heterogeniteit is echter een zeer complex orgaan om te analyseren en vereist een gecoördineerde aanpak voor een beter begrip van de veranderingen op moleculair niveau. Het volgende werk beschrijft de hele workflow, beginnend met het extraheren van eiwitten uit hersenweefsel, het creëren en optimaliseren van de methoden voor MRM-test, tot validatie van de doelen (Figuur 1). Hier hebben we systematisch de belangrijkste stappen benadrukt die betrokken zijn bij een succesvol MRM-gebaseerd experiment met menselijk hersenweefsel met als doel de techniek en de uitdagingen ervan te introduceren in een bredere onderzoeksgemeenschap.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile (MS grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A/0620/21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>TC194-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Fischer Scienific</td>
			<td>BP510-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid (MS grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>147930250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1149-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol (MS grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Q13827</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Fischer Scienific</td>
			<td>BP214-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol (MS grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A456-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS grade water</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>51140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>TL1006-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Roche Diagnostics</td>
			<td>11873580001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>DF6D661300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCEP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>646547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Merck</td>
			<td>648310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin (MS grade)</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>90058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Merck</td>
			<td>MB1D691237</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Supplies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypersil Gold C18 column</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>25002-102130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipettes</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F167380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stage tips</td>
			<td>MilliPore</td>
			<td>ZTC18M008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zirconia/Silica beads</td>
			<td>BioSpec products</td>
			<td>11079110z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bead beater (Homogeniser)</td>
			<td>Bertin Minilys</td>
			<td>P000673-MLYS0-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader (spectrophotometer)</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>MultiSkan Go</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td>Eutech</td>
			<td>CyberScan pH 510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Probe Sonicator</td>
			<td>Sonics Materials, Inc</td>
			<td>VCX 130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking Drybath</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>88880028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TSQ Altis mass spectrometer</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>TSQ02-10002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>uHPLC - Vanquish</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>VQF01-20001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum concentrator</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>Savant ISS 110</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative proteomics workflow using multiple reaction monitoring based detection of proteins from human brain tissue

De proteomische analyse van het menselijk hersenweefsel in de afgelopen tien jaar heeft ons begrip van de hersenen aanzienlijk verbeterd. Hersengerelateerde aandoeningen blijven echter een belangrijke bijdrage leveren aan sterfgevallen over de hele wereld, waardoor de behoefte aan nog meer begrip van hun pathobiologie noodzakelijk is. Traditionele op antilichamen gebaseerde technieken zoals westerse blotting of immunohistochemie lijden aan een lage doorvoer, naast arbeidsintensief en kwalitatief of semi-kwantitatief. Zelfs conventionele massaspectrometrie-gebaseerde shotgun benaderingen leveren geen sluitend bewijs om een bepaalde hypothese te ondersteunen. Gerichte proteomics benaderingen zijn grotendeels hypothese gedreven en verschillen van de conventionele shotgun proteomics benaderingen die al lang in gebruik zijn. Meervoudige reactiebewaking is zo'n gerichte aanpak die het gebruik van een speciale massaspectrometer vereist, de tandemviervoudige massaspectrometer of drievoudige viervoudige massaspectrometer. In de huidige studie hebben we systematisch de belangrijkste stappen benadrukt die gepaard gaan met het uitvoeren van een succesvolle tandemviervoudige op massaspectrometrie gebaseerde proteomics-workflow met behulp van menselijk hersenweefsel met als doel deze workflow te introduceren in een bredere onderzoeksgemeenschap.

We voerden relatieve kwantificering uit van 3 eiwitten uit 10 monsters, 5 monsters van elke groep patiënten met afwijkingen in de hersenen. Deze eiwitten omvatten Apolipoproteïne A-I (APOA-I), Vimentin (VIM) en Nicotinamide phosphoribosyltransferase (NAMPT) waarvan bekend is dat ze verschillende rollen vervullen in de hersencellen. De analyse na uitvoering van de gegevens werd uitgevoerd met behulp van Skyline-daily (Ver 20.2.1.286). In totaal werden 10 peptiden die overeenkomen met 3 eiwitten gecontroleerd. Deze omvat...

Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Proteomics Workflow using Multiple Reaction Monitoring Based Detection of Proteins from Human Brain Tissue at JoVE.com

Quantitative Proteomics Workflow using Multiple Reaction Monitoring Based Detection of Proteins from Human Brain Tissue

Het protocol is bedoeld om het gebruik van een triple quadrupole mass spectrometer voor Multiple Reaction Monitoring (MRM) van eiwitten uit klinische monsters in te voeren. We hebben een systematische workflow voorzien, van monstervoorbereiding tot gegevensanalyse voor klinische monsters met alle nodige voorzorgsmaatregelen die moeten worden genomen.

Kwantitatieve Proteomics Workflow met behulp van multiple reaction monitoring gebaseerde detectie van eiwitten uit menselijk hersenweefsel

The proteomic analysis of the human brain tissue over the last decade has greatly enhanced our understanding of the brain. However, brain related ...

Gerichte proteomische benaderingen worden snel de methode bij uitstek voor validatie van eiwitten uit op proteomics gebaseerde experimenten op korte termijn of uit op moleculaire biologie gebaseerde experimenten. Meervoudige reactiebewaking is zo'n gerichte aanpak die steeds vaker wordt gebruikt om eiwitten uit biologische monsters te detecteren en te kwantificeren. In deze studie hebben we de verschillende stappen doorlopen die betrokken zijn bij het detecteren en kwantificeren van eiwitten uit menselijk hersenweefsel met de bedoeling de lezers kennis te laten maken met de basisvereisten van een MRM-experiment.Weeg ongeveer 50 mg hersenweefsel en was het weefsel met 300 microliter 1x fosfaatgebufferde zoutoplossing. Deze stap wordt uitgevoerd om bloed op het externe oppervlak van het weefsel te verwijderen en daarom is het raadzaam om zoveel mogelijk bloed te verwijderen. Voeg na het wassen met PBS 300 microliter lysisbuffer toe aan de buis die het weefsel bevat.Lyse het weefsel met behulp van een sonde sonicator terwijl het houden van de buis op een ijsbad. Ga verder met weefselhomogenisatie met behulp van een kraalklopper om het weefsel volledig te lyseren. Centrifugeer de inhoud van de buis gedurende 15 minuten op 6000 g bij vier graden Celsius.Breng het supernatant over in een verse buis en meng homogeen. Neem een kleine aliquot van het supernatant en kwantificeer het eiwitgehalte met behulp van een standaard eiwittest. Hier laten we een voorbeeld zien van eiwitschatting met behulp van Bradford Assay.Neem 50 microgram eiwit in een microcentrifugebuisje en verminder de inhoud door TCEP toe te voegen, zodat de uiteindelijke concentratie 20 millimol is. Incubeer de inhoud een uur lang op 37 graden. Na incubatie alkyleren de verminderde eiwitten door iodoacetamide aan de buis toe te voegen, zodat de uiteindelijke concentratie 40 millimolar is.Incubeer de tube in het donker gedurende 30 minuten. Voeg nu buffer B toe aan de buis met de gereduceerde en gekalkte eiwitten, zodat de uiteindelijke concentratie ureum minder dan één kies is. Voeg trypsine toe in 1 tot 30 enzym-eiwitverhouding en incubeer de buizen 's nachts op 37 graden met constant schudden.Concentreer na de spijsvertering de verteerde peptiden in een vacuümconcentrator. Bij deze stap kunnen de peptiden worden gereconstitueerd en ontzout of opgeslagen op min 80 voor toekomstig gebruik. Ontsalting, of peptide clean-up, is essentieel voordat de monsters op een LC-MS MS worden geladen. Zouten en andere verontreinigingen in het monster kunnen de kolom verstoppen en de gevoeligheid van het instrument op de lange termijn beïnvloeden.Dit proces kan worden uitgevoerd met behulp van in de handel verkrijgde C18 STAGE-tips of -kolommen. Hier hebben we de workflow voor peptide desalting weergegeven met behulp van een C18 STAGE-tip. Droog na het ontsalten de peptiden in een vacuümconcentrator.Reconstituteer deze schone peptiden en ga verder met kwantificering met behulp van de Scopes-methode. Laad hiervoor twee microliters van het monster in een microdruppelplaat en bereken de concentratie zoals weergegeven in de dia. Het opstellen van een transitielijst is een cruciale stap in een SRM- of MRM-experiment.Een overgangslijst bevat alle informatie die de massaspectrometer nodig heeft om de overgang te bewaken. Dit omvat de m-bij-z-waarden van de precursor- en productionen, botsingsenergie van de overgang, polariteit van het instrument en het tijdsbereik voor gegevensverzameling. Bereid de overgangslijst voor met Skyline.Bereid een achtergrond proteome met behulp van Human Proteome Fasta bestand van UniProt en zorg ervoor dat het is geselecteerd onder het tabblad Achtergrond van Peptide-instellingen. Stel op het tabblad Filter een minimumlengte van 8 en een maximale lengte van 25 in. Blijf de standaardinstellingen gebruiken als er geen andere wijzigingen in de peptiden zijn.Zodra de peptide-instellingen zijn gemaakt, klikt u op Overgangsinstellingen. Stel onder het tabblad Filter precursorladingen in als 2 en 3. Stel Ionenladingen in op 1 en stel Ion types in op y.Productionen kunnen worden geselecteerd afhankelijk van de keuze van de gebruiker. Laat alle parameters als standaard. Voeg nu de toetredings-ID's van de geselecteerde doeleiwitten in.Dit kan door op het tabblad Bewerken te klikken en vervolgens Invoegen te selecteren en ten slotte de toetredings-ID's te plakken. De ID's worden toegewezen aan de eiwitten in het achtergrond proteoom en een overgangslijst gemaakt op basis van de eerder ingestelde peptide- en overgangsinstellingen. Exporteer deze overgangslijst.Zorg ervoor dat het juiste instrument is geselecteerd door op de vervolgkeuzelijst Van instrumenttype te klikken. In dit geval is het instrument Thermo Altis. Aangezien de ongedefinieerde overgangs lijst te veel overgangen heeft, moet u een limiet van slechts 350 overgangen per lijst behouden en exporteren als meerdere methoden.Er wordt gebruik gemaakt van een binair oplosmiddelsysteem. Oplosmiddel A is 1%FA en Oplosmiddel B is 80%ACN. Houd het debiet op 450 microliter per minuut en het verloop zoals afgebeeld.Stel de temperatuur van het kolomcompartiment in op 45 graden Celsius. Raadpleeg de tekst voor meer informatie over kolom- en LC-systeem. Zorg ervoor dat de MS-instellingen in uw TSQ Altis zijn zoals hier wordt weergegeven.Importeer één overgangslijst om een nieuwe methode te maken. We raden aan om de resolutie voor quadrupole 1 en quadrupole 3 op 7 te houden. Deze kunnen indien nodig verder worden geoptimaliseerd.Om consistentie in uitvoeringen en bijgevolg de gegevens kwaliteit te garanderen, bereidt u uw uitvoerings reeks voor zoals wordt weer gegeven. Begin met een paar spaties, verwijs naar de tekst voor de samenstelling van het blancomengsel, gevolgd door een QC standaardlicht BSA van bekende concentratie om elke variatie in de dagrespons van het instrument te controleren. De QC gedaan moet net voor de monsters.Zet vervolgens alle monsters op een rij met losse flodders ertussen. Injecteer gelijke volumes van elk monster, goed voor 25 tot 1 nanogram peptiden per injectie. Als u een verfijnde methode wilt maken, voert u eerst de ongedefinieerde methoden uit op hele monsters.Importeer resultaten in Skyline en controleer handmatig elk peptide. Selecteer voor elk peptide één precursor met consistent goede pieken in alle monsters. Verwijder precursoren en peptiden die geen goede pieken vertonen.Zorg ervoor dat alle pieken goed zijn geannoteerd. Om de juiste piek te selecteren en de overgangen onder elke precursor verder te verfijnen, kan een bibliotheek worden gebruikt. Een bibliotheek is een set MS-MS spectrale gegevens die overeenkomen met peptiden en overgangen van de huidige experimentele gegevens.Kies pieken met DART P-waarden dichter bij 1 en verwijder overgangen die niet overeenkomen met de bibliotheek. Een DART P-waarde geeft aan hoe goed de overeenkomst is tussen de experimentele piek en de bibliotheekpiek. Na een of twee optimalisatierondes is een verfijnde lijst klaar.Deze verfijnde lijst kan worden uitgevoerd voor afzonderlijke voorbeelden. Importeer de verfijnde runs in Skyline en maak een goede aantekeningen van pieken. Gebruik het tabblad Annotatie onder Documentinstellingen om elk voorbeeld in het documentraster zorgvuldig te annoteren.Gebruik de functie Groepsvergelijking om vergelijkingen te maken tussen voorwaarde 1 en voorwaarde 2 van uw experiment. Dit geeft tabel met aangepaste P-waarden en vouwwisselwaarden tussen de twee groepen. Voor zover wij weten, is dit de eerste studie die het gebruik van MRM gebruikt om peptiden te detecteren voor de eiwitten Apolipoproteïne A-1, Vimentin en Nicotinamide phosphoribosyltransferase in menselijke hersenweefselmonsters.Het optimaliseren van verschillende parameters zoals LC-gradiënt, verblijftijd, cyclustijd en botsingsenergie kan het succes van een MRM-experiment sterk beïnvloeden. Wij geloven dat deze techniek kan worden gebruikt om patronen van biomarkers te ontwikkelen met het vermogen om onderscheid te maken tussen verschillende klinische aandoeningen en ziekten.

Research

JoVE Journal

Biology

A Chromatin Assay for Human Brain Tissue

Een Chromatine Assay voor menselijk hersenweefsel

Chronic neuropsychiatric illnesses such as schizophrenia, bipolar disease and autism are thought to result from a combination of genetic and environmental ...

Neuronal Nuclei Isolation from Human Postmortem Brain Tissue

Neuronale Kernen Isolatie van Human postmortaal hersenweefsel

Neurons in the human brain become postmitotic largely during prenatal development, and thus maintain their nuclei throughout the full lifespan. However, ...

Monitoring Acupuncture Effects on Human Brain by fMRI

Monitoring Acupunctuur effecten op de menselijke hersenen door fMRI

Functional MRI is used to study the effects of acupuncture on the BOLD response and the functional connectivity of the human brain.  Results demonstrate ...

Identification of protein complexes with quantitative proteomics in S. cerevisiae

Identificatie van eiwit-complexen met kwantitatieve proteomics in S. cerevisiae

Lipids are the building blocks of cellular membranes that function as barriers and in compartmentalization of cellular processes, and recently, as ...

Obtaining High Quality RNA from Single Cell Populations in Human Postmortem Brain Tissue

Het verkrijgen van hoge kwaliteit-RNA van Single celpopulaties in Human postmortaal hersenweefsel

We proposed to investigate the gray matter reduction in the superior temporal gyrus seen in schizophrenia patients, by interrogating gene expression ...

High-throughput Crystallization of Membrane Proteins Using the Lipidic Bicelle Method

High-throughput Kristallisatie van membraaneiwitten Met behulp van de lipidische Bicelle Method

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane ...

A Quantitative Fitness Analysis Workflow

Een kwantitatieve analyse Fitness Workflow

Quantitative Fitness Analysis (QFA) is an experimental and computational workflow for comparing fitnesses of microbial cultures grown in parallel1,2,3,4. ...

Proteomic Sample Preparation from Formalin Fixed and Paraffin Embedded Tissue

Proteomics Monstervoorbereiding van formaline gefixeerde en in paraffine ingebed weefsel

Preserved clinical material is a unique source for proteomic investigation of human disorders. Here we describe an optimized protocol allowing large scale ...

Identification of Protein Interaction Partners in Mammalian Cells Using SILAC-immunoprecipitation Quantitative Proteomics

Identificatie van eiwit interacties Partners in zoogdiercellen behulp SILAC-immunoprecipitaties Kwantitatieve Proteomics

Quantitative proteomics combined with immuno-affinity purification, SILAC immunoprecipitation, represent a powerful means for the discovery of novel ...

Selected Reaction Monitoring Mass Spectrometry for Absolute Protein Quantification

Geselecteerde Reaction Monitoring Massaspectrometrie voor Absolute Protein kwantificering

Absolute quantification of target proteins within complex biological samples is critical to a wide range of research and clinical applications. This ...