Name: quantitative proteomics workflow using multiple reaction monitoring based detection of proteins from human brain tissue
Uploaded: 2021-08-28T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Proteomics Workflow using Multiple Reaction Monitoring Based Detection of Proteins from Human Brain Tissue at JoVE.com

Nous reconnaissons le projet MHRD-UAY (UCHHATAR AVISHKAR YOJANA), projet #34_IITB à SS et MASSFIITB Facility à IIT Bombay soutenu par le Département de biotechnologie (BT / PR13114 / INF / 22/206/ 2015) pour mener à bien toutes les expériences liées à la SEP.
Nous remercions tout particulièrement M. Rishabh Yadav pour la réalisation et le montage de l’ensemble de la vidéo et M. Nishant Nerurkar pour son travail de montage audio.

Cette étude porte sur des échantillons de tissus cérébraux de participants humains, examinés et approuvés par TMH et IITB IEC - (IITB-IEC/2018/019). Les participants ont donné leur consentement éclairé et écrit pour participer à cette étude.
1 Extraction de protéines à partir de tissus cérébraux
<ol><li>Peser environ 50 mg de tissu cérébral et laver le tissu avec 300 μL de solution saline tampon phosphate (PBS) à l’aide d’une micropipette. REMARQUE: Cette étape es...

<ol>
	<li>Picotti, P., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selected+reaction+monitoring-based+proteomics:+Workflows,+potential,+pitfalls+and+future+directions.">Selected reaction monitoring-based proteomics: Workflows, potential, pitfalls and future directions.</a> Nature Methods. , (2012).</li><li>Carr, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+peptide+measurements+in+biology+and+medicine:+Best+practices+for+mass+spectrometry-based+assay+development+using+a+fit-for-purpose+approach.">Targeted peptide measurements in biology and medicine: Best practices for mass spectrometry-based assay development using a fit-for-purpose approach.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 13 (3), 907-917 (2014).</li><li>Pitt, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+and+applications+of+liquid+chromatography-mass+spectrometry+in+clinical+biochemistry.">Principles and applications of liquid chromatography-mass spectrometry in clinical biochemistry.</a> The Clinical biochemist Reviews. 30 (1), 19-34 (2009).</li><li>Hosp, F., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Primer+on+Concepts+and+Applications+of+Proteomics+in+Neuroscience.">A Primer on Concepts and Applications of Proteomics in Neuroscience.</a> Neuron. 96 (3), 558-571 (2017).</li><li>Scopes, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+protein+by+spectrophotometry+at+205+nm.">Measurement of protein by spectrophotometry at 205 nm.</a> Analytical Biochemistry. , (1974).</li><li>Kusebauch, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+SRMAtlas:+A+Resource+of+Targeted+Assays+to+Quantify+the+Complete+Human+Proteome.">Human SRMAtlas: A Resource of Targeted Assays to Quantify the Complete Human Proteome.</a> Cell. , (2016).</li><li>MacLean, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skyline:+an+open+source+document+editor+for+creating+and+analyzing+targeted+proteomics+experiments.">Skyline: an open source document editor for creating and analyzing targeted proteomics experiments.</a> Bioinformatics. 26 (7), 966-968 (2010).</li><li>Gerber, S. A., Rush, J., Stemman, O., Kirschner, M. W., Gygi, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absolute+quantification+of+proteins+and+phosphoproteins+from+cell+lysates+by+tandem+MS.">Absolute quantification of proteins and phosphoproteins from cell lysates by tandem MS.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2003).</li><li>Escher, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+iRT,+a+normalized+retention+time+for+more+targeted+measurement+of+peptides.">Using iRT, a normalized retention time for more targeted measurement of peptides.</a> Proteomics. , (2012).</li><li>Gillette, M. A., Carr, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+peptides+and+proteins+in+biomedicine+by+targeted+mass+spectrometry.">Quantitative analysis of peptides and proteins in biomedicine by targeted mass spectrometry.</a> Nature Methods. 10 (1), 28-34 (2013).</li><li>Whiteaker, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+targeted+proteomics-based+pipeline+for+verification+of+biomarkers+in+plasma.">A targeted proteomics-based pipeline for verification of biomarkers in plasma.</a> Nature Biotechnology. , (2011).</li><li>H&#252;ttenhain, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproducible+quantification+of+cancer-associated+proteins+in+body+fluids+using+targeted+proteomics.">Reproducible quantification of cancer-associated proteins in body fluids using targeted proteomics.</a> Science Translational Medicine. 4 (142), 94 (2012).</li><li>Mermelekas, G., Vlahou, A., Zoidakis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SRM/MRM+targeted+proteomics+as+a+tool+for+biomarker+validation+and+absolute+quantification+in+human+urine.">SRM/MRM targeted proteomics as a tool for biomarker validation and absolute quantification in human urine.</a> Expert Review of Molecular Diagnostics. 15 (11), 1441-1454 (2015).</li><li>Koldamova, R. P., Lefterov, I. M., Lefterova, M. I., Lazo, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apolipoprotein+A-I+directly+interacts+with+amyloid+precursor+protein+and+inhibits+A&#946;+aggregation+and+toxicity.">Apolipoprotein A-I directly interacts with amyloid precursor protein and inhibits A&#946; aggregation and toxicity.</a> Biochemistry. , (2001).</li><li>Jiang, S. X., Slinn, J., Aylsworth, A., Hou, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vimentin+participates+in+microglia+activation+and+neurotoxicity+in+cerebral+ischemia.">Vimentin participates in microglia activation and neurotoxicity in cerebral ischemia.</a> Journal of Neurochemistry. , (2012).</li><li>Liu, L. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nicotinamide+Phosphoribosyltransferase+May+Be+Involved+in+Age-Related+Brain+Diseases.">Nicotinamide Phosphoribosyltransferase May Be Involved in Age-Related Brain Diseases.</a> PLoS ONE. , (2012).</li><li>Abbatiello, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+guidelines+for+publication+of+manuscripts+describing+development+and+application+of+targeted+mass+spectrometry+measurements+of+peptides+and+proteins.">New guidelines for publication of manuscripts describing development and application of targeted mass spectrometry measurements of peptides and proteins.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 16 (3), 327-328 (2017).</li></ol>

Des techniques telles que l’immunohistochimie et le Western blotting ont été considérées comme les étalons-or pour la validation des cibles protéiques pendant de nombreuses années. Ces méthodes trouvent une utilisation même aujourd’hui avec des modifications mineures dans le protocole et peu de dépendance à la technologie, ce qui les rend très lourdes et fastidieuses. En outre, ils impliquent également l’utilisation d’anticorps coûteux qui ne présentent pas toujours la même spécificité entre le...

Au cours de la dernière décennie, les développements rapides de la spectrométrie de masse (SEP) associés à une meilleure compréhension des techniques de chromatographie ont grandement contribué à l’avancement de la protéomique basée sur la SEP. Les techniques basées sur la biologie moléculaire telles que le transfert de Western et l’immunohistochimie souffrent depuis longtemps de problèmes de reproductibilité, de délais d’exécution lents, de variabilité entre observateurs et de leur incapacité à quantifier avec précision les protéines, pour n’en nommer que quelques-unes. À cette fin, la sensibilité supérieure des approches protéomiques à haut débit continue d’offrir aux biologistes moléculaires un outil alternatif et plus fiable dans leur quête pour mieux comprendre les rôles des protéines dans les cellules. Cependant, les approches protéomiques au fusil de chasse (Acquisition dépendante des données ou DDA) ne parviennent souvent pas à détecter les protéines faiblement abondantes dans les tissus complexes en plus d’être fortement dépendantes de la sensibilité et de la résolution de l’instrument. Au cours des deux dernières années, des laboratoires du monde entier ont développé des techniques telles que l’acquisition indépendante des données (DIA) qui nécessitent une puissance de calcul accrue et des logiciels fiables pouvant gérer ces ensembles de données très complexes. Cependant, ces techniques sont encore un travail en cours et peu conviviales. Les approches protéomiques ciblées basées sur la SEP offrent un équilibre parfait entre la nature à haut débit des approches MS et la sensibilité des approches de biologie moléculaire comme ELISA. Une expérience protéomique ciblée basée sur la spectrométrie de masse se concentre sur la détection de protéines ou de peptides basés sur des hypothèses à partir d’expériences protéomiques basées sur la découverte ou dans la littérature disponible1,2. La surveillance des réactions multiples (MRM) est l’une de ces approches ciblées de SEP qui utilise un spectromètre de masse quadripolaire en tandem pour la détection et la quantification précises des protéines / peptides à partir d’échantillons complexes. La technique offre une sensibilité et une spécificité plus élevées malgré l’utilisation d’un instrument à basse résolution.
Un quadripôle est composé de 4 tiges parallèles, chaque tige 1 nouant une connexion à la tige diagonalement opposée. Un champ fluctuant est créé entre les tiges quadripolaire en appliquant des tensions RF et CC alternées. La trajectoire des ions à l’intérieur du quadripôle est influencée par la présence des mêmes tensions sur les tiges opposées. En appliquant la RF à la tension continue, la trajectoire des ions peut être stabilisée. C’est cette propriété du quadripôle qui lui permet d’être utilisé comme filtre de masse qui peut sélectivement laisser passer des ions spécifiques. Selon les besoins, un quadripôle peut être utilisé en mode statique ou en mode de numérisation. Le mode statique ne laisse passer que les ions avec un m/z spécifié, ce qui rend le mode très sélectif et spécifique à l’ion d’intérêt. Le mode de balayage, d’autre part, permet aux ions de traverser toute la gamme m / z. Ainsi, les spectromètres de masse quadripolaire tandem peuvent fonctionner de 4 manières possibles : i) le premier quadripolaire fonctionnant en mode statique tandis que le second fonctionnant en mode balayage ; ii) le premier quadripôle fonctionnant en mode de balayage tandis que le second fonctionnant en mode statique; iii) les deux quadripôles fonctionnant en mode de balayage; et iv) les deux quadripôles fonctionnant en mode statique3. Dans une expérience MRM typique, les deux quadripôles fonctionnent en mode statique, ce qui permet de surveiller des précurseurs spécifiques et leurs produits résultants après fragmentation. Cela rend la technique très sensible et sélective permettant une quantification précise.
Pour les biologistes moléculaires, le tissu cérébral humain et ses cellules sont un trésor. Ces unités remarquables d’un organe toujours intéressant du corps humain peuvent fournir des informations moléculaires et cellulaires sur son fonctionnement. Les investigations protéomiques du tissu cérébral peuvent non seulement nous aider à comprendre le fonctionnement systémique d’un cerveau sain, mais aussi les voies cellulaires qui sont dérégulées lorsqu’elles sont infligées par une maladie4. Cependant, le tissu cérébral avec toute son hétérogénéité est un organe très complexe à analyser et nécessite une approche concertée pour une meilleure compréhension des changements au niveau moléculaire. Les travaux suivants décrivent l’ensemble du flux de travail, depuis l’extraction des protéines du tissu cérébral, la création et l’optimisation des méthodes de dosage MRM, jusqu’à la validation des cibles (Figure 1). Ici, nous avons systématiquement mis en évidence les principales étapes d’une expérience réussie basée sur la MRM utilisant du tissu cérébral humain dans le but de présenter la technique et ses défis à une communauté de recherche plus large.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile (MS grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A/0620/21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>TC194-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Fischer Scienific</td>
			<td>BP510-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid (MS grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>147930250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1149-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol (MS grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Q13827</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Fischer Scienific</td>
			<td>BP214-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol (MS grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A456-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS grade water</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>51140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>TL1006-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Roche Diagnostics</td>
			<td>11873580001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>DF6D661300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCEP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>646547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Merck</td>
			<td>648310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin (MS grade)</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>90058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Merck</td>
			<td>MB1D691237</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Supplies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypersil Gold C18 column</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>25002-102130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipettes</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F167380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stage tips</td>
			<td>MilliPore</td>
			<td>ZTC18M008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zirconia/Silica beads</td>
			<td>BioSpec products</td>
			<td>11079110z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bead beater (Homogeniser)</td>
			<td>Bertin Minilys</td>
			<td>P000673-MLYS0-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader (spectrophotometer)</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>MultiSkan Go</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td>Eutech</td>
			<td>CyberScan pH 510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Probe Sonicator</td>
			<td>Sonics Materials, Inc</td>
			<td>VCX 130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking Drybath</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>88880028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TSQ Altis mass spectrometer</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>TSQ02-10002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>uHPLC - Vanquish</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>VQF01-20001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum concentrator</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>Savant ISS 110</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative proteomics workflow using multiple reaction monitoring based detection of proteins from human brain tissue

L’analyse protéomique du tissu cérébral humain au cours de la dernière décennie a grandement amélioré notre compréhension du cerveau. Cependant, les troubles liés au cerveau continuent d’être un contributeur majeur de décès dans le monde, nécessitant la nécessité d’une compréhension encore plus grande de leur pathobiologie. Les techniques traditionnelles à base d’anticorps comme le western blotting ou l’immunohistochimie souffrent d’un faible débit en plus d’être à forte intensité de main-d’œuvre et qualitatives ou semi-quantitatives. Même les approches conventionnelles basées sur la spectrométrie de masse au fusil de chasse ne parviennent pas à fournir des preuves concluantes à l’appui d’une certaine hypothèse. Les approches protéomiques ciblées sont largement fondées sur des hypothèses et diffèrent des approches protéomiques conventionnelles qui ont été utilisées depuis longtemps. La surveillance des réactions multiples est l’une de ces approches ciblées qui nécessite l’utilisation d’un spectromètre de masse spécial appelé spectromètre de masse quadripolaire tandem ou spectromètre de masse triple quadripolaire. Dans la présente étude, nous avons systématiquement mis en évidence les principales étapes impliquées dans la réalisation réussie d’un flux de travail protéomique basé sur la spectrométrie de masse quadripolaire en tandem en utilisant du tissu cérébral humain dans le but d’introduire ce flux de travail dans une communauté de recherche plus large.

Nous avons effectué une quantification relative de 3 protéines à partir de 10 échantillons, 5 échantillons de chaque groupe de patients présentant des anomalies dans le cerveau. Ces protéines comprenaient l’apolipoprotéine A-I (APOA-I), la vimentine (VIM) et la nicotinamide phosphoribosyltransférase (NAMPT) qui sont connues pour jouer divers rôles dans les cellules du cerveau. L’analyse post-exécution des données a été effectuée à l’aide de Skyline-daily (Ver 20.2.1.286). Au total, 10 peptides corre...

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Quantitative Proteomics Workflow using Multiple Reaction Monitoring Based Detection of Proteins from Human Brain Tissue

Le protocole vise à introduire l’utilisation d’un spectromètre de masse triple quadripolaire pour la surveillance des réactions multiples (MRM) des protéines provenant d’échantillons cliniques. Nous avons fourni un flux de travail systématique allant de la préparation des échantillons à l’analyse des données pour les échantillons cliniques avec toutes les précautions nécessaires à prendre.

Flux de travail protéomique quantitative utilisant la détection basée sur la surveillance des réactions multiples des protéines du tissu cérébral humain

The proteomic analysis of the human brain tissue over the last decade has greatly enhanced our understanding of the brain. However, brain related ...

Les approches protéomiques ciblées deviennent rapidement la méthode de choix pour la validation des protéines à partir d’expériences protéomiques à court terme ou d’expériences basées sur la biologie moléculaire. La surveillance des réactions multiples est l’une de ces approches ciblées qui est de plus en plus utilisée pour détecter et quantifier les protéines à partir d’échantillons biologiques. Dans cette étude, nous avons parcouru les différentes étapes impliquées dans la détection et la quantification des protéines du tissu cérébral humain dans le but d’initier les lecteurs aux exigences de base d’une expérience MRM.Peser environ 50 mg de tissu cérébral et laver le tissu avec 300 microlitres de 1x solution saline tamponnée au phosphate. Cette étape est effectuée pour éliminer tout sang sur la surface externe du tissu, et il est donc conseillé d’enlever autant de sang que possible. Après les lavages avec PBS, ajoutez 300 microlitres de tampon de lyse au tube contenant le tissu.Lysez le tissu à l’aide d’un sondeur à sonde tout en gardant le tube sur un bain de glace. Poursuivez l’homogénéisation des tissus à l’aide d’un batteur de billes pour lyser complètement le tissu. Centrifuger le contenu du tube à 6000 g pendant 15 minutes à quatre degrés centigrades.Transférer le surnageant dans un tube frais et mélanger de manière homogène. Prenez une petite aliquote du surnageant et quantifiez la teneur en protéines à l’aide d’un test protéique standard. Nous montrons ici un exemple d’estimation des protéines à l’aide du test de Bradford.Prendre 50 microgrammes de protéines dans un tube de microcentrifugation et réduire le contenu en ajoutant du TCEP de telle sorte que la concentration finale soit de 20 millimolaires. Incuber le contenu à 37 degrés pendant une heure. Après l’incubation, alkyler les protéines réduites en ajoutant de l’iodoacétamide au tube, de sorte que la concentration finale soit de 40 millimolaires.Incuber le tube dans l’obscurité pendant 30 minutes. Maintenant, ajoutez le tampon B au tube contenant les protéines réduites et alkylées de sorte que la concentration finale d’urée soit inférieure à une molaire. Ajouter la trypsine dans 1 comme à 30 rapport enzyme-protéine et incuber les tubes pendant la nuit à 37 degrés avec un tremblement constant.Après la digestion, concentrez les peptides digérés dans un concentrateur sous vide. À cette étape, les peptides peuvent être reconstitués et dessalés ou stockés à moins 80 pour une utilisation future. Le dessalement, ou nettoyage peptidique, est essentiel avant de charger les échantillons sur tout LC-MS MS. Les sels et autres contaminants présents dans l’échantillon peuvent obstruer la colonne et affecter la sensibilité de l’instrument à long terme.Ce processus peut être effectué à l’aide de pointes ou de colonnes C18 STAGE disponibles dans le commerce. Ici, nous avons décrit le flux de travail pour le dessalement des peptides à l’aide d’une pointe C18 STAGE. Après le dessalement, sécher les peptides dans un concentrateur sous vide.Reconstituer ces peptides propres et procéder à la quantification à l’aide de la méthode Scopes. Pour cela, chargez deux microlitres de l’échantillon dans une plaque de microgoutte et calculez la concentration comme indiqué dans la diapositive. La préparation de la liste de transition est une étape cruciale dans une expérience SRM ou MRM.Une liste de transition contient toutes les informations requises par le spectromètre de masse pour surveiller la transition. Cela inclut les valeurs m par z des ions précurseurs et produits, l’énergie de collision de la transition, la polarité de l’instrument et la plage de temps pour l’acquisition des données. Préparez la liste de transition à l’aide de Skyline.Préparez un protéome d’arrière-plan à l’aide du fichier Human Proteome Fasta d’UniProt et assurez-vous qu’il est sélectionné sous l’onglet Arrière-plan de Paramètres du peptide. Dans l’onglet Filtre, définissez une longueur minimale de 8 et une longueur maximale de 25. Continuez à utiliser les paramètres par défaut s’il n’y a pas d’autres modifications dans les peptides.Une fois les paramètres peptidiques effectués, cliquez sur Paramètres de transition. Sous l’onglet Filtre, définissez les charges de précurseur sur 2 et 3. Définissez les charges d’ions sur 1 et définissez les types d’ions sur y.Les ions de produit peuvent être sélectionnés en fonction du choix de l’utilisateur. Laissez tous les paramètres par défaut. Insérez maintenant les ID d’accession des protéines cibles sélectionnées.Cela peut être fait en cliquant sur l’onglet Modifier, puis en sélectionnant Insérer et enfin en collant les D’accession. Les IDs seront mappés aux protéines du protéome de fond et une liste de transition sera créée en fonction du peptide et des paramètres de transition définis précédemment. Exportez cette liste de transition.Assurez-vous que le bon instrument est sélectionné en cliquant sur l’option déroulante Type d’instrument. Dans ce cas, l’instrument est Thermo Altis. Étant donné que la liste de transitions non définie comporte trop de transitions, conservez une limite de seulement 350 transitions par liste et exportez-la en tant que méthodes multiples.Un système de solvant binaire est utilisé. Le solvant A est de 1 % FA et le solvant B est de 80 % ACN. Maintenez le débit à 450 microlitres par minute et le gradient comme indiqué.Réglez la température du compartiment de la colonne à 45 degrés Celsius. Pour plus de détails sur la colonne et le système LC, reportez-vous au texte. Assurez-vous que les paramètres MS de votre TSQ Altis sont comme indiqué ici.Importez une liste de transition unique pour créer une nouvelle méthode. Nous suggérons de garder la résolution pour quadrupole 1 et quadrupole 3 à 7. Ceux-ci peuvent être optimisés si nécessaire.Pour garantir la cohérence des exécutions et, par conséquent, la qualité des données, préparez votre séquence d’exécution comme indiqué. Commencez par quelques ébauches, référez-vous au texte pour la composition du mélange à blanc, suivi d’une lumière standard QC BSA de concentration connue pour surveiller toute variation de la réponse journalaire de l’instrument. Le QC effectué doit être juste avant les échantillons.Ensuite, alignez tous les échantillons avec des blancs entre les deux. Injecter des volumes égaux de chaque échantillon, représentant 25 à 1 nanogramme de peptides par injection. Pour créer une méthode affinée, exécutez d’abord les méthodes non définies sur des échantillons entiers.Importez les résultats dans Skyline et vérifiez manuellement chaque peptide. Pour chaque peptide, sélectionnez un précurseur montrant des pics toujours bons dans tous les échantillons. Supprimer les précurseurs et les peptides qui ne présentent pas de bons pics.Assurez-vous que tous les pics sont annotés correctement. Pour sélectionner le bon pic et affiner davantage les transitions sous chaque précurseur, une bibliothèque peut être utilisée. Une bibliothèque est un ensemble de données spectrales MS-MS appariées avec des peptides et des transitions des données expérimentales actuelles.Choisissez les pics dont les valeurs DART P sont plus proches de 1 et supprimez les transitions qui ne correspondent pas à la bibliothèque. Une valeur DART P indique la qualité de la correspondance entre le pic expérimental et le pic de bibliothèque. Après un ou deux tours d’optimisation, une liste affinée sera prête.Cette liste affinée peut être exécutée pour des échantillons individuels. Importez les pistes raffinées dans Skyline et annotez correctement les pics. Utilisez l’onglet Annotation sous Paramètres du document pour annoter soigneusement chaque échantillon de la grille du document.Utilisez la fonction de comparaison de groupes pour créer des comparaisons entre la condition 1 et la condition 2 de votre expérience. Cela donnera un tableau avec des valeurs P ajustées et des valeurs de changement de pliage entre les deux groupes. À notre connaissance, il s’agit de la première étude utilisant l’utilisation de la MRM pour détecter des peptides pour les protéines Apolipoprotéine A-1, Vimentine et Nicotinamide phosphoribosyltransférase dans des échantillons de tissus cérébraux humains.L’optimisation de divers paramètres tels que le gradient LC, le temps de séjour, le temps de cycle et l’énergie de collision peut grandement influencer le succès d’une expérience MRM. Nous croyons que cette technique peut être utilisée pour développer des modèles de biomarqueurs capables de distinguer entre différentes conditions cliniques et maladies.

Research

JoVE Journal

Biology

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Recherche

Biologie

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We proposed to investigate the gray matter reduction in the superior temporal gyrus seen in schizophrenia patients, by interrogating gene expression ...

High-throughput Crystallization of Membrane Proteins Using the Lipidic Bicelle Method

Haut débit cristallisation des protéines membranaires en utilisant la méthode lipidique Bicelle

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane ...

A Quantitative Fitness Analysis Workflow

Un flux de travail de remise en forme Analyse quantitative

Quantitative Fitness Analysis (QFA) is an experimental and computational workflow for comparing fitnesses of microbial cultures grown in parallel1,2,3,4. ...

Proteomic Sample Preparation from Formalin Fixed and Paraffin Embedded Tissue

Protéomique Préparation de l&#39;échantillon de formol et inclus en paraffine fixe tissus

Preserved clinical material is a unique source for proteomic investigation of human disorders. Here we describe an optimized protocol allowing large scale ...

Identification of Protein Interaction Partners in Mammalian Cells Using SILAC-immunoprecipitation Quantitative Proteomics

Identification des protéines d&#39;interaction partenaires dans les cellules de mammifères à l&#39;aide SILAC-immunoprécipitation quantitatives en protéomique

Quantitative proteomics combined with immuno-affinity purification, SILAC immunoprecipitation, represent a powerful means for the discovery of novel ...

Selected Reaction Monitoring Mass Spectrometry for Absolute Protein Quantification

Selected Reaction Monitoring spectrométrie de masse pour Absolute quantification des protéines

Absolute quantification of target proteins within complex biological samples is critical to a wide range of research and clinical applications. This ...