Name: quantitative proteomics workflow using multiple reaction monitoring based detection of proteins from human brain tissue
Uploaded: 2021-08-28T13:00:00
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Wir danken dem MHRD-UAY-Projekt (UCHHATAR AVISHKAR YOJANA), dem Projekt #34_IITB SS und massfiitB Facility am IIT Bombay, das vom Department of Biotechnology (BT / PR13114 / INF / 22 / 206 / 2015) unterstützt wird, um alle MS-bezogenen Experimente durchzuführen.
Wir danken Herrn Rishabh Yadav für die Erstellung und Bearbeitung des gesamten Videos und Herrn Nishant Nerurkar für seine Arbeit bei der Bearbeitung des Audios.

Diese Studie umfasst Hirngewebeproben von menschlichen Teilnehmern, die von TMH und IITB IEC - (IITB-IEC/ 2018/019) überprüft und genehmigt wurden. Die Teilnehmer gaben ihre informierte und schriftliche Zustimmung zur Teilnahme an dieser Studie.
1 Proteinextraktion aus Hirngewebe
<ol><li>Wiegen Sie etwa 50 mg Hirngewebe und waschen Sie das Gewebe mit 300 μL 1x Phosphatpuffersalzlösung (PBS) mit einer Mikropipette. HINWEIS: Dieser Schritt wird durchgeführt, um Blut auf der äußeren O...

<ol>
	<li>Picotti, P., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selected+reaction+monitoring-based+proteomics:+Workflows,+potential,+pitfalls+and+future+directions.">Selected reaction monitoring-based proteomics: Workflows, potential, pitfalls and future directions.</a> Nature Methods. , (2012).</li><li>Carr, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+peptide+measurements+in+biology+and+medicine:+Best+practices+for+mass+spectrometry-based+assay+development+using+a+fit-for-purpose+approach.">Targeted peptide measurements in biology and medicine: Best practices for mass spectrometry-based assay development using a fit-for-purpose approach.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 13 (3), 907-917 (2014).</li><li>Pitt, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+and+applications+of+liquid+chromatography-mass+spectrometry+in+clinical+biochemistry.">Principles and applications of liquid chromatography-mass spectrometry in clinical biochemistry.</a> The Clinical biochemist Reviews. 30 (1), 19-34 (2009).</li><li>Hosp, F., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Primer+on+Concepts+and+Applications+of+Proteomics+in+Neuroscience.">A Primer on Concepts and Applications of Proteomics in Neuroscience.</a> Neuron. 96 (3), 558-571 (2017).</li><li>Scopes, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+protein+by+spectrophotometry+at+205+nm.">Measurement of protein by spectrophotometry at 205 nm.</a> Analytical Biochemistry. , (1974).</li><li>Kusebauch, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+SRMAtlas:+A+Resource+of+Targeted+Assays+to+Quantify+the+Complete+Human+Proteome.">Human SRMAtlas: A Resource of Targeted Assays to Quantify the Complete Human Proteome.</a> Cell. , (2016).</li><li>MacLean, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skyline:+an+open+source+document+editor+for+creating+and+analyzing+targeted+proteomics+experiments.">Skyline: an open source document editor for creating and analyzing targeted proteomics experiments.</a> Bioinformatics. 26 (7), 966-968 (2010).</li><li>Gerber, S. A., Rush, J., Stemman, O., Kirschner, M. W., Gygi, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absolute+quantification+of+proteins+and+phosphoproteins+from+cell+lysates+by+tandem+MS.">Absolute quantification of proteins and phosphoproteins from cell lysates by tandem MS.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2003).</li><li>Escher, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+iRT,+a+normalized+retention+time+for+more+targeted+measurement+of+peptides.">Using iRT, a normalized retention time for more targeted measurement of peptides.</a> Proteomics. , (2012).</li><li>Gillette, M. A., Carr, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+peptides+and+proteins+in+biomedicine+by+targeted+mass+spectrometry.">Quantitative analysis of peptides and proteins in biomedicine by targeted mass spectrometry.</a> Nature Methods. 10 (1), 28-34 (2013).</li><li>Whiteaker, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+targeted+proteomics-based+pipeline+for+verification+of+biomarkers+in+plasma.">A targeted proteomics-based pipeline for verification of biomarkers in plasma.</a> Nature Biotechnology. , (2011).</li><li>H&#252;ttenhain, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproducible+quantification+of+cancer-associated+proteins+in+body+fluids+using+targeted+proteomics.">Reproducible quantification of cancer-associated proteins in body fluids using targeted proteomics.</a> Science Translational Medicine. 4 (142), 94 (2012).</li><li>Mermelekas, G., Vlahou, A., Zoidakis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SRM/MRM+targeted+proteomics+as+a+tool+for+biomarker+validation+and+absolute+quantification+in+human+urine.">SRM/MRM targeted proteomics as a tool for biomarker validation and absolute quantification in human urine.</a> Expert Review of Molecular Diagnostics. 15 (11), 1441-1454 (2015).</li><li>Koldamova, R. P., Lefterov, I. M., Lefterova, M. I., Lazo, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apolipoprotein+A-I+directly+interacts+with+amyloid+precursor+protein+and+inhibits+A&#946;+aggregation+and+toxicity.">Apolipoprotein A-I directly interacts with amyloid precursor protein and inhibits A&#946; aggregation and toxicity.</a> Biochemistry. , (2001).</li><li>Jiang, S. X., Slinn, J., Aylsworth, A., Hou, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vimentin+participates+in+microglia+activation+and+neurotoxicity+in+cerebral+ischemia.">Vimentin participates in microglia activation and neurotoxicity in cerebral ischemia.</a> Journal of Neurochemistry. , (2012).</li><li>Liu, L. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nicotinamide+Phosphoribosyltransferase+May+Be+Involved+in+Age-Related+Brain+Diseases.">Nicotinamide Phosphoribosyltransferase May Be Involved in Age-Related Brain Diseases.</a> PLoS ONE. , (2012).</li><li>Abbatiello, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+guidelines+for+publication+of+manuscripts+describing+development+and+application+of+targeted+mass+spectrometry+measurements+of+peptides+and+proteins.">New guidelines for publication of manuscripts describing development and application of targeted mass spectrometry measurements of peptides and proteins.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 16 (3), 327-328 (2017).</li></ol>

Techniken wie Immunhistochemie und Western Blotting galten viele Jahre lang als Goldstandards für die Validierung von Proteinzielen. Diese Methoden finden auch heute noch Anwendung mit geringfügigen Änderungen im Protokoll und wenig Abhängigkeit von der Technologie, was sie sehr umständlich und mühsam macht. Darüber hinaus beinhalten sie auch den Einsatz teurer Antikörper, die nicht immer die gleiche Spezifität über Chargen hinweg aufweisen und viel Fachwissen erfordern. Darüber hinaus verfügt nur ein kleine...

In den letzten zehn Jahren haben schnelle Entwicklungen in der Massenspektrometrie (MS) in Verbindung mit einem besseren Verständnis der Chromatographietechniken wesentlich zur Weiterentwicklung der MS-basierten Proteomik beigetragen. Molekularbiologische Techniken wie Western Blotting und Immunhistochemie leiden seit langem unter Reproduzierbarkeitsproblemen, langsamer Durchlaufzeit, Variabilität zwischen Beobachtern und ihrer Unfähigkeit, Proteine genau zu quantifizieren, um nur einige zu nennen. Zu diesem Zweck bietet die überlegene Empfindlichkeit von Hochdurchsatz-Proteomik-Ansätzen Molekularbiologen weiterhin ein alternatives und zuverlässigeres Werkzeug, um die Rolle von Proteinen in Zellen besser zu verstehen. Schrotflinten-Proteomik-Ansätze (Data Dependent Acquisition oder DDA) können jedoch oft keine proteinarmen Proteine in komplexen Geweben nachweisen und sind stark von der Empfindlichkeit und Auflösung des Instruments abhängig. In den letzten Jahren haben Labore auf der ganzen Welt Techniken wie Data Independent Acquisition (DIA) entwickelt, die eine erhöhte Rechenleistung und zuverlässige Software erfordern, die mit diesen hochkomplexen Datensätzen umgehen kann. Diese Techniken sind jedoch noch in Arbeit und nicht sehr benutzerfreundlich. Gezielte MS-basierte Proteomik-Ansätze bieten eine perfekte Balance zwischen dem hohen Durchsatz von MS-Ansätzen und der Sensitivität molekularbiologischer Ansätze wie ELISA. Ein gezieltes massenspektrometriebasiertes Proteomik-Experiment konzentriert sich auf den Nachweis hypothesengetriebener Proteine oder Peptide aus entdeckungsbasierten Shotgun-Proteomik-Experimenten oder durch verfügbare Literatur1,2. Multiple Reaction Monitoring (MRM) ist ein solcher gezielter MS-Ansatz, der ein Tandem-Quadrupol-Massenspektrometer zum genauen Nachweis und zur Quantifizierung von Proteinen / Peptiden aus komplexen Proben verwendet. Die Technik bietet eine höhere Empfindlichkeit und Spezifität, obwohl ein Gerät mit niedriger Auflösung erforderlich ist.
Ein Quadrupol besteht aus 4 parallelen Stäben, wobei jede Stange mit der diagonal gegenüberliegenden Stange verbunden ist. Zwischen den Quadrupolstäben entsteht durch Anlegen von wechselalten HF- und Gleichspannungen ein schwankendes Feld. Die Flugbahn der Ionen im Quadrupol wird durch das Vorhandensein der gleichen Spannungen über gegenüberliegende Stäbe beeinflusst. Durch Anlegen der HF-DC-Spannung kann die Flugbahn der Ionen stabilisiert werden. Es ist diese Eigenschaft des Quadrupols, die es ermöglicht, ihn als Massenfilter zu verwenden, der selektiv bestimmte Ionen passieren lassen kann. Je nach Bedarf kann ein Quadrupol entweder im statischen Modus oder im Scan-Modus betrieben werden. Der statische Modus lässt nur Ionen mit einem bestimmten m / z passieren, was den Modus sehr selektiv und spezifisch für das interessierene Ion macht. Der Scan-Modus hingegen lässt Ionen über den gesamten m/z-Bereich passieren. So können Tandem-Quadrupol-Massenspektrometer auf 4 mögliche Arten arbeiten: i) der erste Quadrupol arbeitet im statischen Modus, während der zweite im Scanmodus arbeitet; ii) der erste Quadrupol arbeitet im Scanmodus, während der zweite im statischen Modus arbeitet; iii) beide Quadruppole, die im Scanmodus arbeiten; und iv) beide Quadruppole, die im statischen Modus3arbeiten. In einem typischen MRM-Experiment arbeiten beide Quadrupolen im statischen Modus, so dass spezifische Vorläufer und ihre resultierenden Produkte nach der Fragmentierung überwacht werden können. Dies macht die Technik sehr empfindlich und selektiv und ermöglicht eine genaue Quantifizierung.
Für Molekularbiologen sind das menschliche Hirngewebe und seine Zellen eine Fundgrube. Diese bemerkenswerten Einheiten eines immer interessanten Organs des menschlichen Körpers können molekulare und zelluläre Einblicke in seine Funktionsweise liefern. Proteomische Untersuchungen des Hirngewebes können uns nicht nur helfen, die systemische Funktion eines gesunden Gehirns zu verstehen, sondern auch die zellulären Bahnen, die durch eine Krankheit dysreguliert werden4. Das Hirngewebe mit all seiner Heterogenität ist jedoch ein sehr komplexes zu analysierendes Organ und erfordert einen konzertierten Ansatz zum besseren Verständnis der Veränderungen auf molekularer Ebene. Die folgende Arbeit beschreibt den gesamten Arbeitsablauf von der Extraktion von Proteinen aus Hirngewebe über die Erstellung und Optimierung der Methoden für den MRM-Assay bis hin zur Validierung der Targets (Abbildung 1). Hier haben wir systematisch die wichtigsten Schritte eines erfolgreichen MRM-basierten Experiments mit menschlichem Hirngewebe hervorgehoben, mit dem Ziel, die Technik und ihre Herausforderungen einer breiteren Forschungsgemeinschaft vorzustellen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile (MS grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A/0620/21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>TC194-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Fischer Scienific</td>
			<td>BP510-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid (MS grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>147930250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1149-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol (MS grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Q13827</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Fischer Scienific</td>
			<td>BP214-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol (MS grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A456-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS grade water</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>51140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>TL1006-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Roche Diagnostics</td>
			<td>11873580001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>DF6D661300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCEP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>646547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Merck</td>
			<td>648310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin (MS grade)</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>90058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Merck</td>
			<td>MB1D691237</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Supplies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypersil Gold C18 column</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>25002-102130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipettes</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F167380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stage tips</td>
			<td>MilliPore</td>
			<td>ZTC18M008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zirconia/Silica beads</td>
			<td>BioSpec products</td>
			<td>11079110z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bead beater (Homogeniser)</td>
			<td>Bertin Minilys</td>
			<td>P000673-MLYS0-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader (spectrophotometer)</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>MultiSkan Go</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td>Eutech</td>
			<td>CyberScan pH 510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Probe Sonicator</td>
			<td>Sonics Materials, Inc</td>
			<td>VCX 130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking Drybath</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>88880028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TSQ Altis mass spectrometer</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>TSQ02-10002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>uHPLC - Vanquish</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>VQF01-20001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum concentrator</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>Savant ISS 110</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative proteomics workflow using multiple reaction monitoring based detection of proteins from human brain tissue

Die proteomische Analyse des menschlichen Hirngewebes in den letzten zehn Jahren hat unser Verständnis des Gehirns erheblich verbessert. Gehirnbedingte Störungen sind jedoch weiterhin ein Hauptfaktor für Todesfälle auf der ganzen Welt, was ein noch besseres Verständnis ihrer Pathobiologie erfordert. Traditionelle Antikörper-basierte Techniken wie Western Blotting oder Immunhistochemie leiden unter niedrigem Durchsatz und sind arbeitsintensiv und qualitativ oder semi-quantitativ. Selbst konventionelle massenspektrometrische Schrotflintenansätze liefern keine schlüssigen Beweise für eine bestimmte Hypothese. Gezielte Proteomik-Ansätze sind weitgehend hypothesengetrieben und unterscheiden sich von den herkömmlichen Shotgun-Proteomik-Ansätzen, die seit langem verwendet werden. Die Überwachung mehrerer Reaktionen ist ein solcher gezielter Ansatz, der die Verwendung eines speziellen Massenspektrometers erfordert, das als Tandem-Quadrupol-Massenspektrometer oder Dreifach-Quadrupol-Massenspektrometer bezeichnet wird. In der aktuellen Studie haben wir systematisch die wichtigsten Schritte hervorgehoben, die mit der Durchführung eines erfolgreichen Tandem-Quadrupol-Massenspektrometrie-basierten Proteomik-Workflows mit menschlichem Hirngewebe verbunden sind, mit dem Ziel, diesen Workflow einer breiteren Forschungsgemeinschaft vorzustellen.

Wir führten eine relative Quantifizierung von 3 Proteinen aus 10 Proben durch, 5 Proben aus jeder Gruppe von Patienten mit Anomalien im Gehirn. Zu diesen Proteinen gehörten Apolipoprotein A-I (APOA-I), Vimentin (VIM) und Nicotinamidphosphoribosyltransferase (NAMPT), von denen bekannt ist, dass sie verschiedene Rollen in den Gehirnzellen spielen. Die Post-Run-Analyse der Daten wurde mit Skyline-daily (Ver 20.2.1.286) durchgeführt. Insgesamt wurden 10 Peptide entsprechend 3 Proteinen überwacht. Dazu gehörten 3 Peptide...

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Quantitative Proteomics Workflow using Multiple Reaction Monitoring Based Detection of Proteins from Human Brain Tissue

Das Protokoll zielt darauf ab, die Verwendung eines Dreifach-Quadrupol-Massenspektrometers für die Mehrfachreaktionsüberwachung (MRM) von Proteinen aus klinischen Proben einzuführen. Wir haben einen systematischen Workflow von der Probenvorbereitung bis zur Datenanalyse für klinische Proben mit allen notwendigen Vorsichtsmaßnahmen bereitgestellt.

Quantitativer Proteomik-Workflow mit multipler Reaktionsüberwachung basierender Detektion von Proteinen aus menschlichem Hirngewebe

The proteomic analysis of the human brain tissue over the last decade has greatly enhanced our understanding of the brain. However, brain related ...

Gezielte proteomische Ansätze werden schnell zur Methode der Wahl für die Validierung von Proteinen aus kurzfristigen Proteomik-basierten Experimenten oder aus molekularbiologischen Experimenten. Die Überwachung mehrerer Reaktionen ist ein solcher gezielter Ansatz, der zunehmend zum Nachweis und zur Quantifizierung von Proteinen aus biologischen Proben eingesetzt wird. In dieser Studie haben wir die verschiedenen Schritte zum Nachweis und zur Quantifizierung von Proteinen aus menschlichem Hirngewebe durchlaufen, um die Leser in die grundlegenden Anforderungen eines MRM-Experiments einzuführen.Wiegen Sie etwa 50 mg Hirngewebe und waschen Sie das Gewebe mit 300 Mikrolitern 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung. Dieser Schritt wird durchgeführt, um Blut auf der äußeren Oberfläche des Gewebes zu entfernen, und daher ist es ratsam, so viel Blut wie möglich zu entfernen. Nach dem Waschen mit PBS 300 Mikroliter Lysepuffer in das Röhrchen geben, das das Gewebe enthält.Lyse das Gewebe mit einem Sondenschallator, während sie den Schlauch auf einem Eisbad halten. Fahren Sie mit der Gewebehomogenisierung mit einem Perlenschläger fort, um das Gewebe vollständig zu lysieren. Zentrifugieren Sie den Inhalt des Röhrchens bei 6000 g für 15 Minuten bei vier Grad Celsius.Den Überstand in ein frisches Röhrchen geben und homogen mischen. Nehmen Sie ein kleines Aliquot des Überstands und quantifizieren Sie den Proteingehalt mit einem Standardproteinassay. Hier zeigen wir ein Beispiel für die Proteinschätzung mit Bradford Assay.Nehmen Sie 50 Mikrogramm Protein in einem Mikrozentrifugenröhrchen und reduzieren Sie den Inhalt durch Zugabe von TCEP, so dass die Endkonzentration 20 Millimolar beträgt. Inkubieren Sie den Inhalt bei 37 Grad für eine Stunde. Nach der Inkubation alkylieren Sie die reduzierten Proteine durch Zugabe von Jodoacetamid in das Röhrchen, so dass die Endkonzentration 40 Millimolar beträgt.Inkubieren Sie die Tube 30 Minuten lang im Dunkeln. Fügen Sie nun Puffer B zu dem Röhrchen hinzu, das die reduzierten und alkylierten Proteine enthält, so dass die Endkonzentration von Harnstoff weniger als einen Molar beträgt. Fügen Sie Trypsin in 1 bis 30 Enzym-protein-Verhältnis hinzu und inkubieren Sie die Röhrchen über Nacht bei 37 Grad unter ständigem Schütteln.Nach der Verdauung die verdauten Peptide in einem Vakuumkonzentrator konzentrieren. In diesem Schritt können die Peptide entweder rekonstituiert und entsalzt oder bei minus 80 für die zukünftige Verwendung gespeichert werden. Die Entsalzung oder Peptidreinigung ist vor dem Laden der Proben auf eine LC-MS MS unerlässlich. Salze und andere Verunreinigungen in der Probe können die Säule verstopfen und die Empfindlichkeit des Instruments auf lange Sicht beeinträchtigen.Dieser Vorgang kann mit handelsüblichen C18 STAGE-Spitzen oder -Säulen durchgeführt werden. Hier haben wir den Workflow für die Peptidentsalzung mit einer C18 STAGE Spitze dargestellt. Nach dem Entsalzen trocknen Sie die Peptide in einem Vakuumkonzentrator.Rekonstituieren Sie diese sauberen Peptide und fahren Sie mit der Scopes-Methode zur Quantifizierung fort. Laden Sie dazu zwei Mikroliter der Probe in eine Mikrotropfenplatte und berechnen Sie die Konzentration wie im Objektträger gezeigt. Die Vorbereitung der Übergangsliste ist ein entscheidender Schritt in einem SRM- oder MRM-Experiment.Eine Übergangsliste enthält alle Informationen, die das Massenspektrometer benötigt, um den Übergang zu überwachen. Dazu gehören die m x z-Werte der Vorläufer- und Produktionen, die Kollisionsenergie des Übergangs, die Polarität des Instruments und der Zeitbereich für die Datenerfassung. Bereiten Sie die Übergangsliste mit Skyline vor.Bereiten Sie ein Hintergrundproteom mit der Human Proteome Fasta-Datei von UniProt vor und stellen Sie sicher, dass es auf der Registerkarte Hintergrund der Peptideinstellungen ausgewählt ist. Legen Sie auf der Registerkarte Filter eine Mindestlänge von 8 und eine maximale Länge von 25 fest. Verwenden Sie weiterhin die Standardeinstellungen, wenn keine anderen Änderungen an den Peptiden vorgenommen werden.Sobald die Peptideinstellungen vorgenommen wurden, klicken Sie auf Übergangseinstellungen. Legen Sie auf der Registerkarte Filter die Vorproduktgebühren auf 2 und 3 fest. Legen Sie Ionenladungen auf 1 und Ionentypen auf y fest.Produktionen können je nach Wahl des Benutzers ausgewählt werden. Lassen Sie alle Parameter als Standard. Fügen Sie nun die Beitritts-IDs der ausgewählten Zielproteine ein.Dies kann durch Klicken auf die Registerkarte Bearbeiten, dann einfügen und schließlich die Beitritts-IDs einfügen. Die IDs werden den Proteinen im Hintergrundproteom zugeordnet und eine Übergangsliste basierend auf den zuvor festgelegten Peptid- und Übergangseinstellungen erstellt. Exportieren Sie diese Übergangsliste.Stellen Sie sicher, dass das richtige Instrument ausgewählt ist, indem Sie auf die Dropdown-Option Gerätetyp klicken. In diesem Fall ist das Instrument Thermo Altis. Da die undefinierte Übergangsliste zu viele Übergänge enthält, sollten Sie ein Limit von nur 350 Übergängen pro Liste beibehalten und als mehrere Methoden exportieren.Es wird ein binäres Lösungsmittelsystem verwendet. Lösungsmittel A ist 1% FA und Lösungsmittel B ist 80% ACN. Halten Sie die Durchflussrate bei 450 Mikroliter pro Minute und den Gradienten wie gezeigt.Stellen Sie die Temperatur des Säulenfachs auf 45 Grad Celsius ein. Weitere Informationen zu Spalte und LC-System finden Sie im Text. Stellen Sie sicher, dass die MS-Einstellungen in Ihrem TSQ Altis wie hier gezeigt sind.Importieren Sie eine einzelne Übergangsliste, um eine neue Methode zu erstellen. Wir empfehlen, die Auflösung für Quadrupol 1 und Quadrupol 3 bei 7 zu fassen. Diese können bei Bedarf weiter optimiert werden.Um die Konsistenz der Läufe und damit die Datenqualität zu gewährleisten, bereiten Sie Ihre Ausführungssequenz wie gezeigt vor. Beginnen Sie mit ein paar Leerzeichen, beziehen Sie sich auf den Text für die Zusammensetzung der Leerenmischung, gefolgt von einem QC-Standardlicht BSA mit bekannter Konzentration, um jede Variation der tagesweisen Reaktion des Instruments zu überwachen. Die QC sollte kurz vor den Proben erfolgen.Als nächstes reihen Sie alle Samples mit Leerzeichen dazwischen an. Injizieren Sie gleiche Mengen jeder Probe, wobei 25 bis 1 Nanogramm Peptide pro Injektion berücksichtigt werden. Um eine verfeinerte Methode zu erstellen, führen Sie zuerst die undefinierten Methoden für ganze Stichproben aus.Importieren Sie die Ergebnisse in Skyline und überprüfen Sie jedes Peptid manuell. Wählen Sie für jedes Peptid einen Vorläufer aus, der in allen Proben konstant gute Peaks aufzeigt. Löschen Sie Vorläufer und Peptide, die keine guten Spitzen zeigen.Stellen Sie sicher, dass alle Spitzen ordnungsgemäß mit Anmerkungen versehen sind. Um den richtigen Peak auszuwählen und die Übergänge unter jedem Precursor weiter zu verfeinern, kann eine Bibliothek verwendet werden. Eine Bibliothek ist ein Satz von MS-MS-Spektraldaten, die mit Peptiden und Übergängen der aktuellen experimentellen Daten abgeglichen werden.Wählen Sie Spitzen aus, deren DART P-Werte näher an 1 liegen, und entfernen Sie Übergänge, die nicht mit der Bibliothek übereinstimmen. Ein DART P-Wert gibt an, wie gut die Übereinstimmung zwischen dem experimentellen Peak und dem Library Peak ist. Nach ein oder zwei Optimierungsrunden steht eine verfeinerte Liste bereit.Diese verfeinerte Liste kann für einzelne Proben ausgeführt werden. Importieren Sie die verfeinerten Läufe in Skyline und kommentieren Sie Peaks richtig. Verwenden Sie die Registerkarte Anmerkung unter Dokumenteinstellungen, um jedes Beispiel im Dokumentraster sorgfältig zu kommentieren.Verwenden Sie die Gruppenvergleichsfunktion, um Vergleiche zwischen Bedingung 1 und Bedingung 2 des Experiments zu erstellen. Dadurch erhalten Sie eine Tabelle mit angepassten P-Werten und Faltenänderungswerte zwischen den beiden Gruppen. Unseres Wissens ist dies die erste Studie, die die Verwendung von MRM verwendet, um Peptide für die Proteine Apolipoprotein A-1, Vimentin und Nicotinamid-Phosphoribosyltransferase in menschlichen Hirngewebeproben nachzuweisen.Die Optimierung verschiedener Parameter wie LC-Gradient, Verweilzeit, Zykluszeit und Kollisionsenergie kann den Erfolg eines MRM-Experiments stark beeinflussen. Wir glauben, dass diese Technik verwendet werden kann, um Muster von Biomarkern zu entwickeln, die in der Lage sind, zwischen verschiedenen klinischen Zuständen und Krankheiten zu unterscheiden.

Research

JoVE Journal

Biology

A Chromatin Assay for Human Brain Tissue

A Chromatin-Assay für Human Brain Tissue

Chronic neuropsychiatric illnesses such as schizophrenia, bipolar disease and autism are thought to result from a combination of genetic and environmental ...

Forschung

Biologie

Neuronal Nuclei Isolation from Human Postmortem Brain Tissue

Neuronale Kerne Isolation von Human Postmortem Gehirngewebe

Neurons in the human brain become postmitotic largely during prenatal development, and thus maintain their nuclei throughout the full lifespan. However, ...

Monitoring Acupuncture Effects on Human Brain by fMRI

Überwachung Akupunktur Effects on Human Brain von fMRI

Functional MRI is used to study the effects of acupuncture on the BOLD response and the functional connectivity of the human brain.  Results demonstrate ...

Identification of protein complexes with quantitative proteomics in S. cerevisiae

Identifizierung von Protein-Komplexen mit der quantitativen Proteomik in S. cerevisiae

Lipids are the building blocks of cellular membranes that function as barriers and in compartmentalization of cellular processes, and recently, as ...

Obtaining High Quality RNA from Single Cell Populations in Human Postmortem Brain Tissue

Beziehen High Quality-RNA aus Einzel-Zellpopulationen in menschlichen Postmortem Gehirngewebe

We proposed to investigate the gray matter reduction in the superior temporal gyrus seen in schizophrenia patients, by interrogating gene expression ...

High-throughput Crystallization of Membrane Proteins Using the Lipidic Bicelle Method

High-Throughput-Kristallisation von Membranproteinen mit dem Lipidische Bicellen Methode

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane ...

A Quantitative Fitness Analysis Workflow

A Quantitative Analysis Fitness-Workflow

Quantitative Fitness Analysis (QFA) is an experimental and computational workflow for comparing fitnesses of microbial cultures grown in parallel1,2,3,4. ...

Proteomic Sample Preparation from Formalin Fixed and Paraffin Embedded Tissue

Proteomik Probenvorbereitung von Formalin fixiert und in Paraffin eingebetteten Gewebe

Preserved clinical material is a unique source for proteomic investigation of human disorders. Here we describe an optimized protocol allowing large scale ...

Identification of Protein Interaction Partners in Mammalian Cells Using SILAC-immunoprecipitation Quantitative Proteomics

Identifizierung von Protein-Interaktionspartner in Säugetierzellen mit SILAC-Immunpräzipitation Quantitative Proteomics

Quantitative proteomics combined with immuno-affinity purification, SILAC immunoprecipitation, represent a powerful means for the discovery of novel ...

Selected Reaction Monitoring Mass Spectrometry for Absolute Protein Quantification

Selected Reaction Monitoring-Massenspektrometrie für Absolute Proteinquantifizierung

Absolute quantification of target proteins within complex biological samples is critical to a wide range of research and clinical applications. This ...