Name: quantitative proteomics workflow using multiple reaction monitoring based detection of proteins from human brain tissue
Uploaded: 2021-08-28T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Proteomics Workflow using Multiple Reaction Monitoring Based Detection of Proteins from Human Brain Tissue at JoVE.com

אנו מכירים בפרויקט MHRD-UAY (UCHHATAR AVISHKAR YOJANA), פרויקט #34_IITB למתקן SS ו- MASSFIITB ב- IIT בומביי הנתמך על ידי המחלקה לביוטכנולוגיה (BT / PR13114/ INF / 22/206/2015) לביצוע כל הניסויים הקשורים ל- MS.
אנו מודים למר רשאב ידב על עשייתו ועריכה של הסרטון כולו ולמר נישנט נרוקר על עבודתו בעריכת האודיו.

מחקר זה כולל דגימות רקמת מוח ממשתתפים אנושיים, שנבדקו ואושרו על ידי TMH ו- IITB IEC - (IITB-IEC/2018/019). המשתתפים סיפקו את הסכמתם מדעת ובכתב להשתתף במחקר זה.
1 מיצוי חלבון מרקמת המוח
<ol><li>שקול סביב 50 מ"ג של רקמת המוח לשטוף את הרקמה עם 300 μL של 1x תמיסת מלח פוספט (PBS) באמצעות micropipette. הערה: שלב ז?...

<ol>
	<li>Picotti, P., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selected+reaction+monitoring-based+proteomics:+Workflows,+potential,+pitfalls+and+future+directions.">Selected reaction monitoring-based proteomics: Workflows, potential, pitfalls and future directions.</a> Nature Methods. , (2012).</li><li>Carr, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+peptide+measurements+in+biology+and+medicine:+Best+practices+for+mass+spectrometry-based+assay+development+using+a+fit-for-purpose+approach.">Targeted peptide measurements in biology and medicine: Best practices for mass spectrometry-based assay development using a fit-for-purpose approach.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 13 (3), 907-917 (2014).</li><li>Pitt, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+and+applications+of+liquid+chromatography-mass+spectrometry+in+clinical+biochemistry.">Principles and applications of liquid chromatography-mass spectrometry in clinical biochemistry.</a> The Clinical biochemist Reviews. 30 (1), 19-34 (2009).</li><li>Hosp, F., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Primer+on+Concepts+and+Applications+of+Proteomics+in+Neuroscience.">A Primer on Concepts and Applications of Proteomics in Neuroscience.</a> Neuron. 96 (3), 558-571 (2017).</li><li>Scopes, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+protein+by+spectrophotometry+at+205+nm.">Measurement of protein by spectrophotometry at 205 nm.</a> Analytical Biochemistry. , (1974).</li><li>Kusebauch, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+SRMAtlas:+A+Resource+of+Targeted+Assays+to+Quantify+the+Complete+Human+Proteome.">Human SRMAtlas: A Resource of Targeted Assays to Quantify the Complete Human Proteome.</a> Cell. , (2016).</li><li>MacLean, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skyline:+an+open+source+document+editor+for+creating+and+analyzing+targeted+proteomics+experiments.">Skyline: an open source document editor for creating and analyzing targeted proteomics experiments.</a> Bioinformatics. 26 (7), 966-968 (2010).</li><li>Gerber, S. A., Rush, J., Stemman, O., Kirschner, M. W., Gygi, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absolute+quantification+of+proteins+and+phosphoproteins+from+cell+lysates+by+tandem+MS.">Absolute quantification of proteins and phosphoproteins from cell lysates by tandem MS.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2003).</li><li>Escher, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+iRT,+a+normalized+retention+time+for+more+targeted+measurement+of+peptides.">Using iRT, a normalized retention time for more targeted measurement of peptides.</a> Proteomics. , (2012).</li><li>Gillette, M. A., Carr, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+peptides+and+proteins+in+biomedicine+by+targeted+mass+spectrometry.">Quantitative analysis of peptides and proteins in biomedicine by targeted mass spectrometry.</a> Nature Methods. 10 (1), 28-34 (2013).</li><li>Whiteaker, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+targeted+proteomics-based+pipeline+for+verification+of+biomarkers+in+plasma.">A targeted proteomics-based pipeline for verification of biomarkers in plasma.</a> Nature Biotechnology. , (2011).</li><li>H&#252;ttenhain, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproducible+quantification+of+cancer-associated+proteins+in+body+fluids+using+targeted+proteomics.">Reproducible quantification of cancer-associated proteins in body fluids using targeted proteomics.</a> Science Translational Medicine. 4 (142), 94 (2012).</li><li>Mermelekas, G., Vlahou, A., Zoidakis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SRM/MRM+targeted+proteomics+as+a+tool+for+biomarker+validation+and+absolute+quantification+in+human+urine.">SRM/MRM targeted proteomics as a tool for biomarker validation and absolute quantification in human urine.</a> Expert Review of Molecular Diagnostics. 15 (11), 1441-1454 (2015).</li><li>Koldamova, R. P., Lefterov, I. M., Lefterova, M. I., Lazo, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apolipoprotein+A-I+directly+interacts+with+amyloid+precursor+protein+and+inhibits+A&#946;+aggregation+and+toxicity.">Apolipoprotein A-I directly interacts with amyloid precursor protein and inhibits A&#946; aggregation and toxicity.</a> Biochemistry. , (2001).</li><li>Jiang, S. X., Slinn, J., Aylsworth, A., Hou, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vimentin+participates+in+microglia+activation+and+neurotoxicity+in+cerebral+ischemia.">Vimentin participates in microglia activation and neurotoxicity in cerebral ischemia.</a> Journal of Neurochemistry. , (2012).</li><li>Liu, L. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nicotinamide+Phosphoribosyltransferase+May+Be+Involved+in+Age-Related+Brain+Diseases.">Nicotinamide Phosphoribosyltransferase May Be Involved in Age-Related Brain Diseases.</a> PLoS ONE. , (2012).</li><li>Abbatiello, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+guidelines+for+publication+of+manuscripts+describing+development+and+application+of+targeted+mass+spectrometry+measurements+of+peptides+and+proteins.">New guidelines for publication of manuscripts describing development and application of targeted mass spectrometry measurements of peptides and proteins.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 16 (3), 327-328 (2017).</li></ol>

טכניקות כמו אימונוהיסטוכימיה וכתמים מערביים נחשבו לסטנדרטים של זהב לאימות מטרות חלבון במשך שנים רבות. שיטות אלה מוצאות שימוש גם היום עם שינויים קלים בפרוטוקול ותלות מועטה בטכנולוגיה מה שהופך אותם מסורבלים ומייגע מאוד. מלבד זאת, הם כוללים גם שימוש בנוגדנים יקרים אשר לא תמיד מראים את אותה ...

במהלך העשור האחרון, התפתחויות מהירות בספקטרומטריית מסה (MS) יחד עם הבנה מוגברת של טכניקות כרומטוגרפיה עזרו מאוד בקידום פרוטאומיקה מבוססת טרה-ס. טכניקות מבוססות ביולוגיה מולקולרית כגון סופגות מערביות ואימונוהיסטוכימיה סבלו זה מכבר מבעיות רבייה, זמן תפנית איטי, שונות בין-משקיפה וחוסר יכולתם לכמת במדויק חלבונים, אם להזכיר כמה. לכך, הרגישות המעולה של גישות פרוטאומיות בעלות תפוקה גבוהה ממשיכה להציע לביולוגים מולקולריים כלי חלופי ואמין יותר במסעם להבין טוב יותר את תפקידי החלבונים בתאים. עם זאת, גישות פרוטאומיות רובה ציד (רכישה תלויה נתונים או DDA) לעתים קרובות לא מצליחים לזהות חלבונים בשפע נמוך ברקמות מורכבות מלבד להיות תלוי בכבדות על הרגישות והרזולוציה של המכשיר. במהלך השנים האחרונות, מעבדות ברחבי העולם פיתחו טכניקות כמו רכישה עצמאית של נתונים (DIA) הדורשות כוח מחשוב מוגבר ותוכנות אמינות שיכולות להתמודד עם ערכות נתונים מורכבות אלה. עם זאת, טכניקות אלה הן עדיין עבודה בתהליך ולא מאוד ידידותי למשתמש. גישות פרוטאומיות ממוקדות המבוססות על טרשתות שניה מספקות איזון מושלם בין אופי התפוקה הגבוה של גישות טרשת-בתים לבין הרגישות של גישות ביולוגיה מולקולרית כמו ELISA. ניסוי פרוטאומיקס מבוסס ספקטרומטריית מסה ממוקד מתמקד בזיהוי חלבונים מונעי השערה או פפטידים מניסויי פרוטאומיה מבוססי גילוי או באמצעות ספרות זמינה1,2. ניטור תגובה מרובה (MRM) היא גישה ממוקדת של טרשת נפוצה המשתמשת בספקטרומטר מסה מרובע דו-מושבי לגילוי וכימות מדויקים של חלבונים/פפטידים מדגימות מורכבות. הטכניקה מציעה רגישות וספציפיות גבוהות יותר למרות שהיא דורשת שימוש במכשיר ברזולוציה נמוכה.
ריבוע עשוי מ-4 מוטות מקבילים, כאשר כל מוט מחובר למוט הנגדי באלכסון. שדה משתנה נוצר בין מוטות quadrupole על ידי החלת מתחי RF ו- DC לסירוגין. מסלול היונים בתוך הקוואדרופול מושפע מנוכחותם של אותם מתחים על פני מוטות מנוגדים. על ידי החלת RF על מתח DC, המסלול של היונים ניתן לייצב. זהו מאפיין זה של quadrupole המאפשר לו לשמש כמסנן מסה אשר יכול באופן סלקטיבי לתת יונים ספציפיים לעבור. בהתאם לצורך, ניתן להפעיל ריבוע במצב הסטטי או במצב הסריקה. המצב הסטטי מאפשר רק יונים עם m/z שצוין לעבור, מה שהופך את המצב סלקטיבי מאוד ספציפי ליון של עניין. מצב הסריקה לעומת זאת מאפשר ליונים לאורך כל טווח m/z לעבור. לכן, ספקטרומטר מסה מרובע דו-מושבי יכול לפעול בארבע דרכים אפשריות: i) הרביעייה הראשונה הפועלת במצב סטטי בעוד השני פועל במצב סריקה; ii) הרביעייה הראשונה הפועלת במצב הסריקה בזמן שהשנייה פועלת במצב סטטי; iii) שני הרביעייה הפועלת במצב הסריקה; ו- iv) שני הרביעייה הפועלים במצבסטטי 3. בניסוי MRM טיפוסי, שני הרביעייה פועלים במצב סטטי ומאפשרים למבשרים ספציפיים והמוצרים המתקבלים שלהם לאחר הפיצול להיות במעקב. זה הופך את הטכניקה למאוד רגישה וסלקטיבית ומאפשרת כימות מדויק.
עבור ביולוגים מולקולריים, רקמת המוח האנושית ותאיה הם אוצר בלום. יחידות מדהימות אלה של איבר מעניין מתמיד של גוף האדם יכולות לספק תובנות מולקולריות ותאיות על תפקודו. חקירות פרוטאומיות של רקמת המוח יכולות לא רק לעזור לנו להבין את התפקוד המערכתי של מוח בריא, אלא גם את המסלולים התאיים כי לקבל dysregulated כאשר נגרם על ידי מחלה כלשהי4. עם זאת, רקמת המוח עם כל ההטרוגניות שלה היא איבר מורכב מאוד לנתח ודורש גישה מתואמת להבנה טובה יותר של השינויים ברמה המולקולרית. העבודה הבאה מתארת את כל זרימת העבודה החל החל חילוץ חלבונים מרקמת המוח, יצירת ומיטוב השיטות לבדיקת MRM, לאימות המטרות (איור 1). כאן, הדגשנו באופן שיטתי את הצעדים העיקריים הכרוכים בניסוי מוצלח המבוסס על MRM באמצעות רקמת מוח אנושית במטרה להציג את הטכניקה ואת האתגרים שלה לקהילת מחקר רחבה יותר.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile (MS grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A/0620/21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>TC194-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Fischer Scienific</td>
			<td>BP510-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid (MS grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>147930250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1149-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol (MS grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Q13827</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Fischer Scienific</td>
			<td>BP214-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol (MS grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A456-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS grade water</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>51140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>TL1006-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Roche Diagnostics</td>
			<td>11873580001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>DF6D661300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCEP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>646547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Merck</td>
			<td>648310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin (MS grade)</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>90058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Merck</td>
			<td>MB1D691237</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Supplies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypersil Gold C18 column</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>25002-102130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipettes</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F167380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stage tips</td>
			<td>MilliPore</td>
			<td>ZTC18M008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zirconia/Silica beads</td>
			<td>BioSpec products</td>
			<td>11079110z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bead beater (Homogeniser)</td>
			<td>Bertin Minilys</td>
			<td>P000673-MLYS0-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader (spectrophotometer)</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>MultiSkan Go</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td>Eutech</td>
			<td>CyberScan pH 510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Probe Sonicator</td>
			<td>Sonics Materials, Inc</td>
			<td>VCX 130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking Drybath</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>88880028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TSQ Altis mass spectrometer</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>TSQ02-10002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>uHPLC - Vanquish</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>VQF01-20001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum concentrator</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>Savant ISS 110</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative proteomics workflow using multiple reaction monitoring based detection of proteins from human brain tissue

הניתוח הפרוטאומי של רקמת המוח האנושית בעשור האחרון שיפר מאוד את הבנתנו את המוח. עם זאת, הפרעות הקשורות למוח ממשיכות להיות התורם העיקרי של מקרי מוות ברחבי העולם, המחייב את הצורך בהבנה גדולה עוד יותר של הפתוביולוגיה שלהם. טכניקות מסורתיות המבוססות על נוגדנים כמו סופג מערבי או אימונוהיסטוכימיה סובלות מלהיות תפוקה נמוכה מלבד היותן עתירות עבודה ואיכותיות או חצי כמותיות. אפילו גישות רובה ציד מבוססות ספקטרומטריית מסה קונבנציונליות אינן מספקות ראיות חותכות התומכות בהשערה מסוימת. גישות פרוטאומיות ממוקדות מונעות במידה רבה בהשערות שונות מגישות הפרוטאומיות הקונבנציונליות של רובה הציד שנמצאות בשימוש זמן רב. ניטור תגובה מרובה הוא גישה ממוקדת אחת כזו הדורשת שימוש בספקטרומטר מסה מיוחד הנקרא ספקטרומטר מסה מרובע דו-מושבי או ספקטרומטר מסה מרובע משולש. במחקר הנוכחי, הדגשנו באופן שיטתי את הצעדים העיקריים הכרוכים בביצוע זרימת עבודה מוצלחת של פרוטאומיקה של מסה דו-מושבית המבוססת על ספקטרומטריה באמצעות רקמת מוח אנושית במטרה להציג זרימת עבודה זו לקהילת מחקר רחבה יותר.

ביצענו כימות יחסי של 3 חלבונים מ-10 דגימות, 5 דגימות מכל קבוצה של חולים עם חריגות במוח. חלבונים אלה כללו Apolipoprotein A-I (APOA-I), Vimentin (VIM) ו Nicotinamide זרחן זרחן (NAMPT) אשר ידועים לבצע תפקידים מגוונים בתאי המוח. ניתוח לאחר הריצה של הנתונים בוצע באמצעות Skyline-daily (Ver 20.2.1.286). בסך הכל 10 פפטידים המתאימים ל -3 חלבונים ה...

Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Proteomics Workflow using Multiple Reaction Monitoring Based Detection of Proteins from Human Brain Tissue at JoVE.com

Quantitative Proteomics Workflow using Multiple Reaction Monitoring Based Detection of Proteins from Human Brain Tissue

הפרוטוקול נועד להציג את השימוש בספקטרומטר מסה מרובע משולש לניטור תגובה מרובה (MRM) של חלבונים מדגימות קליניות. סיפקנו זרימת עבודה שיטתית החל מהכנת מדגם לניתוח נתונים עבור דגימות קליניות עם כל אמצעי הזהירות הדרושים שיש לנקוט.

זרימת עבודה של פרוטאומיה כמותית באמצעות זיהוי מבוסס ניטור תגובה מרובה של חלבונים מרקמת המוח האנושית

The proteomic analysis of the human brain tissue over the last decade has greatly enhanced our understanding of the brain. However, brain related ...

גישות פרוטאומיות ממוקדות הופכות במהירות לשיטת הבחירה לאימות חלבונים מניסויים מבוססי פרוטאומיה לטווח קצר או מניסויים מבוססי ביולוגיה מולקולרית. ניטור תגובה מרובה הוא גישה ממוקדת אחת כזו אשר משמש יותר ויותר כדי לזהות ולכומת חלבונים מדגימות ביולוגיות. במחקר זה עברנו על השלבים השונים הכרוכים באיתור וכימות חלבונים מרקמת המוח האנושית מתוך כוונה להציג לקוראים את הדרישות הבסיסיות של ניסוי MRM.שקול סביב 50 מ"ג של רקמת המוח, ולשטוף את הרקמה עם 300 microliters של תמיסת מלח פוספט 1x חוצץ. שלב זה מבוצע כדי להסיר כל דם על פני השטח החיצוניים של הרקמה, ולכן מומלץ להסיר דם רב ככל האפשר. לאחר שטיפות עם PBS, להוסיף 300 microliters של חוצץ תמוז לצינור המכיל את הרקמה.ללקק את הרקמה באמצעות sonicator בדיקה תוך שמירה על הצינור על אמבט קרח. המשך עם הומוגניזציה רקמות באמצעות מקצף חרוזים כדי לגמרי לייס את הרקמה. צנטריפוגות את התוכן של הצינור ב 6000 גרם במשך 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס.מעבירים את הסופר-נט לצינור טרי ומערבבים בצורה הומוגנית. קחו אליקוט קטן של הסופר-נט, וכימתו את תכולת החלבון באמצעות מבחון חלבון סטנדרטי. כאן אנו מראים דוגמה להערכת חלבונים באמצעות ברדפורד אסאי.קח 50 מיקרוגרם של חלבון בצינור microcentrifuge ולהפחית את התוכן על ידי הוספת TCEP כך הריכוז הסופי הוא 20 מילימולר. לדגור על התוכן ב 37 מעלות במשך שעה אחת. לאחר הדגירה, alkylate חלבונים מופחתים על ידי הוספת iodoacetamide לצינור, כך הריכוז הסופי הוא 40 מילימולר.לדגור על הצינור בחושך במשך 30 דקות. עכשיו להוסיף Buffer B לצינור הכיל חלבונים מופחתים אלקילאטים, כך הריכוז הסופי של אוריאה הוא פחות טוחנת אחת. הוסיפו טריפסין ב-1 עד ליחס של 30 אנזימים לחלבון ודגרו את הצינורות למשך הלילה ב-37 מעלות עם רעידות בלתי פוסקות.לאחר העיכול, לרכז את הפפטידים מעוכלים ברכז ואקום. בשלב זה, הפפטידים יכולים להיות משוחזרים ומותפלים או מאוחסנים במינוס 80 לשימוש עתידי. התפלה, או ניקוי פפטיד, חיוני לפני טעינת הדגימות על כל LC-MS MS. מלחים ומזהמים אחרים במדגם יכולים לסתום את העמודה ולהשפיע על הרגישות של המכשיר בטווח הארוך.ניתן לבצע תהליך זה באמצעות עצות או עמודות C18 STAGE הזמינות מסחרית. כאן תיארנו את זרימת העבודה להתפלת פפטיד באמצעות טיפ C18 STAGE. לאחר התפלה, יבשו את הפפטידים ברכז ואקום.תרכיב מחדש פפטידים נקיים אלה והמשיך לכימות בשיטת Scopes. בשביל זה, לטעון שני microliters של המדגם בצלחת microdrop ולחשב את הריכוז כפי שמוצג בשקופית. הכנת רשימת מעבר היא שלב מכריע בניסוי SRM או MRM.רשימת מעבר מכילה את כל המידע הנדרש על-ידי ספקטרומטר המסה כדי לפקח על המעבר. זה כולל את ערכי m על ידי z של המבשר ויוני המוצר, אנרגיית התנגשות של המעבר, הקוטביות של המכשיר וטווח הזמן לרכישת נתונים. הכן את רשימת המעבר באמצעות קו הרקיע.הכן פרוטאום רקע באמצעות קובץ Human Proteome Fasta מ- UniProt וודא שהוא נבחר תחת הכרטיסיה רקע של הגדרות פפטיד. בכרטיסיה סינון, הגדר אורך מינימלי של 8 ואורך מרבי של 25. המשך להשתמש בהגדרות ברירת המחדל אם אין שינויים אחרים בפפטידים.לאחר שהגדרות הפפטיד נוצרו, לחץ על הגדרות מעבר. תחת הכרטיסיה סינון, הגדר חיובים קודמים כ- 2 ו- 3. הגדר את חיובי Ion כ- 1 והגדר סוגי יונים כ- y.ניתן לבחור יונים של מוצרים בהתאם לבחירת המשתמש. השאר את כל הפרמטרים כברירת מחדל. כעת הכנס את מזהי הגישה של חלבוני היעד שנבחרו.ניתן לעשות זאת על-ידי לחיצה על הכרטיסיה עריכה ולאחר מכן בחירה באפשרות הוספה והדבקה סופית של מזהי הגישה. מזהים יפופו לחלבונים שבפרקע ורשימת מעבר שנוצרה בהתבסס על הגדרות הפפטיד והמעבר שנקבעו קודם לכן. יצא רשימת מעבר זו.ודא שהכלי הנכון נבחר על-ידי לחיצה על האפשרות הנפתחת סוג כלי. במקרה זה, המכשיר הוא תרמו אלטיס. מאחר שרשימת המעברים הלא מוגדרת כוללת מעברים רבים מדי, שמור על מגבלה של 350 מעברים בלבד לכל רשימה וייצוא כשיטות מרובות.נעשה שימוש במערכת ממס בינארית. ממס A הוא 1%FA וממס B הוא 80%ACN. שמור על קצב הזרימה על 450 מיקרוליטר לדקה ואת מעבר הצבע כפי שמוצג.הגדר טמפרטורת תא עמודה ב 45 מעלות צלזיוס. לקבלת פרטים נוספים אודות מערכת עמודות ו- LC, עיין בטקסט. ודא שהגדרות MS ב- TSQ Altis שלך כפי שמוצג כאן.יבא רשימת מעבר בודדת כדי ליצור שיטה חדשה. אנו מציעים לשמור על הרזולוציה לרביעייה 1 ורביעייה 3 ב-7. אלה יכולים להיות ממוטבים עוד יותר במידת הצורך.כדי להבטיח עקביות בריצות וכתוצאה מכך את איכות הנתונים, הכן את רצף הריצה שלך כפי שמוצג. התחל עם כמה ריקים, עיין בטקסט להרכב של תערובת ריקה, ואחריו BSA אור סטנדרטי QC של ריכוז ידוע כדי לפקח על כל וריאציה בתגובה היומית של המכשיר. QC עשה צריך להיות ממש לפני הדגימות.הבא בשורה את כל הדגימות עם כדורי סרק באמצע. הזרקת נפחים שווים של כל מדגם, חשבונאות 25 עד 1 ננוגרם של פפטידים לכל זריקה. כדי ליצור שיטה מעודנת, הפעל תחילה את השיטות הלא מוגדרות נגד דגימות שלמות.יש לייבא תוצאות לתוך סקייליין ולבדוק ידנית כל פפטיד. עבור כל פפטיד, בחר הקדמה אחת המציגה פסגות טובות בעקביות בכל הדגימות. מחק מבשרי פפטידים שאינם מציגים פסגות טובות.ודא שכל הפסגות מובאות כראוי. כדי לבחור את הפסגה הנכונה ולמקד עוד יותר את המעברים תחת כל מבשר, ניתן להשתמש בספריה. ספריה היא קבוצה של נתונים ספקטרליים של MS-MS המותאמים לפפטידים ומעברים של הנתונים הניסיוניים הנוכחיים.בחר פסגות שערכי DART P קרובים יותר ל- 1 והסר מעברים שאינם תואמים לספריה. ערך DART P מציין עד כמה ההתאמה טובה בין השיא הניסיוני לשיא הספריה. לאחר סבב מיטוב אחד או שניים, רשימה מעודנת תהיה מוכנה.ניתן להפעיל רשימה מעודנת זו עבור דוגמאות בודדות. יבא את הריצות המעודנות לקו הרקיע וביאורים פסגות כראוי. השתמש בכרטיסיה ביאור תחת הגדרות מסמך כדי לבאר כל דוגמה ברשת המסמך בקפידה.השתמש בתכונה 'השוואת קבוצה' כדי ליצור השוואות בין תנאי 1 למצב 2 של הניסוי שלך. פעולה זו תעניק טבלה עם ערכי P מותאמים ותקפל ערכי שינוי בין שתי הקבוצות. למיטב ידיעתנו, זהו המחקר הראשון המשתמש ב- MRM כדי לזהות פפטידים לחלבונים Apolipoprotein A-1, Vimentin, ו Nicotinamide זרחן זרחן בדגימות רקמת המוח האנושית.מיטוב פרמטרים שונים כגון שיפוע LC, זמן השתהות, זמן מחזור ואנרגיית התנגשות יכול להשפיע מאוד על ההצלחה של ניסוי MRM. אנו מאמינים כי טכניקה זו יכולה לשמש לפיתוח דפוסים של סמנים ביולוגיים עם יכולת להבחין בין תנאים קליניים שונים ומחלות.

Research

JoVE Journal

Biology

A Chromatin Assay for Human Brain Tissue

Assay הכרומטין של רקמת מוח האדם

Chronic neuropsychiatric illnesses such as schizophrenia, bipolar disease and autism are thought to result from a combination of genetic and environmental ...

Neuronal Nuclei Isolation from Human Postmortem Brain Tissue

גרעינים בידוד עצבי שלאחר המוות של רקמת מוח האדם

Neurons in the human brain become postmitotic largely during prenatal development, and thus maintain their nuclei throughout the full lifespan. However, ...

Monitoring Acupuncture Effects on Human Brain by fMRI

דיקור ניטור השפעות על המוח האנושי על ידי fMRI

Functional MRI is used to study the effects of acupuncture on the BOLD response and the functional connectivity of the human brain.  Results demonstrate ...

Identification of protein complexes with quantitative proteomics in S. cerevisiae

זיהוי של קומפלקסים חלבונים עם proteomics כמותיים cerevisiae ס

Lipids are the building blocks of cellular membranes that function as barriers and in compartmentalization of cellular processes, and recently, as ...

Obtaining High Quality RNA from Single Cell Populations in Human Postmortem Brain Tissue

קבלת RNA איכות גבוהה מאוכלוסיות תא בודד בתוך רקמות המוח האנושי שלאחר המוות

We proposed to investigate the gray matter reduction in the superior temporal gyrus seen in schizophrenia patients, by interrogating gene expression ...

High-throughput Crystallization of Membrane Proteins Using the Lipidic Bicelle Method

תפוקה גבוהה התגבשות של חלבונים בממברנה שימוש בשיטה Lipidic Bicelle

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane ...

A Quantitative Fitness Analysis Workflow

כושר ניתוח כמותי של זרימת עבודה

Quantitative Fitness Analysis (QFA) is an experimental and computational workflow for comparing fitnesses of microbial cultures grown in parallel1,2,3,4. ...

Proteomic Sample Preparation from Formalin Fixed and Paraffin Embedded Tissue

לדוגמא הכנת proteomic מפורמלין קבועה ורקמות פרפין Embedded

Preserved clinical material is a unique source for proteomic investigation of human disorders. Here we describe an optimized protocol allowing large scale ...

Identification of Protein Interaction Partners in Mammalian Cells Using SILAC-immunoprecipitation Quantitative Proteomics

זיהוי של שותפי אינטראקציה חלבון בתאי יונקים באמצעות SILAC-immunoprecipitation פרוטאומיקה כמותי

Quantitative proteomics combined with immuno-affinity purification, SILAC immunoprecipitation, represent a powerful means for the discovery of novel ...

Selected Reaction Monitoring Mass Spectrometry for Absolute Protein Quantification

תגובה נבחרת ניטור ספקטרומטריית מסה לכימות חלבון מוחלט

Absolute quantification of target proteins within complex biological samples is critical to a wide range of research and clinical applications. This ...