Name: quantitative proteomics workflow using multiple reaction monitoring based detection of proteins from human brain tissue
Uploaded: 2021-08-28T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Proteomics Workflow using Multiple Reaction Monitoring Based Detection of Proteins from Human Brain Tissue at JoVE.com

हम एमएस से संबंधित सभी प्रयोगों को पूरा करने के लिए जैव प्रौद्योगिकी विभाग (बीटी/PR13114/INF/22/206/2015) द्वारा समर्थित आईआईटी बॉम्बे में एसएस और मासफिट्ब सुविधा के लिए #34_IITB एमएचआरडी-यूएवाई परियोजना (उछतर एविक योजना) को स्वीकार करते हैं ।
हम पूरे वीडियो को बनाने और संपादित करने के लिए श्री ऋषभ यादव और श्री निशांत नेरुरकर को ऑडियो के संपादन में उनके काम के लिए अपना विशेष धन्यवाद देते हैं ।

इस अध्ययन में मानव प्रतिभागियों से मस्तिष्क के ऊतकों के नमूने शामिल हैं, टीएमएच और आईआईटीबी आईईसी द्वारा समीक्षा और अनुमोदित -(IITB-IEC/2018/019) । प्रतिभागियों ने इस अध्ययन में भाग लेने के लिए अपनी सूचित और लिखि?...

<ol>
	<li>Picotti, P., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selected+reaction+monitoring-based+proteomics:+Workflows,+potential,+pitfalls+and+future+directions.">Selected reaction monitoring-based proteomics: Workflows, potential, pitfalls and future directions.</a> Nature Methods. , (2012).</li><li>Carr, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+peptide+measurements+in+biology+and+medicine:+Best+practices+for+mass+spectrometry-based+assay+development+using+a+fit-for-purpose+approach.">Targeted peptide measurements in biology and medicine: Best practices for mass spectrometry-based assay development using a fit-for-purpose approach.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 13 (3), 907-917 (2014).</li><li>Pitt, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+and+applications+of+liquid+chromatography-mass+spectrometry+in+clinical+biochemistry.">Principles and applications of liquid chromatography-mass spectrometry in clinical biochemistry.</a> The Clinical biochemist Reviews. 30 (1), 19-34 (2009).</li><li>Hosp, F., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Primer+on+Concepts+and+Applications+of+Proteomics+in+Neuroscience.">A Primer on Concepts and Applications of Proteomics in Neuroscience.</a> Neuron. 96 (3), 558-571 (2017).</li><li>Scopes, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+protein+by+spectrophotometry+at+205+nm.">Measurement of protein by spectrophotometry at 205 nm.</a> Analytical Biochemistry. , (1974).</li><li>Kusebauch, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+SRMAtlas:+A+Resource+of+Targeted+Assays+to+Quantify+the+Complete+Human+Proteome.">Human SRMAtlas: A Resource of Targeted Assays to Quantify the Complete Human Proteome.</a> Cell. , (2016).</li><li>MacLean, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skyline:+an+open+source+document+editor+for+creating+and+analyzing+targeted+proteomics+experiments.">Skyline: an open source document editor for creating and analyzing targeted proteomics experiments.</a> Bioinformatics. 26 (7), 966-968 (2010).</li><li>Gerber, S. A., Rush, J., Stemman, O., Kirschner, M. W., Gygi, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absolute+quantification+of+proteins+and+phosphoproteins+from+cell+lysates+by+tandem+MS.">Absolute quantification of proteins and phosphoproteins from cell lysates by tandem MS.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2003).</li><li>Escher, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+iRT,+a+normalized+retention+time+for+more+targeted+measurement+of+peptides.">Using iRT, a normalized retention time for more targeted measurement of peptides.</a> Proteomics. , (2012).</li><li>Gillette, M. A., Carr, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+peptides+and+proteins+in+biomedicine+by+targeted+mass+spectrometry.">Quantitative analysis of peptides and proteins in biomedicine by targeted mass spectrometry.</a> Nature Methods. 10 (1), 28-34 (2013).</li><li>Whiteaker, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+targeted+proteomics-based+pipeline+for+verification+of+biomarkers+in+plasma.">A targeted proteomics-based pipeline for verification of biomarkers in plasma.</a> Nature Biotechnology. , (2011).</li><li>H&#252;ttenhain, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproducible+quantification+of+cancer-associated+proteins+in+body+fluids+using+targeted+proteomics.">Reproducible quantification of cancer-associated proteins in body fluids using targeted proteomics.</a> Science Translational Medicine. 4 (142), 94 (2012).</li><li>Mermelekas, G., Vlahou, A., Zoidakis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SRM/MRM+targeted+proteomics+as+a+tool+for+biomarker+validation+and+absolute+quantification+in+human+urine.">SRM/MRM targeted proteomics as a tool for biomarker validation and absolute quantification in human urine.</a> Expert Review of Molecular Diagnostics. 15 (11), 1441-1454 (2015).</li><li>Koldamova, R. P., Lefterov, I. M., Lefterova, M. I., Lazo, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apolipoprotein+A-I+directly+interacts+with+amyloid+precursor+protein+and+inhibits+A&#946;+aggregation+and+toxicity.">Apolipoprotein A-I directly interacts with amyloid precursor protein and inhibits A&#946; aggregation and toxicity.</a> Biochemistry. , (2001).</li><li>Jiang, S. X., Slinn, J., Aylsworth, A., Hou, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vimentin+participates+in+microglia+activation+and+neurotoxicity+in+cerebral+ischemia.">Vimentin participates in microglia activation and neurotoxicity in cerebral ischemia.</a> Journal of Neurochemistry. , (2012).</li><li>Liu, L. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nicotinamide+Phosphoribosyltransferase+May+Be+Involved+in+Age-Related+Brain+Diseases.">Nicotinamide Phosphoribosyltransferase May Be Involved in Age-Related Brain Diseases.</a> PLoS ONE. , (2012).</li><li>Abbatiello, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+guidelines+for+publication+of+manuscripts+describing+development+and+application+of+targeted+mass+spectrometry+measurements+of+peptides+and+proteins.">New guidelines for publication of manuscripts describing development and application of targeted mass spectrometry measurements of peptides and proteins.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 16 (3), 327-328 (2017).</li></ol>

इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री और वेस्टर्न ब्लॉटिंग जैसी तकनीकों को कई वर्षों तक प्रोटीन लक्ष्यों के सत्यापन के लिए सोने के मानकों के रूप में माना जाता था। इन तरीकों प्रोटोकॉल में मामूली संशोधनों और प्रौ?...

पिछले दशक के दौरान, क्रोमेटोग्राफी तकनीकों की बढ़ती समझ के साथ-साथ बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस) में तेजी से विकास ने एमएस-आधारित प्रोटेओमिक्स की उन्नति में बहुत मदद की है। आणविक जीव विज्ञान आधारित तकनीकों जैसे पश्चिमी ब्लॉटिंग और इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री लंबे समय से प्रजनन के मुद्दों, धीमी गति से बदलाव के समय, अंतर-पर्यवेक्षक परिवर्तनशीलता और प्रोटीन को सही मात्रा में निर्धारित करने में उनकी असमर्थता से पीड़ित हैं, कुछ नाम हैं। इस उद्देश्य के लिए, उच्च थ्रूपुट प्रोटेओमिक्स दृष्टिकोणों की बेहतर संवेदनशीलता कोशिकाओं में प्रोटीन की भूमिकाओं को बेहतर ढंग से समझने के लिए आणविक जीवविज्ञानियों को उनकी खोज में एक वैकल्पिक और अधिक विश्वसनीय उपकरण प्रदान करती रहती है। हालांकि, शॉटगन प्रोटेओमिक्स दृष्टिकोण (डेटा निर्भर अधिग्रहण या डीडीए) अक्सर उपकरण की संवेदनशीलता और संकल्प पर भारी निर्भर होने के अलावा जटिल ऊतकों में कम प्रचुर मात्रा में प्रोटीन का पता लगाने में विफल रहते हैं। पिछले कुछ वर्षों में, दुनिया भर की प्रयोगशालाएं डेटा स्वतंत्र अधिग्रहण (डीआईए) जैसी तकनीकों का विकास कर रही हैं जिनके लिए बढ़ी हुई कंप्यूटिंग शक्ति और विश्वसनीय सॉफ्टवेयर की आवश्यकता होती है जो इन अत्यधिक जटिल डेटासेट को संभाल सकते हैं। हालांकि, इन तकनीकों को अभी भी प्रगति में एक काम कर रहे है और बहुत उपयोगकर्ता के अनुकूल नहीं है । लक्षित एमएस-आधारित प्रोटेओमिक्स दृष्टिकोण एमएस दृष्टिकोणों की उच्च थ्रूपुट प्रकृति और एलिसा जैसे आणविक जीव विज्ञान दृष्टिकोणों की संवेदनशीलता के बीच एक आदर्श संतुलन प्रदान करते हैं। एक लक्षित मास स्पेक्ट्रोमेट्री आधारित प्रोटेओमिक्स प्रयोग खोज आधारित शॉटगन प्रोटेओमिक्स प्रयोगों से या उपलब्ध साहित्य1,2के माध्यम से परिकल्पना चालित प्रोटीन या पेप्टाइड्स का पता लगाने पर केंद्रित है। मल्टीपल रिएक्शन मॉनिटरिंग (एमआरएम) ऐसा ही एक लक्षित एमएस दृष्टिकोण है जो जटिल नमूनों से प्रोटीन/पेप्टाइड्स का सटीक पता लगाने और मात्राकरण के लिए एक मिलकर क्वाड्रपोल मास स्पेक्ट्रोमीटर का उपयोग करता है । तकनीक कम संकल्प वाले उपकरण के उपयोग की आवश्यकता के बावजूद उच्च संवेदनशीलता और विशिष्टता प्रदान करती है।
एक चतुर्भुज 4 समानांतर छड़ से बना है, जिसमें प्रत्येक रॉड तिरछे विपरीत रॉड से जुड़ा होता है। बारी आरएफ और डीसी वोल्टेज लगाने से क्वाड्रपोल छड़ के बीच एक उतार-चढ़ाव वाला क्षेत्र बनाया जाता है। क्वाड्रपोल के अंदर आयनों का प्रक्षेपवक्र विपरीत छड़ों में एक ही वोल्टेज की उपस्थिति से प्रभावित होता है। डीसी वोल्टेज के लिए आरएफ लागू करके, आयनों की गति को स्थिर किया जा सकता है। यह चतुर्भुज की यह संपत्ति है जो इसे एक बड़े पैमाने पर फ़िल्टर के रूप में उपयोग करने की अनुमति देती है जो चुनिंदा विशिष्ट आयनों को पारित करने दे सकती है। आवश्यकता के आधार पर, एक क्वाड्रपोल को या तो स्थिर मोड या स्कैनिंग मोड में संचालित किया जा सकता है। स्थिर मोड केवल एक निर्दिष्ट एम/जेड के साथ आयनों को पारित करने की अनुमति देता है, जिससे मोड अत्यधिक चयनात्मक और ब्याज के आयन के लिए विशिष्ट हो जाता है। दूसरी ओर स्कैनिंग मोड पूरे एम/जेड रेंज में आयनों के माध्यम से पारित करने के लिए अनुमति देता है । इस प्रकार, टैंडेम क्वाड्रपोल मास स्पेक्ट्रोमीटर 4 संभावित तरीकों से काम कर सकते हैं: i) पहला क्वाड्रपोल स्थिर मोड में काम कर रहा है जबकि दूसरा स्कैनिंग मोड में काम कर रहा है; ii) स्कैनिंग मोड में पहला क्वाड्रपोल काम कर रहा है जबकि दूसरा स्थिर मोड में काम कर रहा है; iii) स्कैनिंग मोड में काम करने वाले दोनों क्वाड्रपोल; और iv) स्टेटिक मोड3में काम कर रहे दोनों क्वाड्रपोल्स . एक विशिष्ट एमआरएम प्रयोग में, दोनों क्वाड्रपोल स्थिर मोड में काम करते हैं जो विखंडन के बाद विशिष्ट अग्रदूतों और उनके परिणामस्वरूप उत्पादों की निगरानी करने की अनुमति देते हैं। यह तकनीक को सटीक मात्राकरण की अनुमति देने के लिए बहुत संवेदनशील और चयनात्मक बनाता है।
आणविक जीव विज्ञानियों के लिए, मानव मस्तिष्क ऊतक और इसकी कोशिकाएं एक खजाना निधि हैं। मानव शरीर के एक कभी दिलचस्प अंग की ये उल्लेखनीय इकाइयां अपने कामकाज में आणविक और सेलुलर अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकती हैं। मस्तिष्क के ऊतकों की प्रोटेओमिक जांच न केवल हमें स्वस्थ मस्तिष्क के प्रणालीगत कामकाज को समझने में मदद कर सकती है बल्कि सेलुलर रास्ते भी जो किसी बीमारी द्वारा दिए जाने परडिसेलेटहो जाते हैं 4 । हालांकि, अपनी सभी विषमता के साथ मस्तिष्क ऊतक विश्लेषण करने के लिए एक बहुत ही जटिल अंग है और आणविक स्तर पर परिवर्तन की बेहतर समझ के लिए एक ठोस दृष्टिकोण की आवश्यकता है। निम्नलिखित कार्य मस्तिष्क के ऊतकों से प्रोटीन निकालने, एमआरएम परख के तरीकों को बनाने और अनुकूलित करने, लक्ष्यों के सत्यापन(चित्रा 1)से शुरू होने वाले पूरे कार्यप्रवाह का वर्णन करता है। यहां, हमने एक व्यापक अनुसंधान समुदाय के लिए तकनीक और इसकी चुनौतियों को पेश करने के उद्देश्य से मानव मस्तिष्क ऊतक का उपयोग करके एक सफल एमआरएम आधारित प्रयोग में शामिल प्रमुख कदमों पर व्यवस्थित रूप से प्रकाश डाला है ।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile (MS grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A/0620/21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>TC194-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Fischer Scienific</td>
			<td>BP510-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid (MS grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>147930250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1149-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol (MS grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Q13827</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Fischer Scienific</td>
			<td>BP214-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol (MS grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A456-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS grade water</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>51140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>TL1006-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Roche Diagnostics</td>
			<td>11873580001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>DF6D661300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCEP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>646547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Merck</td>
			<td>648310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin (MS grade)</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>90058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Merck</td>
			<td>MB1D691237</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Supplies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypersil Gold C18 column</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>25002-102130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipettes</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F167380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stage tips</td>
			<td>MilliPore</td>
			<td>ZTC18M008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zirconia/Silica beads</td>
			<td>BioSpec products</td>
			<td>11079110z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bead beater (Homogeniser)</td>
			<td>Bertin Minilys</td>
			<td>P000673-MLYS0-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader (spectrophotometer)</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>MultiSkan Go</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td>Eutech</td>
			<td>CyberScan pH 510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Probe Sonicator</td>
			<td>Sonics Materials, Inc</td>
			<td>VCX 130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking Drybath</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>88880028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TSQ Altis mass spectrometer</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>TSQ02-10002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>uHPLC - Vanquish</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>VQF01-20001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum concentrator</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>Savant ISS 110</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative proteomics workflow using multiple reaction monitoring based detection of proteins from human brain tissue

पिछले दशक में मानव मस्तिष्क के ऊतकों के प्रोटेओमिक विश्लेषण ने मस्तिष्क के बारे में हमारी समझ को बहुत बढ़ाया है। हालांकि, मस्तिष्क से संबंधित विकारों को दुनिया भर में मौतों का एक प्रमुख योगदानकर्ता बना हुआ है, उनके रोग विज्ञान की और भी अधिक समझ के लिए की जरूरत है । पश्चिमी ब्लॉटिंग या इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री जैसी पारंपरिक एंटीबॉडी-आधारित तकनीकें श्रम-प्रधान और गुणात्मक या अर्ध-मात्रात्मक होने के अलावा कम थ्रूपुट होने से पीड़ित हैं। यहां तक कि पारंपरिक जन स्पेक्ट्रोमेट्री आधारित शॉटगन दृष्टिकोण एक निश्चित परिकल्पना का समर्थन करने के लिए निर्णायक सबूत प्रदान करने में विफल रहे हैं। लक्षित प्रोटेओमिक्स दृष्टिकोण काफी हद तक परिकल्पना से प्रेरित होते हैं और पारंपरिक शॉटगन प्रोटेओमिक्स दृष्टिकोणों से भिन्न होते हैं जो लंबे समय तक उपयोग में रहे हैं। मल्टीपल रिएक्शन मॉनिटरिंग ऐसा ही एक लक्षित दृष्टिकोण है जिसके लिए एक विशेष मास स्पेक्ट्रोमीटर के उपयोग की आवश्यकता होती है जिसे टैंडेम क्वाड्रपोल मास स्पेक्ट्रोमीटर या ट्रिपल क्वाड्रपोल मास स्पेक्ट्रोमीटर कहा जाता है। वर्तमान अध्ययन में, हमने इस कार्यप्रवाह को व्यापक अनुसंधान समुदाय में पेश करने के उद्देश्य से मानव मस्तिष्क ऊतक का उपयोग करके एक सफल टैम्परपोल मास स्पेक्ट्रोमेट्री आधारित प्रोटेओमिक्स वर्कफ्लो का सफल प्रदर्शन करने में शामिल प्रमुख कदमों पर व्यवस्थित रूप से प्रकाश डाला है।

हमने 10 नमूनों से 3 प्रोटीन, मस्तिष्क में असामान्यताओं वाले रोगियों के प्रत्येक समूह से 5 नमूनों के सापेक्ष मात्राकरण का प्रदर्शन किया। इन प्रोटीनों में एपोलीपोप्रोटीन ए-1 (एपीओए-आई), विमेंटिन (विम) और निक?...

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Quantitative Proteomics Workflow using Multiple Reaction Monitoring Based Detection of Proteins from Human Brain Tissue

इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य नैदानिक नमूनों से प्रोटीन के मल्टीपल रिएक्शन मॉनिटरिंग (एमआरएम) के लिए ट्रिपल क्वाड्रपोल मास स्पेक्ट्रोमीटर का उपयोग शुरू करना है। हमने सभी आवश्यक सावधानियों के साथ नैदानिक नमूनों के लिए नमूना तैयारी से लेकर डेटा विश्लेषण तक एक व्यवस्थित कार्यप्रवाह प्रदान किया है।

मानव मस्तिष्क ऊतक से प्रोटीन का एकाधिक प्रतिक्रिया निगरानी आधारित पता लगाने का उपयोग कर मात्रात्मक प्रोटेओमिक्स वर्कफ्लो

The proteomic analysis of the human brain tissue over the last decade has greatly enhanced our understanding of the brain. However, brain related ...

लक्षित प्रोटेओमिक दृष्टिकोण तेजी से अल्पकालिक प्रोटेओमिक्स आधारित प्रयोगों से या आणविक जीव विज्ञान आधारित प्रयोगों से प्रोटीन के सत्यापन के लिए पसंद की विधि बन रहे हैं । मल्टीपल रिएक्शन मॉनिटरिंग ऐसा ही एक लक्षित दृष्टिकोण है जिसका इस्तेमाल जैविक नमूनों से प्रोटीन का पता लगाने और उसकी मात्रा निर्धारित करने के लिए तेजी से किया जा रहा है । इस अध्ययन में हम एक MRM प्रयोग की बुनियादी आवश्यकताओं के लिए पाठकों को शुरू करने के इरादे से मानव मस्तिष्क के ऊतकों से प्रोटीन का पता लगाने और मात्रा में शामिल विभिन्न कदमों के माध्यम से चला गया है ।मस्तिष्क के ऊतकों के लगभग 50 मिलीग्राम वजन, और 1x फॉस्फेट-बफर खारा के 300 माइक्रोलीटर के साथ ऊतक धोने। यह कदम ऊतक की बाहरी सतह पर किसी भी रक्त को हटाने के लिए किया जाता है, और इसलिए जितना संभव हो उतना रक्त हटाने की सलाह दी जाती है। पीबीएस के साथ वॉश के बाद, ऊतक युक्त ट्यूब में लाइसिस बफर के 300 माइक्रोलीटर जोड़ें।एक आइस बाथ पर ट्यूब रखते समय एक जांच ध्वनिक का उपयोग कर ऊतक Lyse । ऊतक को पूरी तरह से lyse करने के लिए एक मनका डिब्बा का उपयोग कर ऊतक समरूपता के साथ जारी रखें। सेंट्रलाइज ट्यूब की सामग्री 6000 ग्राम पर 15 मिनट के लिए चार डिग्री सेंटीग्रेड पर।सुपरनेट को एक ताजा ट्यूब में स्थानांतरित करें और सजातीय रूप से मिलाएं। सुपरनेट का एक छोटा सा एलिकोट लें, और एक मानक प्रोटीन परख का उपयोग करके प्रोटीन सामग्री की मात्रा निर्धारित करें। यहां हम ब्रैडफोर्ड परख का उपयोग कर प्रोटीन अनुमान का एक उदाहरण दिखाते हैं ।एक माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में 50 माइक्रोग्राम प्रोटीन लें और टीएमईपी जोड़कर सामग्री को कम करें ताकि अंतिम एकाग्रता 20 मिलीमोलर हो। एक घंटे के लिए 37 डिग्री पर सामग्री इनक्यूबेट। इनक्यूबेशन बाद, ट्यूब में इओडोएसेटामाइड जोड़कर कम प्रोटीन को एल्किलेट करें, जैसे कि अंतिम एकाग्रता 40 मिलीमोलर है।ट्यूब को 30 मिनट तक अंधेरे में इनक्यूबेट करें। अब ट्यूब में बफर बी जोड़ें जिसमें कम और एल्किलेटेड प्रोटीन निहित है ताकि यूरिया की अंतिम एकाग्रता एक मोलर से कम हो। 30 एंजाइम-टू-प्रोटीन अनुपात के रूप में 1 में ट्रिप्पसिन जोड़ें और लगातार झटकों के साथ 37 डिग्री पर रात भर ट्यूबों को इनक्यूबेट करें।पाचन के बाद, पचा पेप्टाइड्स को वैक्यूम कंसंट्रेटर में केंद्रित करें। इस कदम पर, पेप्टाइड्स को या तो पुनर्गठित किया जा सकता है और भविष्य के उपयोग के लिए शून्य से 80 पर संग्रहीत किया जा सकता है। किसी भी एलसी-एमएस एमएस पर नमूने लोड करने से पहले डेसाल्टिंग, या पेप्टाइड क्लीन-अप आवश्यक है। नमूने में लवण और अन्य संदूषक स्तंभ को रोक सकते हैं और लंबे समय में उपकरण की संवेदनशीलता को प्रभावित कर सकते हैं।इस प्रक्रिया को व्यावसायिक रूप से उपलब्ध C18 STAGE सुझावों या स्तंभों का उपयोग करके किया जा सकता है। यहां हमने C18 स्टेज टिप का उपयोग करके पेप्टाइड डेसाल्टिंग के लिए वर्कफ़्लो को चित्रित किया है। डेसाल्टिंग के बाद, पेप्टाइड्स को वैक्यूम साइंडरेटर में सुखा लें।इन स्वच्छ पेप्टाइड्स का पुनर्गठन करें और स्कोप विधि का उपयोग करके मात्राकरण के लिए आगे बढ़ें। इसके लिए एक माइक्रोड्रॉप प्लेट में सैंपल के दो माइक्रोलीटर लोड करें और स्लाइड में दिखाए गए कंसंट्रेशन की गणना करें। संक्रमण सूची तैयार करना एसआरएम या एमआरएम प्रयोग में एक महत्वपूर्ण कदम है।एक संक्रमण सूची में संक्रमण की निगरानी के लिए बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमीटर द्वारा आवश्यक सभी जानकारी शामिल है। इसमें अग्रदूत और उत्पाद आयनों के जेड मूल्यों, संक्रमण की टकराव ऊर्जा, उपकरण की ध्रुवीयता और डेटा अधिग्रहण के लिए समय सीमा द्वारा एम शामिल हैं। स्काईलाइन का उपयोग करके संक्रमण सूची तैयार करें।यूनिप्रोट से ह्यूमन प्रोटेम फास्टा फाइल का उपयोग करके एक पृष्ठभूमि प्रोटेम तैयार करें और यह सुनिश्चित करें कि इसे पेप्टाइड सेटिंग्स के बैकग्राउंड टैब के तहत चुना गया है। फ़िल्टर टैब में, न्यूनतम लंबाई 8 और अधिकतम लंबाई 25 निर्धारित करें। यदि पेप्टाइड्स में कोई अन्य संशोधन नहीं हैं तो डिफ़ॉल्ट सेटिंग्स का उपयोग करना जारी रखें।एक बार पेप्टाइड सेटिंग्स हो जाने के बाद ट्रांजिशन सेटिंग्स पर क्लिक करें। फ़िल्टर टैब के तहत, अग्रदूत शुल्क को 2 और 3 के रूप में सेट करें। आयन शुल्क को 1 के रूप में सेट करें और आयन प्रकार को वाई सेट करें।उपयोगकर्ता की पसंद के आधार पर उत्पाद आयनों का चयन किया जा सकता है। सभी मापदंडों को चूक के रूप में छोड़ दें। अब चयनित लक्ष्य प्रोटीन की परिग्रहण की गई एफडी डालें।यह संपादित करें टैब पर क्लिक करके किया जा सकता है फिर डालने का चयन और अंत में परिग्रहण IDs चिपकाने। आईडी को बैकग्राउंड प्रोटेम में प्रोटीन और पहले सेट पेप्टाइड और ट्रांजिशन सेटिंग्स के आधार पर बनाई गई ट्रांजिशन लिस्ट में मैप किया जाएगा । इस संक्रमण सूची का निर्यात करें।सुनिश्चित करें कि इंस्ट्रूमेंट टाइप ड्रॉपडाउन विकल्प पर क्लिक करके सही इंस्ट्रूमेंट का चयन किया जाए। इस मामले में, उपकरण थर्मो अल्टिस है। चूंकि अपरिभाषित संक्रमण सूची में बहुत अधिक संक्रमण हैं, इसलिए प्रति सूची केवल 350 संक्रमणों की सीमा रखें और कई तरीकों के रूप में निर्यात करें।बाइनरी सॉल्वेंट सिस्टम का उपयोग किया जाता है। सॉल्वेंट ए 1% एफए है और सॉल्वेंट बी 80% एसीएन है। प्रवाह दर को प्रति मिनट 450 माइक्रोलीटर और दिखाया गया ढाल पर रखें।कॉलम डिब्बे का तापमान 45 डिग्री सेल्सियस पर सेट करें। कॉलम और एलसी सिस्टम के बारे में अधिक जानकारी के लिए, पाठ देखें। सुनिश्चित करें कि आपके TSQ Altis में एमएस सेटिंग्स यहां दिखाए गए हैं।एक नई विधि बनाने के लिए एक एकल संक्रमण सूची आयात करें। हम 7 पर चतुर्भुज 1 और चौगुनी 3 के लिए संकल्प रखने का सुझाव देते हैं । यदि आवश्यक हो तो इन्हें और अनुकूलित किया जा सकता है।रन में निरंतरता सुनिश्चित करने के लिए और फलस्वरूप डेटा गुणवत्ता, अपने रन अनुक्रम तैयार के रूप में दिखाया गया है । कुछ रिक्त स्थानों के साथ शुरू करें, खाली मिश्रण की संरचना के लिए पाठ का उल्लेख करें, इसके बाद उपकरण की दिन-वार प्रतिक्रिया में किसी भी भिन्नता की निगरानी के लिए ज्ञात एकाग्रता के क्यूसी मानक प्रकाश बीएसए हैं। किया गया क्यूसी नमूनों से ठीक पहले होना चाहिए।अगली लाइन के बीच में रिक्त स्थान के साथ सभी नमूनों । प्रत्येक नमूने की समान मात्रा इंजेक्ट करें, प्रति इंजेक्शन पेप्टाइड्स के 25 से 1 नैनोग्राम के लिए लेखांकन। एक परिष्कृत विधि बनाने के लिए, पहले पूरे नमूनों के खिलाफ अपरिभाषित तरीकों को चलाएं।स्काईलाइन में आयात परिणाम और मैन्युअल रूप से प्रत्येक पेप्टाइड की जांच करें। प्रत्येक पेप्टाइड के लिए, सभी नमूनों में लगातार अच्छी चोटियों को दिखाने वाले एक अग्रदूत का चयन करें। अग्रदूत और पेप्टाइड्स को हटाएं जो अच्छी चोटियों को नहीं दिखा रहे हैं।सुनिश्चित करें कि सभी चोटियों को ठीक से एनोटेट किया गया है। सही चोटी का चयन करने और प्रत्येक अग्रदूत के तहत संक्रमण को और अधिक परिष्कृत करने के लिए, एक पुस्तकालय का उपयोग किया जा सकता है। एक पुस्तकालय एमएस-एमएस स्पेक्ट्रल डेटा का एक सेट है जो पेप्टाइड्स और वर्तमान प्रयोगात्मक डेटा के संक्रमण से मेल खाती है।उन चोटियों को चुनें जिनमें डार्ट पी मूल्य 1 के करीब हैं और उन संक्रमणों को हटा दें जो पुस्तकालय से मेल नहीं खाते हैं। एक डार्ट पी मूल्य यह दर्शाता है कि प्रयोगात्मक चोटी और पुस्तकालय शिखर के बीच मैच कितना अच्छा है। अनुकूलन के एक या दो दौर के बाद, एक परिष्कृत सूची तैयार होगी।इस रिफाइंड सूची को अलग-अलग नमूनों के लिए चलाया जा सकता है। परिष्कृत क्षितिज में रन आयात करें और चोटियों को ठीक से एनोटेट करें। दस्तावेज़ ग्रिड में प्रत्येक नमूने को ध्यान से एनोटेट करने के लिए दस्तावेज़ सेटिंग्स के तहत एनोटेशन टैब का उपयोग करें।अपने प्रयोग की स्थिति 1 और शर्त 2 के बीच तुलना बनाने के लिए समूह तुलना सुविधा का उपयोग करें। यह समायोजित पी मूल्यों और गुना परिवर्तन मूल्यों के साथ तालिका दो समूहों के बीच दे देंगे । हमारी जानकारी के लिए, यह मानव मस्तिष्क के ऊतकों के नमूनों में प्रोटीन एपोलीपोप्रोटीन ए-1, विमेंटिन और निकोटिनामाइड फॉस्फोरिबोसाइलट्रांसेक्शन के लिए पेप्टाइड्स का पता लगाने के लिए एमआरएम के उपयोग को नियोजित करने वाला पहला अध्ययन है।एलसी ढाल, निवास समय, चक्र समय, और टकराव ऊर्जा जैसे विभिन्न मापदंडों का अनुकूलन एमआरएम प्रयोग की सफलता को बहुत प्रभावित कर सकता है। हमारा मानना है कि इस तकनीक का उपयोग विभिन्न नैदानिक स्थितियों और बीमारियों के बीच अंतर करने की क्षमता के साथ बायोमार्कर के पैटर्न विकसित करने के लिए किया जा सकता है।

Research

JoVE Journal

Biology

A Chromatin Assay for Human Brain Tissue

मानव मस्तिष्क के ऊतकों के लिए एक chromatin परख

Chronic neuropsychiatric illnesses such as schizophrenia, bipolar disease and autism are thought to result from a combination of genetic and environmental ...

Neuronal Nuclei Isolation from Human Postmortem Brain Tissue

मानव शवपरीक्षा मस्तिष्क के ऊतकों से neuronal नाभिक अलगाव

Neurons in the human brain become postmitotic largely during prenatal development, and thus maintain their nuclei throughout the full lifespan. However, ...

Monitoring Acupuncture Effects on Human Brain by fMRI

निगरानी मानव मस्तिष्क पर fMRI द्वारा एक्यूपंक्चर प्रभाव

Functional MRI is used to study the effects of acupuncture on the BOLD response and the functional connectivity of the human brain.  Results demonstrate ...

Identification of protein complexes with quantitative proteomics in S. cerevisiae

मात्रात्मक प्रोटिओमिक्स के साथ एस cerevisiae में प्रोटीन परिसरों की पहचान

Lipids are the building blocks of cellular membranes that function as barriers and in compartmentalization of cellular processes, and recently, as ...

Obtaining High Quality RNA from Single Cell Populations in Human Postmortem Brain Tissue

मानव शवपरीक्षा मस्तिष्क के ऊतकों में एकल सेल आबादी से उच्च गुणवत्ता शाही सेना प्राप्त

We proposed to investigate the gray matter reduction in the superior temporal gyrus seen in schizophrenia patients, by interrogating gene expression ...

High-throughput Crystallization of Membrane Proteins Using the Lipidic Bicelle Method

Lipídic Bicelle विधि का प्रयोग झिल्ली प्रोटीन की उच्च throughput Crystallization

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane ...

A Quantitative Fitness Analysis Workflow

एक मात्रात्मक स्वास्थ्य विश्लेषण कार्यप्रवाह

Quantitative Fitness Analysis (QFA) is an experimental and computational workflow for comparing fitnesses of microbial cultures grown in parallel1,2,3,4. ...

Proteomic Sample Preparation from Formalin Fixed and Paraffin Embedded Tissue

Formalin से प्रोटिओमिक नमूना तैयार आयल एम्बेडेड ऊतक फिक्स्ड और

Preserved clinical material is a unique source for proteomic investigation of human disorders. Here we describe an optimized protocol allowing large scale ...

Identification of Protein Interaction Partners in Mammalian Cells Using SILAC-immunoprecipitation Quantitative Proteomics

SILAC-immunoprecipitation मात्रात्मक प्रोटिओमिक्स का प्रयोग स्तनधारी कोशिकाओं में प्रोटीन बातचीत भागीदारों की पहचान

Quantitative proteomics combined with immuno-affinity purification, SILAC immunoprecipitation, represent a powerful means for the discovery of novel ...

Selected Reaction Monitoring Mass Spectrometry for Absolute Protein Quantification

निरपेक्ष प्रोटीन की मात्रा के लिए मास स्पेक्ट्रोमेट्री निगरानी चयनित रिएक्शन

Absolute quantification of target proteins within complex biological samples is critical to a wide range of research and clinical applications. This ...