Name: quantitative proteomics workflow using multiple reaction monitoring based detection of proteins from human brain tissue
Uploaded: 2021-08-28T13:00:00
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Riconosciamo mhrd-UAY Project (UCHHATAR AVISHKAR YOJANA), progetto #34_IITB a SS e MASSFIITB Facility presso IIT Bombay supportato dal Dipartimento di Biotecnologie (BT / PR13114 / INF / 22/206/ 2015) per effettuare tutti gli esperimenti relativi alla SM.
Estendiamo i nostri ringraziamenti speciali al signor Rishabh Yadav per la realizzazione e il montaggio dell'intero video e al signor Nishant Nerurkar per il suo lavoro nel montaggio dell'audio.

Questo studio coinvolge campioni di tessuto cerebrale di partecipanti umani, esaminati e approvati da TMH e IITB IEC - (IITB-IEC/2018/019). I partecipanti hanno fornito il loro consenso informato e scritto a partecipare a questo studio.
1 Estrazione di proteine dal tessuto cerebrale
<ol><li>Pesare circa 50 mg di tessuto cerebrale e lavare il tessuto con 300 μL di 1x soluzione salina tampone fosfato (PBS) utilizzando una micropipetta. NOTA: Questo passaggio viene eseguito per rimuovere il...

<ol>
	<li>Picotti, P., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selected+reaction+monitoring-based+proteomics:+Workflows,+potential,+pitfalls+and+future+directions.">Selected reaction monitoring-based proteomics: Workflows, potential, pitfalls and future directions.</a> Nature Methods. , (2012).</li><li>Carr, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+peptide+measurements+in+biology+and+medicine:+Best+practices+for+mass+spectrometry-based+assay+development+using+a+fit-for-purpose+approach.">Targeted peptide measurements in biology and medicine: Best practices for mass spectrometry-based assay development using a fit-for-purpose approach.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 13 (3), 907-917 (2014).</li><li>Pitt, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+and+applications+of+liquid+chromatography-mass+spectrometry+in+clinical+biochemistry.">Principles and applications of liquid chromatography-mass spectrometry in clinical biochemistry.</a> The Clinical biochemist Reviews. 30 (1), 19-34 (2009).</li><li>Hosp, F., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Primer+on+Concepts+and+Applications+of+Proteomics+in+Neuroscience.">A Primer on Concepts and Applications of Proteomics in Neuroscience.</a> Neuron. 96 (3), 558-571 (2017).</li><li>Scopes, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+protein+by+spectrophotometry+at+205+nm.">Measurement of protein by spectrophotometry at 205 nm.</a> Analytical Biochemistry. , (1974).</li><li>Kusebauch, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+SRMAtlas:+A+Resource+of+Targeted+Assays+to+Quantify+the+Complete+Human+Proteome.">Human SRMAtlas: A Resource of Targeted Assays to Quantify the Complete Human Proteome.</a> Cell. , (2016).</li><li>MacLean, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skyline:+an+open+source+document+editor+for+creating+and+analyzing+targeted+proteomics+experiments.">Skyline: an open source document editor for creating and analyzing targeted proteomics experiments.</a> Bioinformatics. 26 (7), 966-968 (2010).</li><li>Gerber, S. A., Rush, J., Stemman, O., Kirschner, M. W., Gygi, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absolute+quantification+of+proteins+and+phosphoproteins+from+cell+lysates+by+tandem+MS.">Absolute quantification of proteins and phosphoproteins from cell lysates by tandem MS.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2003).</li><li>Escher, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+iRT,+a+normalized+retention+time+for+more+targeted+measurement+of+peptides.">Using iRT, a normalized retention time for more targeted measurement of peptides.</a> Proteomics. , (2012).</li><li>Gillette, M. A., Carr, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+peptides+and+proteins+in+biomedicine+by+targeted+mass+spectrometry.">Quantitative analysis of peptides and proteins in biomedicine by targeted mass spectrometry.</a> Nature Methods. 10 (1), 28-34 (2013).</li><li>Whiteaker, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+targeted+proteomics-based+pipeline+for+verification+of+biomarkers+in+plasma.">A targeted proteomics-based pipeline for verification of biomarkers in plasma.</a> Nature Biotechnology. , (2011).</li><li>H&#252;ttenhain, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproducible+quantification+of+cancer-associated+proteins+in+body+fluids+using+targeted+proteomics.">Reproducible quantification of cancer-associated proteins in body fluids using targeted proteomics.</a> Science Translational Medicine. 4 (142), 94 (2012).</li><li>Mermelekas, G., Vlahou, A., Zoidakis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SRM/MRM+targeted+proteomics+as+a+tool+for+biomarker+validation+and+absolute+quantification+in+human+urine.">SRM/MRM targeted proteomics as a tool for biomarker validation and absolute quantification in human urine.</a> Expert Review of Molecular Diagnostics. 15 (11), 1441-1454 (2015).</li><li>Koldamova, R. P., Lefterov, I. M., Lefterova, M. I., Lazo, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apolipoprotein+A-I+directly+interacts+with+amyloid+precursor+protein+and+inhibits+A&#946;+aggregation+and+toxicity.">Apolipoprotein A-I directly interacts with amyloid precursor protein and inhibits A&#946; aggregation and toxicity.</a> Biochemistry. , (2001).</li><li>Jiang, S. X., Slinn, J., Aylsworth, A., Hou, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vimentin+participates+in+microglia+activation+and+neurotoxicity+in+cerebral+ischemia.">Vimentin participates in microglia activation and neurotoxicity in cerebral ischemia.</a> Journal of Neurochemistry. , (2012).</li><li>Liu, L. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nicotinamide+Phosphoribosyltransferase+May+Be+Involved+in+Age-Related+Brain+Diseases.">Nicotinamide Phosphoribosyltransferase May Be Involved in Age-Related Brain Diseases.</a> PLoS ONE. , (2012).</li><li>Abbatiello, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+guidelines+for+publication+of+manuscripts+describing+development+and+application+of+targeted+mass+spectrometry+measurements+of+peptides+and+proteins.">New guidelines for publication of manuscripts describing development and application of targeted mass spectrometry measurements of peptides and proteins.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 16 (3), 327-328 (2017).</li></ol>

Tecniche come l'immunoistochimica e il Western blotting sono state considerate come i gold standard per la convalida di bersagli proteici per molti anni. Questi metodi trovano uso ancora oggi con piccole modifiche nel protocollo e poca dipendenza dalla tecnologia che li rende molto ingombranti e noiosi. Oltre a questo, comportano anche l'uso di anticorpi costosi che non sempre mostrano la stessa specificità tra i lotti e richiedono una grande quantità di esperienza. Inoltre, solo una piccola frazione di proteine ident...

Durante l'ultimo decennio, i rapidi sviluppi della spettrometria di massa (SM) insieme a una maggiore comprensione delle tecniche di cromatografia hanno notevolmente aiutato nel progresso della proteomica basata sulla SM. Le tecniche basate sulla biologia molecolare come il western blotting e l'immunoistochimica hanno sofferto a lungo di problemi di riproducibilità, tempi di consegna lenti, variabilità inter-osservatore e la loro incapacità di quantificare accuratamente le proteine, per citarne alcuni. A tal fine, la sensibilità superiore degli approcci proteomici ad alto rendimento continua a offrire ai biologi molecolari uno strumento alternativo e più affidabile nella loro ricerca per comprendere meglio il ruolo delle proteine nelle cellule. Tuttavia, gli approcci di proteomica shotgun (Data dependent Acquisition o DDA) spesso non riescono a rilevare proteine a bassa abbondanza nei tessuti complessi oltre ad essere fortemente dipendenti dalla sensibilità e dalla risoluzione dello strumento. Negli ultimi due anni, i laboratori di tutto il mondo hanno sviluppato tecniche come Data Independent Acquisition (DIA) che richiedono una maggiore potenza di calcolo e un software affidabile in grado di gestire questi set di dati altamente complessi. Tuttavia, queste tecniche sono ancora un work in progress e non molto user friendly. Gli approcci proteomici mirati basati sulla SM forniscono un perfetto equilibrio tra la natura ad alto rendimento degli approcci SM e la sensibilità degli approcci di biologia molecolare come ELISA. Un esperimento mirato di proteomica basato sulla spettrometria di massa si concentra sulla rilevazione di proteine o peptidi guidati da ipotesi da esperimenti di proteomica basati sulla scoperta o attraverso la letteratura disponibile1,2. Il monitoraggio a reazione multipla (MRM) è uno di questi approcci mirati alla SM che utilizza uno spettrometro di massa a quadrupolo tandem per il rilevamento e la quantificazione accurati di proteine / peptidi da campioni complessi. La tecnica offre maggiore sensibilità e specificità nonostante richieda l'uso di uno strumento a bassa risoluzione.
Un quadrupolo è costituito da 4 aste parallele, con ogni asta collegata all'asta diagonalmente opposta. Un campo fluttuante viene creato tra le aste quadrupolo applicando tensioni RF e DC alternate. La traiettoria degli ioni all'interno del quadrupolo è influenzata dalla presenza delle stesse tensioni attraverso barre opposte. Applicando la tensione RF a CC, la traiettoria degli ioni può essere stabilizzata. È questa proprietà del quadrupolo che gli consente di essere utilizzato come filtro di massa in grado di far passare selettivamente ioni specifici. A seconda delle esigenze, un quadrupolo può essere azionato sia in modalità statica che in modalità di scansione. La modalità statica consente il passaggio solo di ioni con un m/z specificato, rendendo la modalità altamente selettiva e specifica per lo ione di interesse. La modalità di scansione, d'altra parte, consente il passaggio di ioni su tutta la gamma m / z. Pertanto, gli spettrometri di massa a quadrupolo tandem possono funzionare in 4 modi possibili: i) il primo quadrupolo che opera in modalità statica mentre il secondo opera in modalità di scansione; ii) il primo quadrupolo operante in modalità di scansione mentre il secondo operante in modalità statica; iii) entrambe le quadruffle che operano in modalità di scansione; e iv) entrambi i quadrupoli operanti in modalità statica3. In un tipico esperimento MRM, entrambi i quadruttori operano in modalità statica consentendo di monitorare specifici precursori e i loro prodotti risultanti dopo la frammentazione. Questo rende la tecnica molto sensibile e selettiva permettendo una quantificazione accurata.
Per i biologi molecolari, il tessuto cerebrale umano e le sue cellule sono un tesoro. Queste notevoli unità di un organo sempre interessante del corpo umano possono fornire informazioni molecolari e cellulari sul suo funzionamento. Le indagini proteomiche del tessuto cerebrale possono non solo aiutarci a capire il funzionamento sistemico di un cervello sano, ma anche i percorsi cellulari che si disregolano quando inflitti da qualche malattia4. Tuttavia, il tessuto cerebrale con tutta la sua eterogeneità è un organo molto complesso da analizzare e richiede un approccio concertato per una migliore comprensione dei cambiamenti a livello molecolare. Il lavoro che segue descrive l'intero flusso di lavoro a partire dall'estrazione di proteine dal tessuto cerebrale, creando e ottimizzando i metodi per il test MRM, fino alla convalida dei bersagli (Figura 1). Qui, abbiamo sistematicamente evidenziato i principali passi coinvolti in un esperimento basato sulla MRM di successo che utilizza tessuto cerebrale umano con l'obiettivo di introdurre la tecnica e le sue sfide a una comunità di ricerca più ampia.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile (MS grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A/0620/21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>TC194-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Fischer Scienific</td>
			<td>BP510-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid (MS grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>147930250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1149-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol (MS grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Q13827</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Fischer Scienific</td>
			<td>BP214-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol (MS grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A456-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS grade water</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>51140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>TL1006-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Roche Diagnostics</td>
			<td>11873580001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>DF6D661300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCEP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>646547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Merck</td>
			<td>648310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin (MS grade)</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>90058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Merck</td>
			<td>MB1D691237</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Supplies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypersil Gold C18 column</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>25002-102130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipettes</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F167380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stage tips</td>
			<td>MilliPore</td>
			<td>ZTC18M008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zirconia/Silica beads</td>
			<td>BioSpec products</td>
			<td>11079110z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bead beater (Homogeniser)</td>
			<td>Bertin Minilys</td>
			<td>P000673-MLYS0-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader (spectrophotometer)</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>MultiSkan Go</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td>Eutech</td>
			<td>CyberScan pH 510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Probe Sonicator</td>
			<td>Sonics Materials, Inc</td>
			<td>VCX 130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking Drybath</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>88880028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TSQ Altis mass spectrometer</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>TSQ02-10002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>uHPLC - Vanquish</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>VQF01-20001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum concentrator</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>Savant ISS 110</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative proteomics workflow using multiple reaction monitoring based detection of proteins from human brain tissue

L'analisi proteomica del tessuto cerebrale umano nell'ultimo decennio ha notevolmente migliorato la nostra comprensione del cervello. Tuttavia, i disturbi legati al cervello continuano ad essere uno dei principali contributori di decessi in tutto il mondo, rendendo necessaria una comprensione ancora maggiore della loro patobiologia. Le tecniche tradizionali basate su anticorpi come il western blotting o l'immunoistochimica soffrono di bassa produttività oltre ad essere laboriose e qualitative o semi-quantitative. Anche gli approcci convenzionali basati sulla spettrometria di massa non riescono a fornire prove conclusive a sostegno di una certa ipotesi. Gli approcci proteomici mirati sono in gran parte guidati da ipotesi e differiscono dagli approcci convenzionali di proteomica del fucile da caccia che sono stati a lungo in uso. Il monitoraggio a reazione multipla è uno di questi approcci mirati che richiede l'uso di uno speciale spettrometro di massa chiamato spettrometro di massa a quadrupolo tandem o spettrometro di massa a triplo quadrupolo. Nel presente studio, abbiamo sistematicamente evidenziato i principali passi coinvolti nell'esecuzione di un flusso di lavoro proteomico basato sulla spettrometria di massa a quadrupolo tandem di successo utilizzando il tessuto cerebrale umano con l'obiettivo di introdurre questo flusso di lavoro a una più ampia comunità di ricerca.

Abbiamo eseguito la quantificazione relativa di 3 proteine da 10 campioni, 5 campioni da ciascun gruppo di pazienti con anomalie nel cervello. Queste proteine includevano Apolipoproteina A-I (APOA-I), Vimentina (VIM) e Nicotinamide fosforibosiltransferasi (NAMPT) che sono noti per svolgere ruoli diversi nelle cellule cerebrali. L'analisi post-run dei dati è stata eseguita utilizzando Skyline-daily (Ver 20.2.1.286). Sono stati monitorati un totale di 10 peptidi corrispondenti a 3 proteine. Questi includevano 3 peptidi pe...

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Quantitative Proteomics Workflow using Multiple Reaction Monitoring Based Detection of Proteins from Human Brain Tissue

Il protocollo mira a introdurre l'uso di uno spettrometro di massa a triplo quadrupolo per il monitoraggio a reazione multipla (MRM) di proteine provenienti da campioni clinici. Abbiamo fornito un flusso di lavoro sistematico a partire dalla preparazione dei campioni all'analisi dei dati per i campioni clinici con tutte le precauzioni necessarie da prendere.

Flusso di lavoro di proteomica quantitativa utilizzando il rilevamento basato sul monitoraggio di reazioni multiple di proteine dal tessuto cerebrale umano

The proteomic analysis of the human brain tissue over the last decade has greatly enhanced our understanding of the brain. However, brain related ...

Gli approcci proteomici mirati stanno rapidamente diventando il metodo di scelta per la convalida delle proteine da esperimenti basati sulla proteomica a breve termine o da esperimenti basati sulla biologia molecolare. Il monitoraggio delle reazioni multiple è uno di questi approcci mirati che viene sempre più utilizzato per rilevare e quantificare le proteine da campioni biologici. In questo studio abbiamo attraversato i vari passaggi coinvolti nel rilevamento e nella quantificazione delle proteine dal tessuto cerebrale umano con l'intenzione di introdurre i lettori ai requisiti di base di un esperimento MRM.Pesare circa 50 mg di tessuto cerebrale e lavare il tessuto con 300 microlitri di 1x soluzione salina tamponata con fosfato. Questo passaggio viene eseguito per rimuovere qualsiasi sangue sulla superficie esterna del tessuto, e quindi è consigliabile rimuovere più sangue possibile. Dopo i lavaggi con PBS, aggiungere 300 microlitri di tampone di lisi al tubo contenente il tessuto.Lisire il tessuto utilizzando un sonicatore a sonda mantenendo il tubo su un bagno di ghiaccio. Continuare con l'omogeneizzazione dei tessuti utilizzando un battitore di perle per perlisi completare il tessuto. Centrifugare il contenuto del tubo a 6000 g per 15 minuti a quattro gradi centigradi.Trasferire il surnatante in un tubo fresco e mescolare in modo omogeneo. Prendi una piccola aliquota del surnatante e quantifica il contenuto proteico usando un test proteico standard. Qui mostriamo un esempio di stima delle proteine utilizzando Bradford Assay.Prendi 50 microgrammi di proteine in un tubo di microcentrifuga e riduci il contenuto aggiungendo TCEP in modo tale che la concentrazione finale sia di 20 millimolari. Incubare il contenuto a 37 gradi per un'ora. Dopo l'incubazione, alchilare le proteine ridotte aggiungendo iodoacetammide al tubo, in modo tale che la concentrazione finale sia di 40 millimolari.Incubare il tubo al buio per 30 minuti. Ora aggiungi il tampone B al tubo contenuto nelle proteine ridotte e alchilate in modo tale che la concentrazione finale di urea sia inferiore a un molare. Aggiungere la tripsina in 1 come a 30 rapporto enzima-proteina e incubare i tubi durante la notte a 37 gradi con agitazione costante.Dopo la digestione, concentrare i peptidi digeriti in un concentratore di vuoto. In questa fase, i peptidi possono essere ricostituiti e dissattati o conservati a meno 80 per un uso futuro. La desalazione, o pulizia dei peptidi, è essenziale prima di caricare i campioni su qualsiasi LC-MS MS. Sali e altri contaminanti nel campione possono ostruire la colonna e influenzare la sensibilità dello strumento a lungo termine.Questo processo può essere eseguito utilizzando punte o colonne C18 STAGE disponibili in commercio. Qui abbiamo descritto il flusso di lavoro per la desassazione dei peptidi utilizzando una punta C18 STAGE. Dopo la dissamatrice, asciugare i peptidi in un concentratore a vuoto.Ricostituire questi peptidi puliti e procedere alla quantificazione utilizzando il metodo Scopes. Per questo, caricare due microlitri del campione in una piastra microgocce e calcolare la concentrazione come mostrato nella diapositiva. La preparazione della lista di transizione è un passo cruciale in un esperimento SRM o MRM.Un elenco di transizione contiene tutte le informazioni richieste dallo spettrometro di massa per monitorare la transizione. Ciò include i valori m per z degli ioni precursore e prodotto, l'energia di collisione della transizione, la polarità dello strumento e l'intervallo di tempo per l'acquisizione dei dati. Preparare l'elenco di transizione utilizzando Skyline.Preparare un proteoma di sfondo utilizzando il file Human Proteome Fasta di UniProt e assicurarsi che sia selezionato nella scheda Sfondo di Impostazioni peptidi. Nella scheda Filtro, impostare una lunghezza minima di 8 e una lunghezza massima di 25. Continuare a utilizzare le impostazioni predefinite se non ci sono altre modifiche nei peptidi.Una volta effettuate le impostazioni peptidiche, fare clic su Impostazioni di transizione. Nella scheda Filtro, impostare i costi precursori su 2 e 3. Impostare le cariche ioniche come 1 e impostare i tipi di ioni su y.Gli ioni prodotto possono essere selezionati in base alla scelta dell'utente. Lasciare tutti i parametri come predefiniti. Ora inserisci gli id di adesione delle proteine target selezionate.Questo può essere fatto facendo clic sulla scheda Modifica, quindi selezionando Inserisci e infine incollando gli ID di adesione. Gli ID saranno mappati alle proteine nel proteoma di sfondo e una lista di transizione creata in base alle impostazioni peptidiche e di transizione impostate in precedenza. Esportare questo elenco di transizione.Assicurarsi che sia selezionato lo strumento giusto facendo clic sull'opzione a discesa Tipo di strumento. In questo caso, lo strumento è Thermo Altis. Poiché l'elenco di transizioni non definito ha troppe transizioni, mantenere un limite di sole 350 transizioni per elenco ed esportare come metodi multipli.Viene utilizzato un sistema a solvente binario. Il solvente A è 1% FA e il solvente B è 80% ACN. Mantenere la portata a 450 microlitro al minuto e il gradiente come mostrato.Impostare la temperatura del compartimento della colonna a 45 gradi Celsius. Per ulteriori dettagli sulla colonna e sul sistema LC, fare riferimento al testo. Assicurarsi che le impostazioni MS nel TSQ Altis siano come mostrato qui.Importare un singolo elenco di transizione per creare un nuovo metodo. Suggeriamo di mantenere la risoluzione per il quadrupolo 1 e il quadrupolo 3 a 7. Questi possono essere ulteriormente ottimizzati se necessario.Per garantire la coerenza delle esecuzioni e di conseguenza la qualità dei dati, preparare la sequenza di esecuzione come illustrato. Inizia con un paio di spazi vuoti, fai riferimento al testo per la composizione della miscela vuota, seguito da un BSA leggero standard QC di concentrazione nota per monitorare qualsiasi variazione nella risposta diurna dello strumento. Il QC fatto dovrebbe essere appena prima dei campioni.Quindi allineare tutti i campioni con spazi vuoti in mezzo. Iniettare volumi uguali di ciascun campione, rappresentando da 25 a 1 nanogrammo di peptidi per iniezione. Per creare un metodo raffinato, eseguire prima i metodi non predefiniti su campioni interi.Importa i risultati in Skyline e controlla manualmente ogni peptide. Per ogni peptide, selezionare un precursore che mostri costantemente buoni picchi in tutti i campioni. Eliminare precursori e peptidi che non mostrano buoni picchi.Assicurati che tutti i picchi siano annotati correttamente. Per selezionare il picco giusto e perfezionare ulteriormente le transizioni sotto ciascun precursore, è possibile utilizzare una libreria. Una libreria è un insieme di dati spettrali MS-MS abbinati a peptidi e transizioni degli attuali dati sperimentali.Selezionare picchi con valori DART P più vicini a 1 e rimuovere le transizioni che non corrispondono alla libreria. Un valore DART P indica la qualità della corrispondenza tra il picco sperimentale e il picco della libreria. Dopo uno o due round di ottimizzazione, un elenco raffinato sarà pronto.Questo elenco raffinato può essere eseguito per singoli campioni. Importa le corse raffinate in Skyline e annota correttamente i picchi. Utilizzare la scheda Annotazione in Impostazioni documento per annotare attentamente ogni esempio nella griglia del documento.Utilizzare la funzionalità Confronto di gruppo per creare confronti tra la condizione 1 e la condizione 2 dell'esperimento. Questo darà una tabella con i valori P regolati e i valori di modifica della piega tra i due gruppi. Per quanto ne scompariamo, questo è il primo studio che impiega l'uso di MRM per rilevare peptidi per le proteine Apolipoproteina A-1, Vimentina e Nicotinamide fosforibosiltransferasi in campioni di tessuto cerebrale umano.L'ottimizzazione di vari parametri come il gradiente LC, il tempo di permanenza, il tempo di ciclo e l'energia di collisione può influenzare notevolmente il successo di un esperimento MRM. Riteniamo che questa tecnica possa essere utilizzata per sviluppare modelli di biomarcatori con capacità di distinguere tra diverse condizioni cliniche e malattie.

Research

JoVE Journal

Biology

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Ricerca

Biologia

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High-throughput Crystallization of Membrane Proteins Using the Lipidic Bicelle Method

Cristallizzazione high-throughput di proteine ​​di membrana con il metodo lipidica Bicelle

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane ...

A Quantitative Fitness Analysis Workflow

A Quantitative Analysis Fitness Workflow

Quantitative Fitness Analysis (QFA) is an experimental and computational workflow for comparing fitnesses of microbial cultures grown in parallel1,2,3,4. ...

Proteomic Sample Preparation from Formalin Fixed and Paraffin Embedded Tissue

Preparazione del campione proteomica dalla fissati in formalina e incluso in paraffina Tissue

Preserved clinical material is a unique source for proteomic investigation of human disorders. Here we describe an optimized protocol allowing large scale ...

Identification of Protein Interaction Partners in Mammalian Cells Using SILAC-immunoprecipitation Quantitative Proteomics

Identificazione delle proteine ​​partner di interazione in cellule di mammifero Uso SILAC-immunoprecipitazione quantitativi Proteomica

Quantitative proteomics combined with immuno-affinity purification, SILAC immunoprecipitation, represent a powerful means for the discovery of novel ...

Selected Reaction Monitoring Mass Spectrometry for Absolute Protein Quantification

Reazione selezionato Monitoraggio spettrometria di massa per Absolute Protein Quantificazione

Absolute quantification of target proteins within complex biological samples is critical to a wide range of research and clinical applications. This ...