Name: quantitative proteomics workflow using multiple reaction monitoring based detection of proteins from human brain tissue
Uploaded: 2021-08-28T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Proteomics Workflow using Multiple Reaction Monitoring Based Detection of Proteins from Human Brain Tissue at JoVE.com

我々は、MHRD-UAYプロジェクト(UCHHATAR AVISHKAR YOJANA)、バイオテクノロジー省(BT/PR13114/INF/22/2015)が支援するIITボンベイのSSおよびMASSFIITB施設へのプロジェクト#34_IITBを認め、MS関連の実験をすべて実施します。
私たちは、ビデオ全体の制作と編集のためのリシャブ・ヤダフ氏とオーディオを編集する彼の仕事のためのニシャント・ネウルカー氏に私たちの特別な感謝を拡張します。

この研究は、ヒト参加者からの脳組織サンプルを含み、TMHとIITB IECによってレビューされ、承認された- (IITB-IEC/2018/019)。参加者は、この研究に参加するための情報と書面による同意を提供しました。
1 脳組織からのタンパク質抽出
<ol><li>約50mgの脳組織の重量を量り、マイクロピペットを使用して300μLの1xリン酸緩衝液生理塩(PBS)で組織を洗浄する。 注:このステップは?...

<ol>
	<li>Picotti, P., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selected+reaction+monitoring-based+proteomics:+Workflows,+potential,+pitfalls+and+future+directions.">Selected reaction monitoring-based proteomics: Workflows, potential, pitfalls and future directions.</a> Nature Methods. , (2012).</li><li>Carr, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+peptide+measurements+in+biology+and+medicine:+Best+practices+for+mass+spectrometry-based+assay+development+using+a+fit-for-purpose+approach.">Targeted peptide measurements in biology and medicine: Best practices for mass spectrometry-based assay development using a fit-for-purpose approach.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 13 (3), 907-917 (2014).</li><li>Pitt, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+and+applications+of+liquid+chromatography-mass+spectrometry+in+clinical+biochemistry.">Principles and applications of liquid chromatography-mass spectrometry in clinical biochemistry.</a> The Clinical biochemist Reviews. 30 (1), 19-34 (2009).</li><li>Hosp, F., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Primer+on+Concepts+and+Applications+of+Proteomics+in+Neuroscience.">A Primer on Concepts and Applications of Proteomics in Neuroscience.</a> Neuron. 96 (3), 558-571 (2017).</li><li>Scopes, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+protein+by+spectrophotometry+at+205+nm.">Measurement of protein by spectrophotometry at 205 nm.</a> Analytical Biochemistry. , (1974).</li><li>Kusebauch, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+SRMAtlas:+A+Resource+of+Targeted+Assays+to+Quantify+the+Complete+Human+Proteome.">Human SRMAtlas: A Resource of Targeted Assays to Quantify the Complete Human Proteome.</a> Cell. , (2016).</li><li>MacLean, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skyline:+an+open+source+document+editor+for+creating+and+analyzing+targeted+proteomics+experiments.">Skyline: an open source document editor for creating and analyzing targeted proteomics experiments.</a> Bioinformatics. 26 (7), 966-968 (2010).</li><li>Gerber, S. A., Rush, J., Stemman, O., Kirschner, M. W., Gygi, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absolute+quantification+of+proteins+and+phosphoproteins+from+cell+lysates+by+tandem+MS.">Absolute quantification of proteins and phosphoproteins from cell lysates by tandem MS.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2003).</li><li>Escher, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+iRT,+a+normalized+retention+time+for+more+targeted+measurement+of+peptides.">Using iRT, a normalized retention time for more targeted measurement of peptides.</a> Proteomics. , (2012).</li><li>Gillette, M. A., Carr, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+peptides+and+proteins+in+biomedicine+by+targeted+mass+spectrometry.">Quantitative analysis of peptides and proteins in biomedicine by targeted mass spectrometry.</a> Nature Methods. 10 (1), 28-34 (2013).</li><li>Whiteaker, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+targeted+proteomics-based+pipeline+for+verification+of+biomarkers+in+plasma.">A targeted proteomics-based pipeline for verification of biomarkers in plasma.</a> Nature Biotechnology. , (2011).</li><li>H&#252;ttenhain, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproducible+quantification+of+cancer-associated+proteins+in+body+fluids+using+targeted+proteomics.">Reproducible quantification of cancer-associated proteins in body fluids using targeted proteomics.</a> Science Translational Medicine. 4 (142), 94 (2012).</li><li>Mermelekas, G., Vlahou, A., Zoidakis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SRM/MRM+targeted+proteomics+as+a+tool+for+biomarker+validation+and+absolute+quantification+in+human+urine.">SRM/MRM targeted proteomics as a tool for biomarker validation and absolute quantification in human urine.</a> Expert Review of Molecular Diagnostics. 15 (11), 1441-1454 (2015).</li><li>Koldamova, R. P., Lefterov, I. M., Lefterova, M. I., Lazo, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apolipoprotein+A-I+directly+interacts+with+amyloid+precursor+protein+and+inhibits+A&#946;+aggregation+and+toxicity.">Apolipoprotein A-I directly interacts with amyloid precursor protein and inhibits A&#946; aggregation and toxicity.</a> Biochemistry. , (2001).</li><li>Jiang, S. X., Slinn, J., Aylsworth, A., Hou, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vimentin+participates+in+microglia+activation+and+neurotoxicity+in+cerebral+ischemia.">Vimentin participates in microglia activation and neurotoxicity in cerebral ischemia.</a> Journal of Neurochemistry. , (2012).</li><li>Liu, L. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nicotinamide+Phosphoribosyltransferase+May+Be+Involved+in+Age-Related+Brain+Diseases.">Nicotinamide Phosphoribosyltransferase May Be Involved in Age-Related Brain Diseases.</a> PLoS ONE. , (2012).</li><li>Abbatiello, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+guidelines+for+publication+of+manuscripts+describing+development+and+application+of+targeted+mass+spectrometry+measurements+of+peptides+and+proteins.">New guidelines for publication of manuscripts describing development and application of targeted mass spectrometry measurements of peptides and proteins.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 16 (3), 327-328 (2017).</li></ol>

免疫体化学や西洋ブロッティングなどの技術は、長年にわたりタンパク質標的の検証のための金の基準と考えられていました。これらの方法は、プロトコルのわずかな変更と技術への依存がほとんどない今日でも使用を見つけ、非常に面倒で退屈です。さらに、バッチ間で常に同じ特異性を示すものではなく、多くの専門知識を必要とする高価な抗体の使用も含まれます。さらに、質量分析?...

過去10年間、質量分析(MS)の急速な発展とクロマトグラフィー技術の理解の向上が、MSベースのプロテオミクスの進歩に大いに役立っています。西洋ブロッティングや免疫組織化学などの分子生物学ベースの技術は、再現性の問題、ターンアラウンドタイムの遅さ、観察者間変動性、タンパク質を正確に定量化できないことに長い間苦しんできました。このことから、高スループットプロテオミクスアプローチの優れた感度は、細胞内のタンパク質の役割をよりよく理解するための代替的で信頼性の高いツールを分子生物学者に提供し続けています。しかし、ショットガンプロテオミクスのアプローチ(データ依存型取得またはDDA)は、多くの場合、機器の感度と分解能に大きく依存しているだけでなく、複雑な組織の低い豊富なタンパク質を検出することができません。ここ数年、世界中のラボは、これらの高度に複雑なデータセットを処理できるコンピューティングパワーと信頼性の高いソフトウェアを必要とするデータ・インディペンデント・アクイジション(DIA)のような技術を開発してきました。しかし、これらのテクニックはまだ進行中の作業であり、あまりユーザーフレンドリーではありません。標的MSベースのプロテオミクスアプローチは、MSアプローチの高スループット性とELISAのような分子生物学アプローチの感度との間で完璧なバランスを提供します。標的質量分析ベースのプロテオミクス実験では、発見ベースの散弾銃プロテオミクス実験または利用可能な文献1、2から仮説駆動のタンパク質またはペプチドを検出することに焦点を当てています。多発反応モニタリング(MRM)は、複雑なサンプルからのタンパク質/ペプチドの正確な検出と定量を行うタンデム四重極質量分析計を使用する、このような標的MSアプローチの1つです。この技術は、低解像度の機器を使用する必要があるにもかかわらず、より高い感度と特異性を提供します。
四重極は4つの平行棒から成り、各棒は斜め反対側の棒に接続される。RF電圧とDC電圧を交互に適用することにより、四重極ロッド間に変動分野が生まれます。四重極内のイオンの軌道は、反対側のロッド間に同じ電圧が存在することによって影響されます。RFを直流電圧に印加することにより、イオンの軌跡を安定化させることができる。それは選択的に特定のイオンを通過させることができる質量フィルターとして使用することを可能にする四重極のこの特性である。必要に応じて、四重極は静的モードまたはスキャンモードで動作させることができます。スタティックモードでは、指定されたm/zを持つイオンのみが通過できるため、そのモードは非常に選択的で、対象のイオンに固有のモードになります。一方、スキャンモードでは、m/z範囲全体のイオンが通過します。したがって、タンデム四重極質量分析計は4つの可能な方法で動作することができます:i)第2のスキャンモードで動作している間、静的モードで動作する最初の四重極。ii)第2の静的モードで動作している間、スキャンモードで動作する最初の四重極。iii)スキャンモードで動作する両方の四極子。とiv)両方の四極子が静的モード3で動作します。典型的なMRM実験では、両方の四重極が静的モードで動作し、断片化後に特定の前駆体および生成された製品を監視することができます。これは、技術が非常に敏感かつ選択的になり、正確な定量化を可能にする。
分子生物学者にとって、人間の脳組織とその細胞は宝庫です。人体の常に興味深い器官のこれらの顕著な単位は、その機能に分子および細胞の洞察を提供することができます。脳組織のプロテオミクスの調査は、健康な脳の全身機能を理解するのに役立つだけでなく、いくつかの疾患によって引き起こされたときに調節が不整合になる細胞経路を理解するのに役立つだけでなく、 4.しかし、そのすべての異質性を持つ脳組織は、分析する非常に複雑な器官であり、分子レベルでの変化をよりよく理解するための協調的なアプローチを必要とします。以下の研究は、脳組織からタンパク質を抽出することから始まる全てのワークフローを説明し、MRMアッセイの方法を作成し、最適化し、標的の検証に向けて説明する(図1)。ここでは、より広範な研究コミュニティに技術とその課題を導入することを目的として、ヒト脳組織を用いたMRMベースの実験の成功に関わる主要なステップを体系的に強調しました。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile (MS grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A/0620/21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>TC194-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Fischer Scienific</td>
			<td>BP510-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid (MS grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>147930250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1149-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol (MS grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Q13827</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Fischer Scienific</td>
			<td>BP214-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol (MS grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A456-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS grade water</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>51140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>TL1006-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Roche Diagnostics</td>
			<td>11873580001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>DF6D661300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCEP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>646547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Merck</td>
			<td>648310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin (MS grade)</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>90058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Merck</td>
			<td>MB1D691237</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Supplies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypersil Gold C18 column</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>25002-102130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipettes</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F167380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stage tips</td>
			<td>MilliPore</td>
			<td>ZTC18M008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zirconia/Silica beads</td>
			<td>BioSpec products</td>
			<td>11079110z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bead beater (Homogeniser)</td>
			<td>Bertin Minilys</td>
			<td>P000673-MLYS0-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader (spectrophotometer)</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>MultiSkan Go</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td>Eutech</td>
			<td>CyberScan pH 510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Probe Sonicator</td>
			<td>Sonics Materials, Inc</td>
			<td>VCX 130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking Drybath</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>88880028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TSQ Altis mass spectrometer</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>TSQ02-10002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>uHPLC - Vanquish</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>VQF01-20001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum concentrator</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>Savant ISS 110</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative proteomics workflow using multiple reaction monitoring based detection of proteins from human brain tissue

過去10年間の人間の脳組織のプロテオミクス分析は、脳の理解を大きく高めています。しかし、脳関連疾患は世界中の死亡の主要な貢献者であり続け、病態生物学をさらに深く理解する必要性が必要です。西洋ブロッティングや免疫体化学などの従来の抗体ベースの技術は、労働集約的で質的または半定量的であることに加えて、低スループットであることに苦しんでいます。従来の質量分析ベースの散弾銃アプローチでさえ、特定の仮説を裏付ける決定的な証拠を提供することができません。標的プロテオミクスアプローチは、主に仮説駆動であり、長く使用されてきた従来の散弾銃プロテオミクスアプローチとは異なります。多発反応監視は、タンデム四重極質量分析計または三重四重極質量分析計と呼ばれる特殊な質量分析計の使用を必要とするそのような標的型アプローチの1つである。今回の研究では、人間の脳組織を用いたタンデム四重極質量分析ベースのプロテオミクスワークフローを成功させ、より広範な研究コミュニティにこのワークフローを導入することを目的として、主要なステップを体系的に強調しました。

脳に異常を持つ患者の各群から10サンプル、5サンプルから3つのタンパク質の相対定量を行った。これらのタンパク質には、脳細胞において多様な役割を果たすことが知られているアポリポプロテインA-I(APOA-I)、ビメンチン(VIM)およびニコチンアミドホスホリン酸化転移酵素(NAMPT)が含まれていた。データの実行後の分析は、Skyline-daily(Ver 20.2.1.286)を使用して実行されました。3つのタンパク質に?...

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Quantitative Proteomics Workflow using Multiple Reaction Monitoring Based Detection of Proteins from Human Brain Tissue

このプロトコルは、臨床サンプルからのタンパク質の多重反応モニタリング(MRM)のための三重四重極質量分析計の使用を導入することを目的としています。我々は、サンプル調製から臨床サンプルのデータ分析に始まる体系的なワークフローを提供し、必要な予防措置をすべて講じています。

ヒト脳組織からのタンパク質の多発反応モニタリングを用いた定量的プロテオミクスワークフロー

The proteomic analysis of the human brain tissue over the last decade has greatly enhanced our understanding of the brain. However, brain related ...

標的型プロテオミクスアプローチは、短期間のプロテオミクスベースの実験や分子生物学ベースの実験からタンパク質を検証するための選択肢として急速になりつつあります。多発反応モニタリングは、生物学的サンプルからタンパク質を検出して定量するためにますます使用されているそのような標的アプローチの1つです。本研究では、MRM実験の基本的な要件を読者に紹介することを目的として、ヒトの脳組織からタンパク質を検出し、定量化する様々なステップを歩いてきた。約50mgの脳組織の重量を量り、300マイクロリットルの1倍のリン酸緩衝生理食塩水で組織を洗う。このステップは、組織の外表面上の任意の血液を除去するために行われ、したがって、できるだけ多くの血液を除去することをお勧めします。PBSでの化水に続いて、組織を含むチューブに300マイクロリットルの溶菌バッファーを加える。氷浴にチューブを保ちながら、プローブ超音波処理器を使用して組織をライゼします。ビーズビーターを使用して組織を均質化し、組織を完全に分解します。チューブの内容物を摂氏4度で15分間15分間遠心分離する。上清を新鮮なチューブに移し、均質に混ぜます。上清の小さなアリコートを取り、標準的なタンパク質アッセイを用いてタンパク質含有量を定量化する。ここでは、ブラッドフォードアッセイを用いたタンパク質推定例を示す。マイクロ遠心分離チューブに50マイクログラムのタンパク質を取り、最終的な濃度が20ミリモルになるようにTCEPを加えることによって内容物を減らします。37度で1時間インキュベートします。インキュベーション後、チューブにヨウ酢酸アセトアミドを添加して還元されたタンパク質をアルキル化し、最終的な濃度が40ミリモルとなる。30分間暗い中でチューブをインキュベートします。今度は、尿素の最終濃度が1モル未満になるように、還元されたアルキル化タンパク質を含むチューブにバッファBを加える。30酵素対タンパク質比に1にトリプシンを加え、一定の揺れで37度で一晩チューブをインキュベートします。消化後、消化したペプチドを真空濃縮器に濃縮する。このステップでは、ペプチドは、再構成して脱塩するか、または将来の使用のためにマイナス80で保存することができます。LC-MS MSにサンプルをロードする前に、脱塩、またはペプチドのクリーンアップが不可欠です。サンプル中の塩やその他の汚染物質は、カラムを詰まらせ、長期的には器具の感度に影響を与える可能性があります。このプロセスは、市販のC18 STAGEチップまたはカラムを使用して実行することができる。ここでは、C18 STAGEチップを用いたペプチド脱塩のワークフローを描いた。脱塩後、真空濃縮器でペプチドを乾燥させます。これらのクリーンペプチドを再構成し、スコープ法を用いて定量化を進める。このために、サンプルの2マイクロリットルをマイクロドロッププレートにロードし、スライドに示すように濃度を計算します。移行リストの準備は、SRM または MRM 実験の重要なステップです。遷移リストには、質量分析計が遷移を監視するために必要なすべての情報が含まれています。これには、前駆体および生成物イオンのm x z値、遷移の衝突エネルギー、装置の極性、およびデータ取得の時間範囲が含まれる。スカイラインを使用して、遷移リストを準備します。UniProtのヒューマンプロテオームファスタファイルを使用してバックグラウンドプロテオームを準備し、ペプチド設定の[背景]タブで選択されていることを確認します。[フィルタ]タブで、最小長を 8、最大長を 25 に設定します。ペプチドに他の変更がない場合は、デフォルト設定を使用し続けます。ペプチドの設定が完了したら、トランジション設定をクリックします。[フィルタ]タブで、[前駆体料金]を 2 と 3 に設定します。イオン料金を 1 に設定し、Ion タイプを y に設定します。製品イオンは、ユーザーの選択に応じて選択することができます。すべてのパラメータをデフォルトのままにします。ここで、選択したターゲットタンパク質の受取 ID を挿入します。これは、[編集]タブをクリックし、[挿入]を選択して、最後にアクセスIDを貼り付ける方法で行うことができます。IDは、バックグラウンドプロテオーム内のタンパク質にマッピングされ、先に設定したペプチドと遷移設定に基づいて作成された遷移リストが作成されます。この遷移リストをエクスポートします。[インストゥルメントタイプ]ドロップダウンオプションをクリックして、適切な計測器が選択されていることを確認します。この場合、器械はサーモアルティスである。未定義の遷移リストの遷移数が多すぎるため、リストごとに 350 回の遷移の制限を保持し、複数のメソッドとしてエクスポートします。バイナリー溶媒システムが使用されます。溶媒Aは1%FA、溶媒Bは80%ACNである。流量を毎分450マイクロリットル、勾配を示すように保ちます。カラムコンパートメント温度を摂氏45度に設定します。列および LC システムの詳細については、テキストを参照してください。TSQ Altis の MS 設定がここに示されていることを確認します。単一の遷移リストをインポートして、新しいメソッドを作成します。四重極1と四重極3の解像度を7に保つことを提案します。必要に応じて、これらをさらに最適化できます。実行の一貫性と結果的にデータ品質を確保するには、次に示すように実行シーケンスを準備します。ブランクのカップルから始めて、ブランク混合物の組成のテキストを参照し、続いて既知の濃度のQC標準光BSAを参照して、機器の日単位応答の変動を監視する。QCはサンプルの直前に行う必要があります。次に、すべてのサンプルを間にブランクで並べて表示します。各サンプルの等量を注入し、1回の注射につき25~1ナノグラムのペプチドを考慮する。洗練されたメソッドを作成するには、最初にサンプル全体に対して未定義のメソッドを実行します。結果をスカイラインにインポートし、各ペプチドを手動で確認します。ペプチドごとに、全てのサンプルにおいて一貫して良好なピークを示す前駆体を1つ選択する。良好なピークを示していない前駆体とペプチドを削除します。.すべてのピークに適切なアポイントトが設定されていることを確認します。右のピークを選択し、各前駆体の下の遷移をさらに細かくするために、ライブラリを使用できます。ライブラリは、現在の実験データのペプチドと遷移と一致するMS-MSスペクトルデータのセットです。DART P値が1近いピークを選択し、ライブラリに一致しないトランジションを削除します。DART P値は、実験ピークとライブラリピークの間でのマッチの良さを示します。最適化の1つまたは2つのラウンドの後、洗練されたリストが準備されます。この絞り込みリストは、個々のサンプルに対して実行できます。洗練されたランをスカイラインにインポートし、ピークに適切にアポイントする。ドキュメント グリッドの各サンプルに注意して注釈を付けるには、[ドキュメントの設定] の下にある [注釈] タブを使用します。グループ比較機能を使用して、実験の条件 1 と条件 2 の比較を作成します。これにより、調整されたP値を持つテーブルが与え、2つのグループ間で値を折り畳みます。私たちの知る限りでは、これは、ヒト脳組織サンプル中のアポリポタンパク質A-1、ビメンチン、ニコチンアミドホスホリボシルトランスファーゼのタンパク質のペプチドを検出するためにMRMを使用した最初の研究です。LC勾配、ドウェル時間、サイクルタイム、衝突エネルギーなどのさまざまなパラメータを最適化すると、MRM実験の成功に大きく影響します。この技術は、異なる臨床状態と疾患を区別する能力を持つバイオマーカーのパターンを開発するために使用できると考えています。

Research

JoVE Journal

Biology

A Chromatin Assay for Human Brain Tissue

人間の脳組織のためのクロマチンアッセイ

Chronic neuropsychiatric illnesses such as schizophrenia, bipolar disease and autism are thought to result from a combination of genetic and environmental ...

Neuronal Nuclei Isolation from Human Postmortem Brain Tissue

人間の死後の脳組織から神経細胞核の単離

Neurons in the human brain become postmitotic largely during prenatal development, and thus maintain their nuclei throughout the full lifespan. However, ...

Monitoring Acupuncture Effects on Human Brain by fMRI

fMRIによるヒト脳機能に対する鍼の効果のモニタリング

Functional MRI is used to study the effects of acupuncture on the BOLD response and the functional connectivity of the human brain.  Results demonstrate ...

Identification of protein complexes with quantitative proteomics in S. cerevisiae

S. cerevisiaeの定量的プロテオミクスとタンパク質の複合体の同定

Lipids are the building blocks of cellular membranes that function as barriers and in compartmentalization of cellular processes, and recently, as ...

Obtaining High Quality RNA from Single Cell Populations in Human Postmortem Brain Tissue

人間の死後の脳組織における単一細胞から、高品質のRNAを取得

We proposed to investigate the gray matter reduction in the superior temporal gyrus seen in schizophrenia patients, by interrogating gene expression ...

High-throughput Crystallization of Membrane Proteins Using the Lipidic Bicelle Method

脂質Bicelle法を用いた膜タンパク質のハイスループット結晶化

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane ...

A Quantitative Fitness Analysis Workflow

定量的なフィットネスの分析ワークフロー

Quantitative Fitness Analysis (QFA) is an experimental and computational workflow for comparing fitnesses of microbial cultures grown in parallel1,2,3,4. ...

Proteomic Sample Preparation from Formalin Fixed and Paraffin Embedded Tissue

ホルマリン固定からプロテオミクスサンプル調製およびパラフィン包埋組織

Preserved clinical material is a unique source for proteomic investigation of human disorders. Here we describe an optimized protocol allowing large scale ...

Identification of Protein Interaction Partners in Mammalian Cells Using SILAC-immunoprecipitation Quantitative Proteomics

SILAC免疫沈降定量的プロテオミクスを用いて哺乳動物細胞におけるタンパク質相互作用パートナーの同定

Quantitative proteomics combined with immuno-affinity purification, SILAC immunoprecipitation, represent a powerful means for the discovery of novel ...

Selected Reaction Monitoring Mass Spectrometry for Absolute Protein Quantification

絶対タンパク質定量のための質量分析法を選択反応モニタリング

Absolute quantification of target proteins within complex biological samples is critical to a wide range of research and clinical applications. This ...