Name: quantitative proteomics workflow using multiple reaction monitoring based detection of proteins from human brain tissue
Uploaded: 2021-08-28T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Proteomics Workflow using Multiple Reaction Monitoring Based Detection of Proteins from Human Brain Tissue at JoVE.com

Vi anerkjenner MHRD-UAY Project (UCHHATAR AVISHKAR YOJANA), prosjekt #34_IITB til SS og MASSFIITB Facility ved IIT Bombay støttet av Institutt for bioteknologi (BT/PR13114/INF/22/206/2015) for å utføre alle MS-relaterte eksperimenter.
Vi utvider vår spesielle takk til Mr. Rishabh Yadav for å lage og redigere hele videoen og Mr. Nishant Nerurkar for hans arbeid med å redigere lyden.

Denne studien involverer hjernevevsprøver fra menneskelige deltakere, gjennomgått og godkjent av TMH og IITB IEC - (IITB-IEC/2018/019). Deltakerne ga sitt informerte og skriftlige samtykke til å delta i denne studien.
1 Proteinekstraksjon fra hjernevev
<ol><li>Vei rundt 50 mg hjernevev og vask vevet med 300 μL 1x fosfatbuffer saltvann (PBS) ved hjelp av en mikropipette. MERK: Dette trinnet utføres for å fjerne blod på vevets ytre overflate og må gjentas om nødvendig. Det anbefale...

<ol>
	<li>Picotti, P., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selected+reaction+monitoring-based+proteomics:+Workflows,+potential,+pitfalls+and+future+directions.">Selected reaction monitoring-based proteomics: Workflows, potential, pitfalls and future directions.</a> Nature Methods. , (2012).</li><li>Carr, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+peptide+measurements+in+biology+and+medicine:+Best+practices+for+mass+spectrometry-based+assay+development+using+a+fit-for-purpose+approach.">Targeted peptide measurements in biology and medicine: Best practices for mass spectrometry-based assay development using a fit-for-purpose approach.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 13 (3), 907-917 (2014).</li><li>Pitt, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+and+applications+of+liquid+chromatography-mass+spectrometry+in+clinical+biochemistry.">Principles and applications of liquid chromatography-mass spectrometry in clinical biochemistry.</a> The Clinical biochemist Reviews. 30 (1), 19-34 (2009).</li><li>Hosp, F., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Primer+on+Concepts+and+Applications+of+Proteomics+in+Neuroscience.">A Primer on Concepts and Applications of Proteomics in Neuroscience.</a> Neuron. 96 (3), 558-571 (2017).</li><li>Scopes, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+protein+by+spectrophotometry+at+205+nm.">Measurement of protein by spectrophotometry at 205 nm.</a> Analytical Biochemistry. , (1974).</li><li>Kusebauch, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+SRMAtlas:+A+Resource+of+Targeted+Assays+to+Quantify+the+Complete+Human+Proteome.">Human SRMAtlas: A Resource of Targeted Assays to Quantify the Complete Human Proteome.</a> Cell. , (2016).</li><li>MacLean, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skyline:+an+open+source+document+editor+for+creating+and+analyzing+targeted+proteomics+experiments.">Skyline: an open source document editor for creating and analyzing targeted proteomics experiments.</a> Bioinformatics. 26 (7), 966-968 (2010).</li><li>Gerber, S. A., Rush, J., Stemman, O., Kirschner, M. W., Gygi, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absolute+quantification+of+proteins+and+phosphoproteins+from+cell+lysates+by+tandem+MS.">Absolute quantification of proteins and phosphoproteins from cell lysates by tandem MS.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2003).</li><li>Escher, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+iRT,+a+normalized+retention+time+for+more+targeted+measurement+of+peptides.">Using iRT, a normalized retention time for more targeted measurement of peptides.</a> Proteomics. , (2012).</li><li>Gillette, M. A., Carr, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+peptides+and+proteins+in+biomedicine+by+targeted+mass+spectrometry.">Quantitative analysis of peptides and proteins in biomedicine by targeted mass spectrometry.</a> Nature Methods. 10 (1), 28-34 (2013).</li><li>Whiteaker, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+targeted+proteomics-based+pipeline+for+verification+of+biomarkers+in+plasma.">A targeted proteomics-based pipeline for verification of biomarkers in plasma.</a> Nature Biotechnology. , (2011).</li><li>H&#252;ttenhain, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproducible+quantification+of+cancer-associated+proteins+in+body+fluids+using+targeted+proteomics.">Reproducible quantification of cancer-associated proteins in body fluids using targeted proteomics.</a> Science Translational Medicine. 4 (142), 94 (2012).</li><li>Mermelekas, G., Vlahou, A., Zoidakis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SRM/MRM+targeted+proteomics+as+a+tool+for+biomarker+validation+and+absolute+quantification+in+human+urine.">SRM/MRM targeted proteomics as a tool for biomarker validation and absolute quantification in human urine.</a> Expert Review of Molecular Diagnostics. 15 (11), 1441-1454 (2015).</li><li>Koldamova, R. P., Lefterov, I. M., Lefterova, M. I., Lazo, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apolipoprotein+A-I+directly+interacts+with+amyloid+precursor+protein+and+inhibits+A&#946;+aggregation+and+toxicity.">Apolipoprotein A-I directly interacts with amyloid precursor protein and inhibits A&#946; aggregation and toxicity.</a> Biochemistry. , (2001).</li><li>Jiang, S. X., Slinn, J., Aylsworth, A., Hou, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vimentin+participates+in+microglia+activation+and+neurotoxicity+in+cerebral+ischemia.">Vimentin participates in microglia activation and neurotoxicity in cerebral ischemia.</a> Journal of Neurochemistry. , (2012).</li><li>Liu, L. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nicotinamide+Phosphoribosyltransferase+May+Be+Involved+in+Age-Related+Brain+Diseases.">Nicotinamide Phosphoribosyltransferase May Be Involved in Age-Related Brain Diseases.</a> PLoS ONE. , (2012).</li><li>Abbatiello, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+guidelines+for+publication+of+manuscripts+describing+development+and+application+of+targeted+mass+spectrometry+measurements+of+peptides+and+proteins.">New guidelines for publication of manuscripts describing development and application of targeted mass spectrometry measurements of peptides and proteins.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 16 (3), 327-328 (2017).</li></ol>

Teknikker som immunhiistokjemi og vestlig blotting ble ansett som gullstandardene for validering av proteinmål i mange år. Disse metodene finner bruk selv i dag med mindre modifikasjoner i protokollen og liten avhengighet av teknologi som gjør dem svært tungvinte og kjedelige. Foruten dette innebærer de også bruk av dyre antistoffer som ikke alltid viser samme spesifisitet på tvers av partier og krever mye kompetanse. I tillegg har bare en liten brøkdel av proteiner identifisert ved hjelp av høy gjennomstrømni...

I løpet av det siste tiåret har den raske utviklingen innen massespektrometri (MS) kombinert med økt forståelse av kromatografiteknikker i stor grad bidratt til å fremme MS-basert proteomikk. Molekylærbiologibaserte teknikker som vestlig blotting og immunhiistokjemi har lenge lidd av reproduserbarhetsproblemer, langsom behandlingstid, variasjon mellom observatører og deres manglende evne til å kvantifisere proteiner nøyaktig, for å nevne noen. For dette formål fortsetter den overlegne følsomheten til proteomikk med høy gjennomstrømning å tilby molekylærbiologer et alternativt og mer pålitelig verktøy i deres søken etter å bedre forstå rollene til proteiner i celler. Imidlertid klarer hagleproteomikk tilnærminger (Dataavhengig oppkjøp eller DDA) ofte ikke å oppdage lave rikelige proteiner i komplekse vev i tillegg til å være sterkt avhengig av instrumentets følsomhet og oppløsning. I løpet av de siste par årene har laboratorier over hele verden utviklet teknikker som Data Independent Acquisition (DIA) som krever økt datakraft og pålitelig programvare som kan håndtere disse svært komplekse datasettene. Imidlertid er disse teknikkene fortsatt et arbeid som pågår og ikke veldig brukervennlig. Målrettede MS-baserte proteomikktilnærminger gir en perfekt balanse mellom ms-tilnærmingenes høye gjennomstrømning og følsomheten til molekylærbiologiske tilnærminger som ELISA. Et målrettet massespektrometribasert proteomikkeksperiment fokuserer på å oppdage hypotesedrevne proteiner eller peptider fra oppdagelsesbaserte hagleproteomikkeksperimenter eller gjennom tilgjengelig litteratur1,2. Multiple Reaction Monitoring (MRM) er en slik målrettet MS-tilnærming som bruker et tandem quadrupole massespektrometer for nøyaktig deteksjon og kvantifisering av proteiner / peptider fra komplekse prøver. Teknikken gir høyere følsomhet og spesifisitet til tross for at det kreves bruk av et instrument med lav oppløsning.
En quadrupole er laget av 4 parallelle stenger, med hver stang koblet til den diagonalt motsatte stangen. Et varierende felt opprettes mellom quadrupole stengene ved å bruke vekslende RF- og DC-spenninger. Banen til ionene inne i quadrupole påvirkes av tilstedeværelsen av de samme spenningene over motsatte stenger. Ved å bruke RF på DC-spenning, kan banen til ionene stabiliseres. Det er denne egenskapen til quadrupole som gjør at den kan brukes som et massefilter som selektivt kan la spesifikke ioner passere gjennom. Avhengig av behovet kan en quadrupole betjenes enten i statisk modus eller skannemodus. Den statiske modusen tillater bare ioner med en spesifisert m / z å passere gjennom, noe som gjør modusen svært selektiv og spesifikk for ion av interesse. Skannemodusen derimot gjør at ioner over hele m / z-området kan passere gjennom. Dermed kan tandem quadrupole massespektrometre fungere på 4 mulige måter: i) den første quadrupole som opererer i statisk modus mens den andre opererer i skannemodus; ii) den første quadrupole som opererer i skannemodus mens den andre opererer i statisk modus; iii) begge quadrupoles som opererer i skannemodus; og iv) begge quadrupoles som opererer i statisk modus3. I et typisk MRM-eksperiment opererer begge quadrupoles i statisk modus, slik at spesifikke forløpere og deres resulterende produkter etter fragmentering kan overvåkes. Dette gjør teknikken svært følsom og selektiv, noe som gir nøyaktig kvantifisering.
For molekylærbiologer er det menneskelige hjernevevet og dets celler en skattekiste. Disse bemerkelsesverdige enhetene i et stadig interessant organ i menneskekroppen kan gi molekylær og cellulær innsikt i dens funksjon. Proteomiske undersøkelser av hjernevevet kan ikke bare hjelpe oss med å forstå den systemiske funksjonen til en sunn hjerne, men også de cellulære veiene som blir dysregulert når de påføres av en eller annen sykdom4. Imidlertid er hjernevevet med all sin heterogenitet et svært komplekst organ å analysere og krever en samordnet tilnærming for en bedre forståelse av endringene på molekylært nivå. Følgende arbeid beskriver hele arbeidsflyten som starter helt fra å trekke ut proteiner fra hjernevev, skape og optimalisere metodene for MRM-analyse, til validering av målene (Figur 1). Her har vi systematisk fremhevet de viktigste trinnene som er involvert i et vellykket MRM-basert eksperiment ved hjelp av menneskelig hjernevev med sikte på å introdusere teknikken og dens utfordringer for et bredere forskningsmiljø.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile (MS grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A/0620/21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>TC194-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Fischer Scienific</td>
			<td>BP510-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid (MS grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>147930250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1149-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol (MS grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Q13827</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Fischer Scienific</td>
			<td>BP214-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol (MS grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A456-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS grade water</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>51140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>TL1006-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Roche Diagnostics</td>
			<td>11873580001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>DF6D661300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCEP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>646547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Merck</td>
			<td>648310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin (MS grade)</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>90058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Merck</td>
			<td>MB1D691237</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Supplies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypersil Gold C18 column</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>25002-102130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipettes</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F167380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stage tips</td>
			<td>MilliPore</td>
			<td>ZTC18M008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zirconia/Silica beads</td>
			<td>BioSpec products</td>
			<td>11079110z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bead beater (Homogeniser)</td>
			<td>Bertin Minilys</td>
			<td>P000673-MLYS0-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader (spectrophotometer)</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>MultiSkan Go</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td>Eutech</td>
			<td>CyberScan pH 510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Probe Sonicator</td>
			<td>Sonics Materials, Inc</td>
			<td>VCX 130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking Drybath</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>88880028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TSQ Altis mass spectrometer</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>TSQ02-10002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>uHPLC - Vanquish</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>VQF01-20001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum concentrator</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>Savant ISS 110</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative proteomics workflow using multiple reaction monitoring based detection of proteins from human brain tissue

Den proteomiske analysen av det menneskelige hjernevevet det siste tiåret har i stor grad forbedret vår forståelse av hjernen. Imidlertid fortsetter hjernerelaterte lidelser å være en stor bidragsyter til dødsfall rundt om i verden, noe som nødvendiggjør behovet for enda større forståelse av deres patobiologi. Tradisjonelle antistoffbaserte teknikker som vestlig blotting eller immunhiistokjemi lider av å være lavgjennomstrømning i tillegg til å være arbeidsintensiv og kvalitativ eller semi-kvantitativ. Selv konvensjonelle massespektrometribaserte hagletilnærminger klarer ikke å gi avgjørende bevis for å støtte en viss hypotese. Målrettede proteomikktilnærminger er i stor grad hypotesedrevne og skiller seg fra de konvensjonelle hagleproteomikktilnærmingene som har vært lenge i bruk. Multippel reaksjonsovervåking er en slik målrettet tilnærming som krever bruk av et spesielt massespektrometer kalt tandem quadrupole massespektrometer eller trippel quadrupole massespektrometer. I den nåværende studien har vi systematisk fremhevet de viktigste trinnene som er involvert i å utføre en vellykket tandem quadrupole massespektrometribasert proteomisk arbeidsflyt ved hjelp av menneskelig hjernevev med sikte på å introdusere denne arbeidsflyten til et bredere forskningsmiljø.

Vi utførte relativ kvantifisering av 3 proteiner fra 10 prøver, 5 prøver fra hver gruppe pasienter med abnormiteter i hjernen. Disse proteinene inkluderte Apolipoprotein A-I (APOA-I), Vimentin (VIM) og Nicotinamid phosphoribosyltransferase (NAMPT) som er kjent for å utføre forskjellige roller i hjernecellene. Etterkjøringsanalyse av dataene ble utført ved hjelp av Skyline-daily (Ver 20.2.1.286). Totalt 10 peptider tilsvarende 3 proteiner ble overvåket. Disse inkluderte 3 peptider for APOA-I, 4 peptider for VIM og...

Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Proteomics Workflow using Multiple Reaction Monitoring Based Detection of Proteins from Human Brain Tissue at JoVE.com

Quantitative Proteomics Workflow using Multiple Reaction Monitoring Based Detection of Proteins from Human Brain Tissue

Protokollen tar sikte på å introdusere bruken av et trippel quadrupole massespektrometer for multippel reaksjonsovervåking (MRM) av proteiner fra kliniske prøver. Vi har levert en systematisk arbeidsflyt som starter fra prøvepreparering til dataanalyse for kliniske prøver med alle nødvendige forholdsregler som skal tas.

Kvantitativ proteomisk arbeidsflyt ved hjelp av flerreaksjonsovervåkingsbasert påvisning av proteiner fra humant hjernevev

The proteomic analysis of the human brain tissue over the last decade has greatly enhanced our understanding of the brain. However, brain related ...

Målrettede proteomiske tilnærminger blir raskt den valgte metoden for validering av proteiner fra kortsiktige proteomiske eksperimenter eller fra molekylærbiologiske eksperimenter. Multippel reaksjonsovervåking er en slik målrettet tilnærming som i økende grad brukes til å oppdage og kvantifisere proteiner fra biologiske prøver. I denne studien har vi gått gjennom de ulike trinnene som er involvert i å oppdage og kvantifisere proteiner fra menneskelig hjernevev med den hensikt å introdusere leserne til de grunnleggende kravene til et MRM-eksperiment.Vei rundt 50 mg hjernevev, og vask vevet med 300 mikroliter 1x fosfatbufret saltvann. Dette trinnet utføres for å fjerne blod på vevets ytre overflate, og derfor er det tilrådelig å fjerne så mye blod som mulig. Etter vask med PBS, tilsett 300 mikroliter lysisbuffer til røret som inneholder vevet.Lyse vevet ved hjelp av en sonde soniker mens du holder røret på et isbad. Fortsett med vev homogenisering ved hjelp av en perle beater for å fullstendig lyse vevet. Sentrifuger innholdet i røret ved 6000 g i 15 minutter ved fire grader celsius.Overfør supernatanten til et friskt rør og bland homogent. Ta en liten aliquot av supernatanten, og kvantifisere proteininnholdet ved hjelp av en standard proteinanalyse. Her viser vi et eksempel på proteinestimering ved hjelp av Bradford Assay.Ta 50 mikrogram protein i et mikrocentrifugerør og reduser innholdet ved å legge til TCEP slik at den endelige konsentrasjonen er 20 millimolar. Inkuber innholdet ved 37 grader i en time. Etter inkubasjon, alkylat de reduserte proteinene ved å legge iodoacetamid til røret, slik at den endelige konsentrasjonen er 40 millimolar.Inkuber røret i mørket i 30 minutter. Legg nå Buffer B til røret inneholdt de reduserte og alkylerte proteinene slik at den endelige konsentrasjonen av urea er mindre enn en molar. Tilsett trypsin i 1 som til 30 enzym-til-protein-forhold og inkuber rørene over natten ved 37 grader med konstant risting.Etter fordøyelsen konsentrerer du de fordøyde peptidene i en vakuumkonsentrator. På dette trinnet kan peptidene enten rekonstitueres og desalteres eller lagres ved minus 80 for fremtidig bruk. Desalting, eller peptidopprydding, er viktig før du laster inn prøvene på en LC-MS MS. Salter og andre forurensninger i prøven kan tette kolonnen og påvirke instrumentets følsomhet i det lange løp.Denne prosessen kan utføres ved hjelp av kommersielt tilgjengelige C18 STAGE-tips eller -kolonner. Her har vi avbildet arbeidsflyten for peptidforsalting ved hjelp av et C18 STAGE-tips. Tørk peptidene i en vakuumkonsentrator etter avsalting.Rekonstituer disse rene peptidene og fortsett med kvantifisering ved hjelp av Scopes-metoden. For dette, last to mikroliter av prøven i en mikrodrop plate og beregne konsentrasjonen som vist i lysbildet. Forberedelse av overgangsliste er et avgjørende skritt i et SRM- eller MRM-eksperiment.En overgangsliste inneholder all informasjonen som kreves av massespektrometeret for å overvåke overgangen. Dette inkluderer m by z-verdiene til forløperen og produktionene, kollisjonsenergien til overgangen, instrumentets polaritet og tidsområdet for datainnsamling. Klargjør overgangslisten ved hjelp av Skyline.Forbered en bakgrunnsproteom ved hjelp av Human Proteome Fasta-filen fra UniProt, og kontroller at den er valgt under Bakgrunn-fanen i Peptide Settings. I kategorien Filter angir du en minimumslengde på 8 og maksimumslengden på 25. Fortsett å bruke standardinnstillingene hvis det ikke er andre endringer i peptidene.Når peptidinnstillingene er gjort, klikker du på Overgangsinnstillinger. Under kategorien Filter angir du Forløperkostnader som 2 og 3. Sett Ion-ladninger som 1 og sett Ion-typer til y.Produktioner kan velges avhengig av brukerens valg. La alle parameterne være standard. Sett nå inn tiltredelses-IDene til de valgte målproteinene.Dette kan gjøres ved å klikke på Rediger-fanen og deretter velge Sett inn og til slutt lime inn tiltredelses-IDene. IDene vil bli kartlagt til proteinene i bakgrunnsproteomet og en overgangsliste opprettet basert på peptid- og overgangsinnstillingene som ble angitt tidligere. Eksporter denne overgangslisten.Kontroller at riktig instrument er valgt ved å klikke på rullegardinmenyen Instrumenttype. I dette tilfellet er instrumentet Thermo Altis. Siden den udefinerte overgangslisten har for mange overganger, beholder du bare en grense på 350 overganger per liste og eksporterer som flere metoder.Et binært løsningsmiddelsystem brukes. Løsningsmiddel A er 1%FA og Løsningsmiddel B er 80%ACN. Hold strømningshastigheten på 450 mikroliter per minutt og gradienten som vist.Still inn temperaturen på søylerommet ved 45 grader Celsius. Hvis du vil ha mer informasjon om kolonne- og LC-system, kan du se tekst. Kontroller at MS-innstillingene i TSQ Altis er som vist her.Importer en enkelt overgangsliste for å opprette en ny metode. Vi foreslår å beholde oppløsningen for quadrupole 1 og quadrupole 3 ved 7. Disse kan optimaliseres ytterligere om nødvendig.For å sikre konsekvens i kjøringer og dermed datakvaliteten, klargjør du kjøresekvensen som vist. Start med et par emner, referer til teksten for sammensetning av blank blanding, etterfulgt av en QC standard lys BSA av kjent konsentrasjon for å overvåke enhver variasjon i instrumentets dagvise respons. QC gjort bør være like før prøvene.Neste linje opp alle eksemplene med mellomrom i mellom. Injiser like store mengder av hver prøve, som utgjør 25 til 1 nanogram peptider per injeksjon. Hvis du vil lage en raffinert metode, må du først kjøre de udefinerte metodene mot hele utvalg.Importer resultatene til Skyline og kontroller hvert peptid manuelt. For hvert peptid velger du en forløper som viser konsekvent gode topper i alle prøvene. Slett forløpere og peptider som ikke viser gode topper.Kontroller at alle toppene er riktig kommentert. For å velge riktig topp og ytterligere finjustere overgangene under hver forløper, kan et bibliotek brukes. Et bibliotek er et sett med MS-MS spektraldata som samsvarer med peptider og overganger av gjeldende eksperimentelle data.Velg topper som har DART P-verdier nærmere 1, og fjern overganger som ikke samsvarer med biblioteket. En DART P-verdi angir hvor god kampen er mellom den eksperimentelle toppen og bibliotektoppen. Etter en eller to runder med optimalisering vil en raffinert liste være klar.Denne raffinerte listen kan kjøres for individuelle prøver. Importer de raffinerte løpene til Skyline og kommenter topper på riktig måte. Bruk kategorien Merknad under Dokumentinnstillinger til å sette inn merknader i hvert eksempel i dokumentrutenettet nøye.Bruk funksjonen Gruppesammenligning til å opprette sammenligninger mellom betingelse 1 og betingelse 2 i eksperimentet. Dette gir tabell med justerte P-verdier og brette endringsverdier mellom de to gruppene. Så vidt vi vet, er dette den første studien som benytter bruk av MRM for å oppdage peptider for proteinene Apolipoprotein A-1, Vimentin og Nicotinamide fosphoribosyltransferase i humane hjernevevsprøver.Optimalisering av ulike parametere som LC-gradient, oppholdstid, syklustid og kollisjonsenergi kan i stor grad påvirke suksessen til et MRM-eksperiment. Vi tror at denne teknikken kan brukes til å utvikle mønstre av biomarkører med evne til å skille mellom ulike kliniske forhold og sykdommer.

Research

JoVE Journal

Biology

A Chromatin Assay for Human Brain Tissue

Chronic neuropsychiatric illnesses such as schizophrenia, bipolar disease and autism are thought to result from a combination of genetic and environmental ...

Neuronal Nuclei Isolation from Human Postmortem Brain Tissue

Neurons in the human brain become postmitotic largely during prenatal development, and thus maintain their nuclei throughout the full lifespan. However, ...

Monitoring Acupuncture Effects on Human Brain by fMRI

Functional MRI is used to study the effects of acupuncture on the BOLD response and the functional connectivity of the human brain.  Results demonstrate ...

Identification of protein complexes with quantitative proteomics in S. cerevisiae

Lipids are the building blocks of cellular membranes that function as barriers and in compartmentalization of cellular processes, and recently, as ...

Obtaining High Quality RNA from Single Cell Populations in Human Postmortem Brain Tissue

We proposed to investigate the gray matter reduction in the superior temporal gyrus seen in schizophrenia patients, by interrogating gene expression ...

High-throughput Crystallization of Membrane Proteins Using the Lipidic Bicelle Method

High-throughput krystallisering av membran proteiner Bruke Lipidic Bicelle Method

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane ...

A Quantitative Fitness Analysis Workflow

En kvantitativ fitnessanalyse Workflow

Quantitative Fitness Analysis (QFA) is an experimental and computational workflow for comparing fitnesses of microbial cultures grown in parallel1,2,3,4. ...

Proteomic Sample Preparation from Formalin Fixed and Paraffin Embedded Tissue

Proteomikk Prøvepreparering fra formalinfiksert og parafin Embedded Tissue

Preserved clinical material is a unique source for proteomic investigation of human disorders. Here we describe an optimized protocol allowing large scale ...

Identification of Protein Interaction Partners in Mammalian Cells Using SILAC-immunoprecipitation Quantitative Proteomics

Identifisering av protein interaksjon Partnere i pattedyrceller Bruke SILAC-immunoprecipitation Kvantitative Proteomikk

Quantitative proteomics combined with immuno-affinity purification, SILAC immunoprecipitation, represent a powerful means for the discovery of novel ...

Selected Reaction Monitoring Mass Spectrometry for Absolute Protein Quantification

Valgt Reaction Monitoring massespektrometri for Absolute Protein Kvantifisering

Absolute quantification of target proteins within complex biological samples is critical to a wide range of research and clinical applications. This ...