Name: quantitative proteomics workflow using multiple reaction monitoring based detection of proteins from human brain tissue
Uploaded: 2021-08-28T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Proteomics Workflow using Multiple Reaction Monitoring Based Detection of Proteins from Human Brain Tissue at JoVE.com

Reconhecemos o Projeto MHRD-UAY (UCHHATAR AVISHKAR YOJANA), projeto #34_IITB ao SS e ao MASSFIITB Facility na IIT Bombay apoiado pelo Departamento de Biotecnologia (BT/PR13114/INF/22/206/2015) para realizar todos os experimentos relacionados ao MS.
Estendemos nossos agradecimentos especiais ao Sr. Rishabh Yadav por fazer e editar todo o vídeo e o Sr. Nishant Nerurkar por seu trabalho na edição do áudio.

Este estudo envolve amostras de tecido cerebral de participantes humanos, revisadas e aprovadas pela TMH e IITB IEC - (IITB-IEC/2018/019). Os participantes forneceram seu consentimento informado e por escrito para participar deste estudo.
1 Extração de proteínas do tecido cerebral
<ol><li>Pesar cerca de 50 mg de tecido cerebral e lavar o tecido com 300 μL de soro fisiológico tampão de fosfato de 1x (PBS) usando uma micropipette. NOTA: Esta etapa é realizada para remover qualquer sa...

<ol>
	<li>Picotti, P., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selected+reaction+monitoring-based+proteomics:+Workflows,+potential,+pitfalls+and+future+directions.">Selected reaction monitoring-based proteomics: Workflows, potential, pitfalls and future directions.</a> Nature Methods. , (2012).</li><li>Carr, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+peptide+measurements+in+biology+and+medicine:+Best+practices+for+mass+spectrometry-based+assay+development+using+a+fit-for-purpose+approach.">Targeted peptide measurements in biology and medicine: Best practices for mass spectrometry-based assay development using a fit-for-purpose approach.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 13 (3), 907-917 (2014).</li><li>Pitt, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+and+applications+of+liquid+chromatography-mass+spectrometry+in+clinical+biochemistry.">Principles and applications of liquid chromatography-mass spectrometry in clinical biochemistry.</a> The Clinical biochemist Reviews. 30 (1), 19-34 (2009).</li><li>Hosp, F., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Primer+on+Concepts+and+Applications+of+Proteomics+in+Neuroscience.">A Primer on Concepts and Applications of Proteomics in Neuroscience.</a> Neuron. 96 (3), 558-571 (2017).</li><li>Scopes, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+protein+by+spectrophotometry+at+205+nm.">Measurement of protein by spectrophotometry at 205 nm.</a> Analytical Biochemistry. , (1974).</li><li>Kusebauch, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+SRMAtlas:+A+Resource+of+Targeted+Assays+to+Quantify+the+Complete+Human+Proteome.">Human SRMAtlas: A Resource of Targeted Assays to Quantify the Complete Human Proteome.</a> Cell. , (2016).</li><li>MacLean, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skyline:+an+open+source+document+editor+for+creating+and+analyzing+targeted+proteomics+experiments.">Skyline: an open source document editor for creating and analyzing targeted proteomics experiments.</a> Bioinformatics. 26 (7), 966-968 (2010).</li><li>Gerber, S. A., Rush, J., Stemman, O., Kirschner, M. W., Gygi, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absolute+quantification+of+proteins+and+phosphoproteins+from+cell+lysates+by+tandem+MS.">Absolute quantification of proteins and phosphoproteins from cell lysates by tandem MS.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2003).</li><li>Escher, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+iRT,+a+normalized+retention+time+for+more+targeted+measurement+of+peptides.">Using iRT, a normalized retention time for more targeted measurement of peptides.</a> Proteomics. , (2012).</li><li>Gillette, M. A., Carr, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+peptides+and+proteins+in+biomedicine+by+targeted+mass+spectrometry.">Quantitative analysis of peptides and proteins in biomedicine by targeted mass spectrometry.</a> Nature Methods. 10 (1), 28-34 (2013).</li><li>Whiteaker, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+targeted+proteomics-based+pipeline+for+verification+of+biomarkers+in+plasma.">A targeted proteomics-based pipeline for verification of biomarkers in plasma.</a> Nature Biotechnology. , (2011).</li><li>H&#252;ttenhain, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproducible+quantification+of+cancer-associated+proteins+in+body+fluids+using+targeted+proteomics.">Reproducible quantification of cancer-associated proteins in body fluids using targeted proteomics.</a> Science Translational Medicine. 4 (142), 94 (2012).</li><li>Mermelekas, G., Vlahou, A., Zoidakis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SRM/MRM+targeted+proteomics+as+a+tool+for+biomarker+validation+and+absolute+quantification+in+human+urine.">SRM/MRM targeted proteomics as a tool for biomarker validation and absolute quantification in human urine.</a> Expert Review of Molecular Diagnostics. 15 (11), 1441-1454 (2015).</li><li>Koldamova, R. P., Lefterov, I. M., Lefterova, M. I., Lazo, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apolipoprotein+A-I+directly+interacts+with+amyloid+precursor+protein+and+inhibits+A&#946;+aggregation+and+toxicity.">Apolipoprotein A-I directly interacts with amyloid precursor protein and inhibits A&#946; aggregation and toxicity.</a> Biochemistry. , (2001).</li><li>Jiang, S. X., Slinn, J., Aylsworth, A., Hou, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vimentin+participates+in+microglia+activation+and+neurotoxicity+in+cerebral+ischemia.">Vimentin participates in microglia activation and neurotoxicity in cerebral ischemia.</a> Journal of Neurochemistry. , (2012).</li><li>Liu, L. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nicotinamide+Phosphoribosyltransferase+May+Be+Involved+in+Age-Related+Brain+Diseases.">Nicotinamide Phosphoribosyltransferase May Be Involved in Age-Related Brain Diseases.</a> PLoS ONE. , (2012).</li><li>Abbatiello, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+guidelines+for+publication+of+manuscripts+describing+development+and+application+of+targeted+mass+spectrometry+measurements+of+peptides+and+proteins.">New guidelines for publication of manuscripts describing development and application of targeted mass spectrometry measurements of peptides and proteins.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 16 (3), 327-328 (2017).</li></ol>

Técnicas como a imunohistoquímica e a mancha ocidental foram consideradas como os padrões de ouro para validação de alvos proteicos por muitos anos. Esses métodos encontram uso ainda hoje com pequenas modificações no protocolo e pouca dependência da tecnologia tornando-os muito complicados e tediosos. Além disso, envolvem também o uso de anticorpos caros que nem sempre mostram a mesma especificidade entre os lotes e exigem muita expertise. Além disso, apenas uma pequena fração de proteínas identificadas u...

Durante a última década, os rápidos desenvolvimentos da espectrometria de massa (MS) juntamente com o aumento da compreensão das técnicas de cromatografia ajudaram muito no avanço da proteômica baseada em MS. Técnicas baseadas em biologia molecular, como a mancha ocidental e a imunohistoquímica, há muito sofrem com problemas de reprodutibilidade, tempo de reviravolta lento, variabilidade entre observadores e sua incapacidade de quantificar com precisão proteínas, para citar alguns. Para isso, a sensibilidade superior das abordagens proteômicas de alto rendimento continua a oferecer aos biólogos moleculares uma ferramenta alternativa e mais confiável em sua busca para entender melhor os papéis das proteínas nas células. No entanto, as abordagens de proteômica de espingarda (Aquisição dependente de dados ou DDA) muitas vezes não conseguem detectar proteínas de baixa abundância em tecidos complexos, além de serem fortemente dependentes da sensibilidade e resolução do instrumento. Nos últimos dois anos, laboratórios em todo o mundo vêm desenvolvendo técnicas como o Data Independent Acquisition (DIA) que exigem maior poder computacional e software confiável que pode lidar com esses conjuntos de dados altamente complexos. No entanto, essas técnicas ainda são um trabalho em andamento e não muito fáceis de usar. Abordagens de proteômica baseadas em MS fornecem um equilíbrio perfeito entre a natureza de alto rendimento das abordagens de ESM e a sensibilidade de abordagens de biologia molecular como a ELISA. Um experimento de proteômica baseado em espectrometria de massa focado na detecção de proteínas ou peptídeos baseados em hipóteses a partir de experimentos de proteômica de espingarda baseada em descobertas ou através da literatura disponível1,2. O Monitor de Reação Múltipla (MRM) é uma abordagem de MS direcionada que usa um espectrômetro de massa quadrupole tandem para detecção precisa e quantificação de proteínas/peptídeos a partir de amostras complexas. A técnica oferece maior sensibilidade e especificidade, apesar de exigir o uso de um instrumento de baixa resolução.
Um quadrupole é feito de 4 hastes paralelas, com cada haste conectada à haste diagonalmente oposta. Um campo flutuante é criado entre as hastes quadrupoles aplicando tensões de RF e DC alternadas. A trajetória dos íons dentro do quadrupole é influenciada pela presença das mesmas tensões através de hastes opostas. Aplicando o RF à tensão DC, a trajetória dos íons pode ser estabilizada. É esta propriedade do quadrupole que permite que ele seja usado como um filtro de massa que pode seletivamente deixar íons específicos passarem. Dependendo da necessidade, um quadrúpole pode ser operado no modo estático ou no modo de digitalização. O modo estático permite que apenas íons com um m/z especificado passem, tornando o modo altamente seletivo e específico para o íon de interesse. O modo de digitalização, por outro lado, permite que íons em toda a faixa m/z passem. Assim, os espectrômetros de massa de quadrupole tandem podem operar de 4 maneiras possíveis: i) o primeiro quadrupole operando no modo estático enquanto o segundo operando no modo de digitalização; ii) o primeiro quadrúpole operando no modo de digitalização enquanto o segundo opera no modo estático; iii) ambos os quadrupoles que operam no modo de digitalização; iv) ambos quadrupoles operando no modo estático3. Em um experimento típico de MRM, ambos os quadrupoles operam no modo estático permitindo que precursores específicos e seus produtos resultantes após a fragmentação sejam monitorados. Isso torna a técnica muito sensível e seletiva permitindo quantificação precisa.
Para biólogos moleculares, o tecido cerebral humano e suas células são um tesouro. Essas unidades notáveis de um órgão sempre interessante do corpo humano podem fornecer insights moleculares e celulares sobre seu funcionamento. Investigações proteômicas do tecido cerebral podem não apenas nos ajudar a entender o funcionamento sistêmico de um cérebro saudável, mas também as vias celulares que são desreguladas quando infligidas por alguma doença4. No entanto, o tecido cerebral com toda a sua heterogeneidade é um órgão muito complexo para analisar e requer uma abordagem concertada para uma melhor compreensão das mudanças no nível molecular. O trabalho a seguir descreve todo o fluxo de trabalho começando desde a extração de proteínas do tecido cerebral, criando e otimizando os métodos para ensaios de MRM, até a validação dos alvos(Figura 1). Aqui, temos destacado sistematicamente os principais passos envolvidos em um experimento bem-sucedido baseado em MRM usando tecido cerebral humano com o objetivo de introduzir a técnica e seus desafios para uma comunidade de pesquisa mais ampla.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile (MS grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A/0620/21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>TC194-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Fischer Scienific</td>
			<td>BP510-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid (MS grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>147930250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1149-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol (MS grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Q13827</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Fischer Scienific</td>
			<td>BP214-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol (MS grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A456-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS grade water</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>51140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>TL1006-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Roche Diagnostics</td>
			<td>11873580001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>DF6D661300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCEP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>646547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Merck</td>
			<td>648310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin (MS grade)</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>90058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Merck</td>
			<td>MB1D691237</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Supplies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypersil Gold C18 column</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>25002-102130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipettes</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F167380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stage tips</td>
			<td>MilliPore</td>
			<td>ZTC18M008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zirconia/Silica beads</td>
			<td>BioSpec products</td>
			<td>11079110z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bead beater (Homogeniser)</td>
			<td>Bertin Minilys</td>
			<td>P000673-MLYS0-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader (spectrophotometer)</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>MultiSkan Go</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td>Eutech</td>
			<td>CyberScan pH 510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Probe Sonicator</td>
			<td>Sonics Materials, Inc</td>
			<td>VCX 130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking Drybath</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>88880028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TSQ Altis mass spectrometer</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>TSQ02-10002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>uHPLC - Vanquish</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>VQF01-20001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum concentrator</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>Savant ISS 110</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative proteomics workflow using multiple reaction monitoring based detection of proteins from human brain tissue

A análise proteômica do tecido cerebral humano na última década aumentou muito nossa compreensão do cérebro. No entanto, os distúrbios cerebrais continuam a ser um dos principais contribuintes das mortes em todo o mundo, necessitando da necessidade de uma compreensão ainda maior de sua patobiologia. Técnicas tradicionais baseadas em anticorpos, como a mancha ocidental ou a imunohistoquímica sofrem de baixa produtividade, além de serem intensivas em mão-de-obra e qualitativas ou semi-quantitativas. Mesmo abordagens convencionais baseadas em espectrometria de massa não fornecem evidências conclusivas para apoiar uma determinada hipótese. As abordagens proteômicas direcionadas são em grande parte orientadas por hipóteses e diferem das abordagens convencionais de proteômica da espingarda que têm sido há muito tempo em uso. O monitoramento de reação múltipla é uma dessas abordagens direcionadas que requer o uso de um espectrômetro de massa especial chamado espectrômetro de massa quadrupole tandem ou espectrômetro de massa quadrupole triplo. No presente estudo, temos destacado sistematicamente os principais passos envolvidos na realização de um fluxo de trabalho de protetrometria de massa baseado em espectrometria de massa tandem bem sucedido usando tecido cerebral humano com o objetivo de introduzir esse fluxo de trabalho a uma comunidade de pesquisa mais ampla.

Foram realizadas quantificação relativa de 3 proteínas de 10 amostras, 5 amostras de cada grupo de pacientes com anormalidades no cérebro. Essas proteínas incluíam Apolipoprotein A-I (APOA-I), Vimentina (VIM) e Nicotinamida phosphoribosyltransferase (NAMPT) que são conhecidas por desempenhar diversos papéis nas células cerebrais. A análise pós-execução dos dados foi realizada utilizando-se skyline-daily (Ver 20.2.1.286). Foram monitorados 10 peptídeos correspondentes a 3 proteínas. Estes incluíram 3 pept?...

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Quantitative Proteomics Workflow using Multiple Reaction Monitoring Based Detection of Proteins from Human Brain Tissue

O protocolo visa introduzir o uso de um espectrômetro de massa quadrupole triplo para monitoramento de reação múltipla (MRM) de proteínas de amostras clínicas. Fornecemos um fluxo de trabalho sistemático desde a preparação da amostra até a análise de dados para amostras clínicas com todas as precauções necessárias a serem tomadas.

Fluxo de trabalho de proteômica quantitativa usando detecção baseada em monitoramento de múltiplas reações de proteínas do tecido cerebral humano

The proteomic analysis of the human brain tissue over the last decade has greatly enhanced our understanding of the brain. However, brain related ...

Abordagens proteômicas direcionadas estão rapidamente se tornando o método de escolha para validação de proteínas de experimentos baseados em proteômica de curto prazo ou de experimentos baseados em biologia molecular. O monitoramento de múltiplas reações é uma dessas abordagens direcionadas que está sendo cada vez mais usada para detectar e quantificar proteínas de amostras biológicas. Neste estudo, percorremos as várias etapas envolvidas na detecção e quantificação de proteínas do tecido cerebral humano com a intenção de introduzir os leitores aos requisitos básicos de um experimento de MRM.Pesar cerca de 50 mg de tecido cerebral, e lavar o tecido com 300 microliters de 1x salina tamponada com fosfato. Esta etapa é realizada para remover qualquer sangue na superfície externa do tecido e, portanto, é aconselhável remover o máximo de sangue possível. Após as lavagens com PBS, adicione 300 microliters de tampão de lise ao tubo contendo o tecido.Lyse o tecido usando um sônico sonda enquanto mantém o tubo em um banho de gelo. Continue com a homogeneização do tecido usando um batedor de contas para lise completamente o tecido. Centrifugar o conteúdo do tubo a 6000 g por 15 minutos a quatro graus centígrados.Transfira o supernante para um tubo fresco e misture de forma homogênea. Pegue uma pequena alíquota do supernasteante, e quantifique o teor de proteína usando um ensaio de proteína padrão. Aqui mostramos um exemplo de estimativa de proteína usando Bradford Assay.Tome 50 microgramas de proteína em um tubo de microcentrifuuge e reduza o conteúdo adicionando TCEP de tal forma que a concentração final seja de 20 mililitros. Incubar o conteúdo a 37 graus por uma hora. Após a incubação, alquila as proteínas reduzidas adicionando iodoacetamida ao tubo, de tal forma que a concentração final seja de 40 mililitros.Incubar o tubo no escuro por 30 minutos. Agora adicione buffer B ao tubo continha as proteínas reduzidas e alquiladas de tal forma que a concentração final de ureia é menor que um molar. Adicione trippsina em 1 quanto a 30% da relação enzima-proteína e incubar os tubos durante a noite a 37 graus com agitação constante.Após a digestão, concentre os peptídeos digeridos em um concentrador de vácuo. Nesta etapa, os peptídeos podem ser reconstituídos e dessel ou armazenados a menos 80 para uso futuro. A desalagem, ou limpeza de peptídeos, é essencial antes de carregar as amostras em qualquer LC-MS MS. Sais e outros contaminantes na amostra podem entupir a coluna e afetar a sensibilidade do instrumento a longo prazo.Este processo pode ser realizado utilizando dicas ou colunas C18 STAGE disponíveis comercialmente. Aqui nós mostramos o fluxo de trabalho para desalagem de peptídeos usando uma ponta C18 STAGE. Após a desalvação, seque os peptídeos em um concentrador de vácuo.Reconstitua esses peptídeos limpos e proceda para quantificação usando o método Scopes. Para isso, carregue dois microlitadores da amostra em uma placa de microesque e calcule a concentração como mostrado no slide. A preparação da lista de transição é um passo crucial em um experimento srm ou mrm.Uma lista de transição contém todas as informações exigidas pelo espectrômetro de massa para monitorar a transição. Isso inclui os valores m por z dos íons precursores e do produto, a energia de colisão da transição, a polaridade do instrumento e a faixa de tempo para aquisição de dados. Prepare a lista de transição usando Skyline.Prepare um proteome de fundo usando o arquivo Human Proteome Fasta do UniProt e certifique-se de que ele seja selecionado na guia Fundo das Configurações de Peptídeos. Na guia Filtro, defina um comprimento mínimo de 8 e comprimento máximo de 25. Continue a usar as configurações padrão se não houver outras modificações nos peptídeos.Uma vez que as configurações do peptídeo tenham sido feitas, clique em Configurações de transição. Na guia Filtro, defina as cargas Precursoras como 2 e 3. Defina as cargas de íons como 1 e defina os tipos de íons para y.Os íons do produto podem ser selecionados dependendo da escolha do usuário. Deixe todos os parâmetros como padrão. Agora insira os IDs de adesão das proteínas-alvo selecionadas.Isso pode ser feito clicando na guia Editar e selecionar Insert e, finalmente, colar os IDs de adesão. Os IDs serão mapeados para as proteínas no proteome de fundo e uma lista de transição criada com base nas configurações de peptídeo e transição definidas anteriormente. Exporte esta lista de transição.Certifique-se de que o instrumento certo está selecionado clicando na opção de dropdown do tipo Instrumento. Neste caso, o instrumento é Thermo Altis. Uma vez que a lista de transição indefinida tem muitas transições, mantenha um limite de apenas 350 transições por lista e exporte como múltiplos métodos.É usado um sistema de solvente binário. Solvente A é 1%FA e Solvente B é 80% ACN. Mantenha a vazão em 450 microliter por minuto e o gradiente como mostrado.Coloque a temperatura do compartimento da coluna a 45 graus Celsius. Para obter mais detalhes sobre a coluna e o sistema LC, consulte o texto. Certifique-se de que as configurações de MS em seu TSQ Altis estão como mostrado aqui.Importe uma única lista de transição para criar um novo método. Sugerimos manter a resolução para quadrupole 1 e quadrupole 3 às 7. Estes podem ser ainda mais otimizados, se necessário.Para garantir a consistência nas corridas e, consequentemente, a qualidade dos dados, prepare sua sequência de execução como mostrado. Comece com um par de espaços em branco, consulte o texto para composição da mistura em branco, seguido por uma luz padrão QC BSA de concentração conhecida para monitorar qualquer variação na resposta diusó-dia do instrumento. O QC feito deve ser pouco antes das amostras.Em seguida, alinhe todas as amostras com balas de feste de recolher no meio. Injete volumes iguais de cada amostra, representando 25 a 1 nanograma de peptídeos por injeção. Para fazer um método refinado, primeiro execute os métodos indefinidos contra amostras inteiras.Importe os resultados no Skyline e verifique manualmente cada peptídeo. Para cada peptídeo, selecione um precursor mostrando picos consistentemente bons em todas as amostras. Exclua precursores e peptídeos que não estão mostrando bons picos.Certifique-se de que todos os picos estão anotados corretamente. Para selecionar o pico certo e refinar ainda mais as transições sob cada precursor, uma biblioteca pode ser usada. Uma biblioteca é um conjunto de dados espectrais ms-MS combinados com peptídeos e transições dos dados experimentais atuais.Escolha picos que tenham valores DART P mais próximos de 1 e remova transições que não correspondam à biblioteca. Um valor DART P denota o quão bom é o jogo entre o pico experimental e o pico da biblioteca. Após uma ou duas rodadas de otimização, uma lista refinada estará pronta.Esta lista refinada pode ser executada para amostras individuais. Importe os refinados corre para skyline e anotar picos corretamente. Use a guia Anotação em Configurações de documento para anotar cada amostra na grade do documento cuidadosamente.Use o recurso de comparação de grupo para criar comparações entre condição 1 e condição 2 do seu experimento. Isso dará tabela com valores P ajustados e valores de mudança de dobra entre os dois grupos. Pelo que sabemos, este é o primeiro estudo que utiliza o MRM para detectar peptídeos para as proteínas Apolipoprotein A-1, Vimentin e Nicotinamida phosphoribosyltransferase em amostras de tecido cerebral humano.Otimizar vários parâmetros como gradiente de LC, tempo de moradia, tempo de ciclo e energia de colisão pode influenciar muito o sucesso de um experimento mrm. Acreditamos que essa técnica pode ser usada para desenvolver padrões de biomarcadores com capacidade de distinguir entre diferentes condições clínicas e doenças.

Research

JoVE Journal

Biology

A Chromatin Assay for Human Brain Tissue

Um Ensaio Chromatin para tecido do cérebro humano

Chronic neuropsychiatric illnesses such as schizophrenia, bipolar disease and autism are thought to result from a combination of genetic and environmental ...

Biologia

Neuronal Nuclei Isolation from Human Postmortem Brain Tissue

Isolamento Núcleos neuronais de Tecidos Humanos Postmortem Cérebro

Neurons in the human brain become postmitotic largely during prenatal development, and thus maintain their nuclei throughout the full lifespan. However, ...

Monitoring Acupuncture Effects on Human Brain by fMRI

Monitoramento Effects Acupuntura em Cérebro Humano por fMRI

Functional MRI is used to study the effects of acupuncture on the BOLD response and the functional connectivity of the human brain.  Results demonstrate ...

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Identificação de complexos de proteínas com proteômica quantitativa em S. cerevisiae

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A Quantitative Fitness Analysis Workflow

Um fluxo de trabalho Análise Quantitativa de Fitness

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Preparação de Amostras de proteômica fixados em formalina e embebidos em parafina Tissue

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Identification of Protein Interaction Partners in Mammalian Cells Using SILAC-immunoprecipitation Quantitative Proteomics

Identificação de parceiros de interação de proteínas em células de mamíferos utilizando SILAC-imunoprecipitação quantitativos Proteômica

Quantitative proteomics combined with immuno-affinity purification, SILAC immunoprecipitation, represent a powerful means for the discovery of novel ...

Selected Reaction Monitoring Mass Spectrometry for Absolute Protein Quantification

Reação selecionada Monitoramento Espectrometria de Massa para Absolute Quantificação de Proteína

Absolute quantification of target proteins within complex biological samples is critical to a wide range of research and clinical applications. This ...