Name: quantitative proteomics workflow using multiple reaction monitoring based detection of proteins from human brain tissue
Uploaded: 2021-08-28T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Proteomics Workflow using Multiple Reaction Monitoring Based Detection of Proteins from Human Brain Tissue at JoVE.com

Мы признаем проект MHRD-UAY (UCHHATAR AVISHKAR YOJANA), проект #34_IITB для SS и MASSFIITB Facility в IIT Bombay при поддержке Департамента биотехнологии (BT/PR13114/INF/22/206/2015) для проведения всех экспериментов, связанных с MS.
Мы выражаем особую благодарность г-ну Ришабу Ядаву за создание и редактирование всего видео и г-ну Нишанту Неруркару за его работу по редактированию аудио.

Это исследование включает образцы мозговой ткани от людей-участников, рассмотренные и одобренные TMH и IITB IEC - (IITB-IEC/2018/019). Участники предоставили свое информированное и письменное согласие на участие в этом исследовании.
1 Извлечение белка из мозговой ткани
<ol><li>Взвесьте ?...

<ol>
	<li>Picotti, P., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selected+reaction+monitoring-based+proteomics:+Workflows,+potential,+pitfalls+and+future+directions.">Selected reaction monitoring-based proteomics: Workflows, potential, pitfalls and future directions.</a> Nature Methods. , (2012).</li><li>Carr, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+peptide+measurements+in+biology+and+medicine:+Best+practices+for+mass+spectrometry-based+assay+development+using+a+fit-for-purpose+approach.">Targeted peptide measurements in biology and medicine: Best practices for mass spectrometry-based assay development using a fit-for-purpose approach.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 13 (3), 907-917 (2014).</li><li>Pitt, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+and+applications+of+liquid+chromatography-mass+spectrometry+in+clinical+biochemistry.">Principles and applications of liquid chromatography-mass spectrometry in clinical biochemistry.</a> The Clinical biochemist Reviews. 30 (1), 19-34 (2009).</li><li>Hosp, F., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Primer+on+Concepts+and+Applications+of+Proteomics+in+Neuroscience.">A Primer on Concepts and Applications of Proteomics in Neuroscience.</a> Neuron. 96 (3), 558-571 (2017).</li><li>Scopes, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+protein+by+spectrophotometry+at+205+nm.">Measurement of protein by spectrophotometry at 205 nm.</a> Analytical Biochemistry. , (1974).</li><li>Kusebauch, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+SRMAtlas:+A+Resource+of+Targeted+Assays+to+Quantify+the+Complete+Human+Proteome.">Human SRMAtlas: A Resource of Targeted Assays to Quantify the Complete Human Proteome.</a> Cell. , (2016).</li><li>MacLean, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skyline:+an+open+source+document+editor+for+creating+and+analyzing+targeted+proteomics+experiments.">Skyline: an open source document editor for creating and analyzing targeted proteomics experiments.</a> Bioinformatics. 26 (7), 966-968 (2010).</li><li>Gerber, S. A., Rush, J., Stemman, O., Kirschner, M. W., Gygi, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absolute+quantification+of+proteins+and+phosphoproteins+from+cell+lysates+by+tandem+MS.">Absolute quantification of proteins and phosphoproteins from cell lysates by tandem MS.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2003).</li><li>Escher, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+iRT,+a+normalized+retention+time+for+more+targeted+measurement+of+peptides.">Using iRT, a normalized retention time for more targeted measurement of peptides.</a> Proteomics. , (2012).</li><li>Gillette, M. A., Carr, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+peptides+and+proteins+in+biomedicine+by+targeted+mass+spectrometry.">Quantitative analysis of peptides and proteins in biomedicine by targeted mass spectrometry.</a> Nature Methods. 10 (1), 28-34 (2013).</li><li>Whiteaker, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+targeted+proteomics-based+pipeline+for+verification+of+biomarkers+in+plasma.">A targeted proteomics-based pipeline for verification of biomarkers in plasma.</a> Nature Biotechnology. , (2011).</li><li>H&#252;ttenhain, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproducible+quantification+of+cancer-associated+proteins+in+body+fluids+using+targeted+proteomics.">Reproducible quantification of cancer-associated proteins in body fluids using targeted proteomics.</a> Science Translational Medicine. 4 (142), 94 (2012).</li><li>Mermelekas, G., Vlahou, A., Zoidakis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SRM/MRM+targeted+proteomics+as+a+tool+for+biomarker+validation+and+absolute+quantification+in+human+urine.">SRM/MRM targeted proteomics as a tool for biomarker validation and absolute quantification in human urine.</a> Expert Review of Molecular Diagnostics. 15 (11), 1441-1454 (2015).</li><li>Koldamova, R. P., Lefterov, I. M., Lefterova, M. I., Lazo, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apolipoprotein+A-I+directly+interacts+with+amyloid+precursor+protein+and+inhibits+A&#946;+aggregation+and+toxicity.">Apolipoprotein A-I directly interacts with amyloid precursor protein and inhibits A&#946; aggregation and toxicity.</a> Biochemistry. , (2001).</li><li>Jiang, S. X., Slinn, J., Aylsworth, A., Hou, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vimentin+participates+in+microglia+activation+and+neurotoxicity+in+cerebral+ischemia.">Vimentin participates in microglia activation and neurotoxicity in cerebral ischemia.</a> Journal of Neurochemistry. , (2012).</li><li>Liu, L. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nicotinamide+Phosphoribosyltransferase+May+Be+Involved+in+Age-Related+Brain+Diseases.">Nicotinamide Phosphoribosyltransferase May Be Involved in Age-Related Brain Diseases.</a> PLoS ONE. , (2012).</li><li>Abbatiello, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+guidelines+for+publication+of+manuscripts+describing+development+and+application+of+targeted+mass+spectrometry+measurements+of+peptides+and+proteins.">New guidelines for publication of manuscripts describing development and application of targeted mass spectrometry measurements of peptides and proteins.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 16 (3), 327-328 (2017).</li></ol>

Такие методы, как иммуногистохимия и вестерн-блоттинг, считались золотыми стандартами для проверки белковых мишеней в течение многих лет. Эти методы находят применение даже сегодня с незначительными изменениями в протоколе и небольшой зависимостью от технологии, что делает их очень ?...

В течение последнего десятилетия быстрое развитие масс-спектрометрии (МС) в сочетании с более глубокое понимание методов хроматографии значительно помогло в продвижении протеомики на основе РС. Методы, основанные на молекулярной биологии, такие как западное блоттинг и иммуногистохимия, уже давно страдают от проблем воспроизводимости, медленного времени обработки, изменчивости между наблюдателями и их неспособности точно количественно оценивать белки, и это лишь некоторые из них. С этой целью превосходная чувствительность высокопроизводительных подходов к протеомике продолжает предлагать молекулярным биологам альтернативный и более надежный инструмент в их стремлении лучше понять роль белков в клетках. Тем не менее, подходы к протеомике дробовика (Data dependent Acquisition или DDA) часто не могут обнаружить низкие обильные белки в сложных тканях, помимо того, что они в значительной степени зависят от чувствительности и разрешения инструмента. За последние пару лет лаборатории по всему миру разрабатывали такие методы, как Data Independent Acquisition (DIA), которые требуют увеличения вычислительной мощности и надежного программного обеспечения, которое может обрабатывать эти очень сложные наборы данных. Тем не менее, эти методы все еще находятся в процессе разработки и не очень удобны для пользователя. Целевые подходы протеомики на основе РС обеспечивают идеальный баланс между высокопроизводительный характер подходов к РС и чувствительностью подходов молекулярной биологии, таких как ИФА. Целевой эксперимент по протеомике на основе масс-спектрометрии фокусируется на обнаружении белков или пептидов, основанных на гипотезах, из экспериментов по протеомике на основе открытия дробовика или через доступную литературу1,2. Множественный мониторинг реакций (MRM) является одним из таких целевых подходов MS, который использует тандемный квадрупольный масс-спектрометр для точного обнаружения и количественной оценки белков / пептидов из сложных образцов. Метод предлагает более высокую чувствительность и специфичность, несмотря на необходимость использования инструмента с низким разрешением.
Квадруполь состоит из 4 параллельных стержней, каждый из которых соединен с диагонально противоположным стержнем. Флуктуирующее поле создается между квадрупольными стержнями путем подачи переменных напряжений ВЧ и постоянного тока. На траекторию ионов внутри квадруполя влияет наличие одинаковых напряжений на противоположных стержнях. Применяя радиочастотное напряжение к постоянному току, траектория ионов может быть стабилизирована. Именно это свойство квадруполя позволяет использовать его в качестве массового фильтра, который может избирательно пропускать определенные ионы. В зависимости от необходимости квадруполь может работать как в статическом, так и в сканирутном режиме. Статический режим позволяет проходить только ионам с заданным m/z, что делает режим очень селективным и специфичным для интересующих ионов. Режим сканирования, с другой стороны, позволяет проходить ионам во всем диапазоне m/z. Таким образом, тандемные квадрупольные масс-спектрометры могут работать 4 возможными способами: i) первый квадруполь, работающий в статическом режиме, а второй – в режиме сканирования; ii) первый квадруполь, работающий в режиме сканирования, а второй – в статическом режиме; iii) оба квадруполя, работающие в режиме сканирования; и iv) оба квадруполя, работающие в статическом режиме3. В типичном эксперименте MRM оба квадруполя работают в статическом режиме, что позволяет контролировать конкретные прекурсоры и их результирующие продукты после фрагментации. Это делает технику очень чувствительной и избирательной, что позволяет проводить точную количественную оценку.
Для молекулярных биологов ткань мозга человека и ее клетки являются сокровищницей. Эти замечательные единицы вечно интересного органа человеческого тела могут обеспечить молекулярное и клеточное понимание его функционирования. Протеомные исследования мозговой ткани могут не только помочь нам понять системное функционирование здорового мозга, но и клеточные пути, которые дисрегулируются при заболевании4. Однако мозговая ткань со всей ее неоднородностью является очень сложным органом для анализа и требует согласованного подхода для лучшего понимания изменений на молекулярном уровне. Следующая работа описывает весь рабочий процесс, начиная с извлечения белков из мозговой ткани, создания и оптимизации методов анализа MRM, до проверки целей(рисунок 1). Здесь мы систематически освещаем основные шаги, связанные с успешным экспериментом на основе MRM с использованием ткани человеческого мозга с целью представления техники и ее проблем более широкому исследовательской аудитории.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile (MS grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A/0620/21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>TC194-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Fischer Scienific</td>
			<td>BP510-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid (MS grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>147930250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1149-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol (MS grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Q13827</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Fischer Scienific</td>
			<td>BP214-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol (MS grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A456-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS grade water</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>51140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>TL1006-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Roche Diagnostics</td>
			<td>11873580001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>DF6D661300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCEP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>646547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Merck</td>
			<td>648310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin (MS grade)</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>90058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Merck</td>
			<td>MB1D691237</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Supplies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypersil Gold C18 column</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>25002-102130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipettes</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F167380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stage tips</td>
			<td>MilliPore</td>
			<td>ZTC18M008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zirconia/Silica beads</td>
			<td>BioSpec products</td>
			<td>11079110z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bead beater (Homogeniser)</td>
			<td>Bertin Minilys</td>
			<td>P000673-MLYS0-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader (spectrophotometer)</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>MultiSkan Go</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td>Eutech</td>
			<td>CyberScan pH 510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Probe Sonicator</td>
			<td>Sonics Materials, Inc</td>
			<td>VCX 130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking Drybath</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>88880028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TSQ Altis mass spectrometer</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>TSQ02-10002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>uHPLC - Vanquish</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>VQF01-20001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum concentrator</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>Savant ISS 110</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative proteomics workflow using multiple reaction monitoring based detection of proteins from human brain tissue

Протеомный анализ ткани человеческого мозга за последнее десятилетие значительно улучшил наше понимание мозга. Тем не менее, расстройства, связанные с мозгом, по-прежнему являются основной причиной смертей во всем мире, что требует еще большего понимания их патобиологии. Традиционные методы, основанные на антителах, такие как западное блоттинг или иммуногистохимия, страдают от низкой пропускной способности, помимо того, что они трудоемкие и качественные или полукоачественные. Даже обычные подходы, основанные на масс-спектрометрии, не могут предоставить убедительных доказательств в поддержку определенной гипотезы. Подходы к целенаправленной протеомике в значительной степени основаны на гипотезах и отличаются от обычных подходов к протеомике дробовика, которые давно используются. Мониторинг множественных реакций является одним из таких целевых подходов, который требует использования специального масс-спектрометра, называемого тандемным квадрупольным масс-спектрометром или трехквадрупольных масс-спектрометрами. В текущем исследовании мы систематически освещали основные шаги, связанные с выполнением успешного тандемного квадрупольного процесса протеомики на основе масс-спектрометрии с использованием ткани мозга человека с целью представления этого рабочего процесса более широкому исследовательской аудитории.

Мы провели относительную количественную оценку 3 белков из 10 образцов, по 5 образцов из каждой группы пациентов с аномалиями в головном мозге. Эти белки включали аполипопротеин A-I (APOA-I), виментин (VIM) и никотинамидфосфорибозилтрансферазу (NAMPT), которые, как известно, выполняют различные ро?...

Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Proteomics Workflow using Multiple Reaction Monitoring Based Detection of Proteins from Human Brain Tissue at JoVE.com

Quantitative Proteomics Workflow using Multiple Reaction Monitoring Based Detection of Proteins from Human Brain Tissue

Протокол направлен на введение использования тройного квадрупольного масс-спектрометра для мониторинга множественных реакций (MRM) белков из клинических образцов. Мы обеспечили систематический рабочий процесс, начиная от подготовки образцов до анализа данных для клинических образцов со всеми необходимыми мерами предосторожности.

Рабочий процесс количественной протеомики с использованием множественного мониторинга реакций на основе обнаружения белков из ткани мозга человека

The proteomic analysis of the human brain tissue over the last decade has greatly enhanced our understanding of the brain. However, brain related ...

Целевые протеомные подходы быстро становятся методом выбора для проверки белков из краткосрочных экспериментов на основе протеомики или из экспериментов на основе молекулярной биологии. Мониторинг множественных реакций является одним из таких целевых подходов, который все чаще используется для обнаружения и количественной оценки белков из биологических образцов. В этом исследовании мы прошли через различные шаги, связанные с обнаружением и количественной оценкой белков из ткани мозга человека с целью познакомить читателей с основными требованиями эксперимента MRM.Взвесьте около 50 мг мозговой ткани и промыть ткань 300 микролитрами 1x фосфатно-буферного физиологического раствора. Этот этап выполняется для удаления любой крови на внешней поверхности ткани, и, следовательно, желательно удалить как можно больше крови. После промывки PBS добавьте 300 микролитров лизисного буфера в трубку, содержащую ткань.Разжижайте ткань с помощью зондового ультразвукового аппарата, сохраняя трубку на ледяной ванне. Продолжайте гомогенизацию тканей с помощью бисерного битерного битера, чтобы полностью лизезовать ткань. Центрифугируют содержимое пробирки при 6000 г в течение 15 минут при четырех градусах по Цельсию.Переложите супернатант в свежий тюбик и однородно перемешайте. Возьмите небольшую аликвоту супернатанта и количественно оцените содержание белка с помощью стандартного анализа белка. Здесь мы покажем пример оценки белка с помощью bradford Assay.Возьмите 50 микрограммов белка в микроцентрифужной трубке и уменьшите содержание, добавив TCEP таким образом, чтобы конечная концентрация была 20 миллимоляров. Инкубировать содержимое при 37 градусах в течение одного часа. После инкубации алкилируют восстановленные белки, добавляя йодоацетамид в трубку, так что конечная концентрация составляет 40 миллимоляров.Инкубировать тюбик в темноте в течение 30 минут. Теперь добавьте буфер В, чтобы в трубку в ней содержались восстановленные и алкилированные белки таким образом, чтобы конечная концентрация мочевины была меньше одного моляра. Добавьте трипсин в 1 до 30 ферментов в соотношении белок и инкубируют трубки в течение ночи при 37 градусах с постоянным встряхиванием.После пищеварения сконцентрируйте переваренные пептиды в вакуумном концентраторе. На этом этапе пептиды могут быть либо восстановлены и обессолины, либо сохранены при минус 80 для будущего использования. Обессоливание, или пептидная очистка, имеет важное значение перед загрузкой образцов на любой LC-MS MS. Соли и другие загрязняющие вещества в образце могут засорять колонну и влиять на чувствительность прибора в долгосрочной перспективе.Этот процесс может быть выполнен с использованием коммерчески доступных наконечников или столбцов C18 STAGE. Здесь мы изобразили рабочий процесс обессоливания пептидов с помощью наконечника C18 STAGE. После обессоливания высушите пептиды в вакуумном концентраторе.Воссоздайте эти чистые пептиды и приступайте к количественной оценке с использованием метода Scopes. Для этого загрузите два микролитра образца в микрокапеточную пластину и рассчитайте концентрацию, как показано на слайде. Подготовка списка переходов является важным шагом в эксперименте SRM или MRM.Список переходов содержит всю информацию, необходимую масс-спектрометру для мониторинга перехода. К ним относятся значения m by z ионов предшественников и продуктов, энергия столкновения перехода, полярность прибора и временной диапазон для сбора данных. Подготовьте список переходов с помощью Skyline.Подготовьте фоновый протеом с помощью файла Human Proteome Fasta из UniProt и убедитесь, что он выбран на вкладке «Фон» настроек пептида. На вкладке Фильтр задайте минимальную длину 8 и максимальную длину 25. Продолжайте использовать настройки по умолчанию, если в пептидах нет других модификаций.После того, как настройки пептидов были сделаны, нажмите «Настройки перехода». На вкладке Фильтр установите для параметра Сборы за прекурсоры значение 2 и 3. Установите ионные заряды как 1 и установите типы ионов в y.Ионы продукта могут быть выбраны в зависимости от выбора пользователя. Оставьте все параметры по умолчанию. Теперь вставьте идентификаторы присоединения выбранных белков-мишеней.Это можно сделать, нажав на вкладку «Правка», затем выбрав «Вставить» и, наконец, вставив идентификаторы присоединения. Идентификаторы будут сопоставлены с белками в фоновом протеоме и списком переходов, созданным на основе пептидных и переходных настроек, установленных ранее. Экспортируйте этот список переходов.Убедитесь, что выбран правильный инструмент, щелкнув выпадающий список Тип инструмента. В данном случае инструментом является Thermo Altis. Поскольку неопределенный список переходов имеет слишком много переходов, оставить ограничение только в 350 переходов на список и экспортировать как несколько методов.Используется бинарная система растворителей. Растворитель А составляет 1% FA, а растворитель B - 80% ACN. Держите скорость потока на уровне 450 микролитров в минуту и градиент, как показано на рисунке.Установите температуру отсека колонны на уровне 45 градусов цельсия. Для получения более подробной информации о колонке и системе LC обратитесь к тексту. Убедитесь, что настройки MS в вашем TSQ Altis как показано здесь.Импортируйте один список переходов, чтобы создать новый метод. Мы предлагаем сохранить разрешение для квадруполя 1 и квадруполя 3 на уровне 7. При необходимости они могут быть дополнительно оптимизированы.Чтобы обеспечить согласованность выполнения и, следовательно, качество данных, подготовьте последовательность выполнения, как показано на рисунке. Начните с пары пробелов, обратитесь к тексту для состава пустой смеси, за которым следует стандартная лампа контроля качества BSA известной концентрации для мониторинга любых изменений в дневном отклике прибора. QC должен быть выполнен непосредственно перед образцами.Затем выровняйте все образцы с заготовками между ними. Вводят равные объемы каждого образца, что составляет от 25 до 1 нанограмма пептидов за инъекцию. Чтобы создать усовершенствованный метод, сначала запустите неопределенные методы для целых образцов.Импортируйте результаты в Skyline и вручную проверяйте каждый пептид. Для каждого пептида выберите один предшественник, показывающий неизменно хорошие пики во всех образцах. Удалите предшественники и пептиды, которые не показывают хороших пиков.Убедитесь, что все пики правильно аннотированы. Для выбора правильного пика и дальнейшего уточнения переходов под каждым предшественником можно использовать библиотеку. Библиотека представляет собой набор спектральных данных MS-MS, сопоставленных с пептидами и переходами текущих экспериментальных данных.Выберите пики, которые имеют значения DART P ближе к 1, и удалите переходы, которые не соответствуют библиотеке. Значение DART P обозначает, насколько хорошо соответствие между экспериментальным пиком и библиотечным пиком. После одного-двух раундов оптимизации будет готов уточненный список.Этот уточненный список можно запустить для отдельных образцов. Импортируйте уточненные прогоны в Skyline и правильно аннотируйте пики. Вкладка Аннотация в разделе Параметры документа используется для тщательного аннотирования каждого образца в сетке документа.Используйте функцию группового сравнения для создания сравнений между условием 1 и условием 2 эксперимента. Это даст таблицу с скорректированными значениями P и значениями изменения сгиба между двумя группами. Насколько нам известно, это первое исследование, использующего использование MRM для обнаружения пептидов для белков аполипопротеина A-1, виментина и никотинамидфосфорибозилтрансферазы в образцах тканей мозга человека.Оптимизация различных параметров, таких как градиент LC, время ожидания, время цикла и энергия столкновения, может значительно повлиять на успех эксперимента с управлением записями сообщений. Мы считаем, что этот метод может быть использован для разработки паттернов биомаркеров со способностью различать различные клинические состояния и заболевания.

Research

JoVE Journal

Biology

A Chromatin Assay for Human Brain Tissue

Хроматин Пробирной по правам ткани мозга

Chronic neuropsychiatric illnesses such as schizophrenia, bipolar disease and autism are thought to result from a combination of genetic and environmental ...

Neuronal Nuclei Isolation from Human Postmortem Brain Tissue

Изоляция нейронов ядра из человеческих тканей мозга Посмертные

Neurons in the human brain become postmitotic largely during prenatal development, and thus maintain their nuclei throughout the full lifespan. However, ...

Monitoring Acupuncture Effects on Human Brain by fMRI

Мониторинг Акупунктура Влияние на Мозга человека на МРТ

Functional MRI is used to study the effects of acupuncture on the BOLD response and the functional connectivity of the human brain.  Results demonstrate ...

Identification of protein complexes with quantitative proteomics in S. cerevisiae

Идентификация белковых комплексов с количественной протеомики в CEREVISIAE С.

Lipids are the building blocks of cellular membranes that function as barriers and in compartmentalization of cellular processes, and recently, as ...

Obtaining High Quality RNA from Single Cell Populations in Human Postmortem Brain Tissue

Получение высокого качества РНК от единичных клеточных популяций в тканях человека Мозг Посмертные

We proposed to investigate the gray matter reduction in the superior temporal gyrus seen in schizophrenia patients, by interrogating gene expression ...

High-throughput Crystallization of Membrane Proteins Using the Lipidic Bicelle Method

Высокая пропускная способность кристаллизации мембранных белков, используя метод липидный Bicelle

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane ...

A Quantitative Fitness Analysis Workflow

Количественный анализ рабочих процессов Фитнес

Quantitative Fitness Analysis (QFA) is an experimental and computational workflow for comparing fitnesses of microbial cultures grown in parallel1,2,3,4. ...

Proteomic Sample Preparation from Formalin Fixed and Paraffin Embedded Tissue

Протеомный Подготовка образцов из фиксированных формалином и залитых парафином ткани

Preserved clinical material is a unique source for proteomic investigation of human disorders. Here we describe an optimized protocol allowing large scale ...

Identification of Protein Interaction Partners in Mammalian Cells Using SILAC-immunoprecipitation Quantitative Proteomics

Идентификация белков взаимодействию Партнеры в клетках млекопитающих Использование SILAC-иммунопреципитации количественная протеомика

Quantitative proteomics combined with immuno-affinity purification, SILAC immunoprecipitation, represent a powerful means for the discovery of novel ...

Selected Reaction Monitoring Mass Spectrometry for Absolute Protein Quantification

Выбранный мониторинга реакций масс-спектрометрии для абсолютного белка количественной

Absolute quantification of target proteins within complex biological samples is critical to a wide range of research and clinical applications. This ...