Name: quantitative proteomics workflow using multiple reaction monitoring based detection of proteins from human brain tissue
Uploaded: 2021-08-28T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Proteomics Workflow using Multiple Reaction Monitoring Based Detection of Proteins from Human Brain Tissue at JoVE.com

Reconocemos el Proyecto MHRD-UAY (UCHHATAR AVISHKAR YOJANA), proyecto #34_IITB a las instalaciones de SS y MASSFIITB en IIT Bombay con el apoyo del Departamento de Biotecnología (BT/PR13114/INF/22/206/2015) para llevar a cabo todos los experimentos relacionados con la EM.
Extendemos nuestro agradecimiento especial al Sr. Rishabh Yadav por hacer y editar todo el video y al Sr. Nishant Nerurkar por su trabajo en la edición del audio.

Este estudio involucra muestras de tejido cerebral de participantes humanos, revisadas y aprobadas por TMH e IITB IEC - (IITB-IEC/2018/019). Los participantes dieron su consentimiento informado y por escrito para participar en este estudio.
1 Extracción de proteínas del tejido cerebral
<ol><li>Pesar alrededor de 50 mg de tejido cerebral y lavar el tejido con 300 μL de solución salina tampón de fosfato 1x (PBS) usando una micropipeta. NOTA: Este paso se realiza para eliminar cualquier...

<ol>
	<li>Picotti, P., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selected+reaction+monitoring-based+proteomics:+Workflows,+potential,+pitfalls+and+future+directions.">Selected reaction monitoring-based proteomics: Workflows, potential, pitfalls and future directions.</a> Nature Methods. , (2012).</li><li>Carr, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+peptide+measurements+in+biology+and+medicine:+Best+practices+for+mass+spectrometry-based+assay+development+using+a+fit-for-purpose+approach.">Targeted peptide measurements in biology and medicine: Best practices for mass spectrometry-based assay development using a fit-for-purpose approach.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 13 (3), 907-917 (2014).</li><li>Pitt, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+and+applications+of+liquid+chromatography-mass+spectrometry+in+clinical+biochemistry.">Principles and applications of liquid chromatography-mass spectrometry in clinical biochemistry.</a> The Clinical biochemist Reviews. 30 (1), 19-34 (2009).</li><li>Hosp, F., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Primer+on+Concepts+and+Applications+of+Proteomics+in+Neuroscience.">A Primer on Concepts and Applications of Proteomics in Neuroscience.</a> Neuron. 96 (3), 558-571 (2017).</li><li>Scopes, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+protein+by+spectrophotometry+at+205+nm.">Measurement of protein by spectrophotometry at 205 nm.</a> Analytical Biochemistry. , (1974).</li><li>Kusebauch, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+SRMAtlas:+A+Resource+of+Targeted+Assays+to+Quantify+the+Complete+Human+Proteome.">Human SRMAtlas: A Resource of Targeted Assays to Quantify the Complete Human Proteome.</a> Cell. , (2016).</li><li>MacLean, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skyline:+an+open+source+document+editor+for+creating+and+analyzing+targeted+proteomics+experiments.">Skyline: an open source document editor for creating and analyzing targeted proteomics experiments.</a> Bioinformatics. 26 (7), 966-968 (2010).</li><li>Gerber, S. A., Rush, J., Stemman, O., Kirschner, M. W., Gygi, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absolute+quantification+of+proteins+and+phosphoproteins+from+cell+lysates+by+tandem+MS.">Absolute quantification of proteins and phosphoproteins from cell lysates by tandem MS.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2003).</li><li>Escher, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+iRT,+a+normalized+retention+time+for+more+targeted+measurement+of+peptides.">Using iRT, a normalized retention time for more targeted measurement of peptides.</a> Proteomics. , (2012).</li><li>Gillette, M. A., Carr, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+peptides+and+proteins+in+biomedicine+by+targeted+mass+spectrometry.">Quantitative analysis of peptides and proteins in biomedicine by targeted mass spectrometry.</a> Nature Methods. 10 (1), 28-34 (2013).</li><li>Whiteaker, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+targeted+proteomics-based+pipeline+for+verification+of+biomarkers+in+plasma.">A targeted proteomics-based pipeline for verification of biomarkers in plasma.</a> Nature Biotechnology. , (2011).</li><li>H&#252;ttenhain, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproducible+quantification+of+cancer-associated+proteins+in+body+fluids+using+targeted+proteomics.">Reproducible quantification of cancer-associated proteins in body fluids using targeted proteomics.</a> Science Translational Medicine. 4 (142), 94 (2012).</li><li>Mermelekas, G., Vlahou, A., Zoidakis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SRM/MRM+targeted+proteomics+as+a+tool+for+biomarker+validation+and+absolute+quantification+in+human+urine.">SRM/MRM targeted proteomics as a tool for biomarker validation and absolute quantification in human urine.</a> Expert Review of Molecular Diagnostics. 15 (11), 1441-1454 (2015).</li><li>Koldamova, R. P., Lefterov, I. M., Lefterova, M. I., Lazo, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apolipoprotein+A-I+directly+interacts+with+amyloid+precursor+protein+and+inhibits+A&#946;+aggregation+and+toxicity.">Apolipoprotein A-I directly interacts with amyloid precursor protein and inhibits A&#946; aggregation and toxicity.</a> Biochemistry. , (2001).</li><li>Jiang, S. X., Slinn, J., Aylsworth, A., Hou, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vimentin+participates+in+microglia+activation+and+neurotoxicity+in+cerebral+ischemia.">Vimentin participates in microglia activation and neurotoxicity in cerebral ischemia.</a> Journal of Neurochemistry. , (2012).</li><li>Liu, L. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nicotinamide+Phosphoribosyltransferase+May+Be+Involved+in+Age-Related+Brain+Diseases.">Nicotinamide Phosphoribosyltransferase May Be Involved in Age-Related Brain Diseases.</a> PLoS ONE. , (2012).</li><li>Abbatiello, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+guidelines+for+publication+of+manuscripts+describing+development+and+application+of+targeted+mass+spectrometry+measurements+of+peptides+and+proteins.">New guidelines for publication of manuscripts describing development and application of targeted mass spectrometry measurements of peptides and proteins.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 16 (3), 327-328 (2017).</li></ol>

Técnicas como la inmunohistoquímica y el Western blotting fueron consideradas como los estándares de oro para la validación de objetivos de proteínas durante muchos años. Estos métodos encuentran uso incluso hoy en día con pequeñas modificaciones en el protocolo y poca dependencia de la tecnología, lo que los hace muy engorrosos y tediosos. Además de esto, también implican el uso de anticuerpos costosos que no siempre muestran la misma especificidad en todos los lotes y requieren una gran cantidad de experie...

Durante la última década, los rápidos desarrollos en espectrometría de masas (EM) junto con una mayor comprensión de las técnicas de cromatografía han ayudado en gran medida en el avance de la proteómica basada en la EM. Las técnicas basadas en la biología molecular, como el western blotting y la inmunohistoquímica, han sufrido durante mucho tiempo problemas de reproducibilidad, tiempo de respuesta lento, variabilidad entre observadores y su incapacidad para cuantificar con precisión las proteínas, por nombrar algunos. Con este fin, la sensibilidad superior de los enfoques de proteómica de alto rendimiento continúa ofreciendo a los biólogos moleculares una herramienta alternativa y más confiable en su búsqueda para comprender mejor el papel de las proteínas en las células. Sin embargo, los enfoques de proteómica de escopeta (adquisición dependiente de datos o DDA) a menudo no detectan proteínas poco abundantes en tejidos complejos, además de depender en gran medida de la sensibilidad y la resolución del instrumento. En los últimos años, los laboratorios de todo el mundo han estado desarrollando técnicas como la adquisición independiente de datos (DIA) que requieren una mayor potencia informática y un software confiable que pueda manejar estos conjuntos de datos altamente complejos. Sin embargo, estas técnicas siguen siendo un trabajo en progreso y no son muy fáciles de usar. Los enfoques proteómicos específicos basados en la EM proporcionan un equilibrio perfecto entre la naturaleza de alto rendimiento de los enfoques de EM y la sensibilidad de los enfoques de biología molecular como ELISA. Un experimento de proteómica basado en espectrometría de masas dirigida se centra en la detección de proteínas o péptidos impulsados por hipótesis a partir de experimentos de proteómica de escopeta basados en descubrimientos o a través de la literatura disponible1,2. El monitoreo de reacción múltiple (MRM) es uno de esos enfoques específicos de EM que utiliza un espectrómetro de masas cuadrupolo en tándem para la detección y cuantificación precisas de proteínas / péptidos de muestras complejas. La técnica ofrece una mayor sensibilidad y especificidad a pesar de requerir el uso de un instrumento de baja resolución.
Un cuadrupolo está hecho de 4 varillas paralelas, con cada varilla conectada a la varilla diagonalmente opuesta. Se crea un campo fluctuante entre las varillas cuadrupolares aplicando voltajes alternos de RF y CC. La trayectoria de los iones dentro del cuadrupolo está influenciada por la presencia de los mismos voltajes a través de varillas opuestas. Al aplicar el voltaje de RF a CC, se puede estabilizar la trayectoria de los iones. Es esta propiedad del cuadrupolo la que le permite ser utilizado como un filtro de masa que puede dejar pasar selectivamente iones específicos. Dependiendo de la necesidad, un cuadrupolo se puede operar en el modo estático o en el modo de escaneo. El modo estático permite que solo pasen iones con un m / z especificado, lo que hace que el modo sea altamente selectivo y específico para el ion de interés. El modo de escaneo, por otro lado, permite que pasen iones en todo el rango m / z. Por lo tanto, los espectrómetros de masas cuadrupolo en tándem pueden operar de 4 maneras posibles: i) el primer cuadrupolo que opera en modo estático mientras que el segundo opera en modo de escaneo; ii) el primer cuadrupolo que funciona en el modo de escaneo mientras que el segundo funciona en el modo estático; iii) ambos cuadrupolos que operan en el modo de escaneo; y iv) ambos cuadrupolos que funcionan en modo estático3. En un experimento típico de MRM, ambos cuadrupolos operan en modo estático, lo que permite monitorear precursores específicos y sus productos resultantes después de la fragmentación. Esto hace que la técnica sea muy sensible y selectiva, lo que permite una cuantificación precisa.
Para los biólogos moleculares, el tejido cerebral humano y sus células son un tesoro. Estas notables unidades de un órgano siempre interesante del cuerpo humano pueden proporcionar información molecular y celular sobre su funcionamiento. Las investigaciones proteómicas del tejido cerebral no solo pueden ayudarnos a comprender el funcionamiento sistémico de un cerebro sano, sino también las vías celulares que se desregulan cuando son infligidas por alguna enfermedad4. Sin embargo, el tejido cerebral con toda su heterogeneidad es un órgano muy complejo de analizar y requiere un enfoque concertado para una mejor comprensión de los cambios a nivel molecular. El siguiente trabajo describe todo el flujo de trabajo desde la extracción de proteínas del tejido cerebral, la creación y optimización de los métodos para el ensayo mrm, hasta la validación de los objetivos(Figura 1). Aquí, hemos destacado sistemáticamente los principales pasos involucrados en un experimento exitoso basado en MRM utilizando tejido cerebral humano con el objetivo de introducir la técnica y sus desafíos a una comunidad de investigación más amplia.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile (MS grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A/0620/21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>TC194-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Fischer Scienific</td>
			<td>BP510-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid (MS grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>147930250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1149-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol (MS grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Q13827</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Fischer Scienific</td>
			<td>BP214-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol (MS grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A456-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS grade water</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>51140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>TL1006-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Roche Diagnostics</td>
			<td>11873580001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>DF6D661300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCEP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>646547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Merck</td>
			<td>648310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin (MS grade)</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>90058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Merck</td>
			<td>MB1D691237</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Supplies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypersil Gold C18 column</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>25002-102130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipettes</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F167380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stage tips</td>
			<td>MilliPore</td>
			<td>ZTC18M008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zirconia/Silica beads</td>
			<td>BioSpec products</td>
			<td>11079110z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bead beater (Homogeniser)</td>
			<td>Bertin Minilys</td>
			<td>P000673-MLYS0-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader (spectrophotometer)</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>MultiSkan Go</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td>Eutech</td>
			<td>CyberScan pH 510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Probe Sonicator</td>
			<td>Sonics Materials, Inc</td>
			<td>VCX 130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking Drybath</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>88880028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TSQ Altis mass spectrometer</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>TSQ02-10002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>uHPLC - Vanquish</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>VQF01-20001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum concentrator</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>Savant ISS 110</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative proteomics workflow using multiple reaction monitoring based detection of proteins from human brain tissue

El análisis proteómico del tejido cerebral humano durante la última década ha mejorado en gran medida nuestra comprensión del cerebro. Sin embargo, los trastornos relacionados con el cerebro siguen siendo un importante contribuyente de muertes en todo el mundo, lo que requiere la necesidad de una comprensión aún mayor de su patobiología. Las técnicas tradicionales basadas en anticuerpos como el western blotting o la inmunohistoquímica sufren de bajo rendimiento, además de ser intensivas en mano de obra y cualitativas o semicuantitativas. Incluso los enfoques convencionales de escopeta basados en espectrometría de masas no proporcionan evidencia concluyente para apoyar una determinada hipótesis. Los enfoques de proteómica dirigida se basan en gran medida en hipótesis y difieren de los enfoques de proteómica de escopeta convencionales que se han utilizado durante mucho tiempo. El monitoreo de reacciones múltiples es uno de esos enfoques específicos que requiere el uso de un espectrómetro de masas especial llamado espectrómetro de masas cuadrupolo en tándem o espectrómetro de masas cuadrupolo triple. En el estudio actual, hemos destacado sistemáticamente los principales pasos involucrados en la realización de un flujo de trabajo exitoso de proteómica basada en espectrometría de masas cuadrupolo en tándem utilizando tejido cerebral humano con el objetivo de introducir este flujo de trabajo a una comunidad de investigación más amplia.

Realizamos una cuantificación relativa de 3 proteínas de 10 muestras, 5 muestras de cada grupo de pacientes con anomalías en el cerebro. Estas proteínas incluyen la apolipoproteína A-I (APOA-I), la vimentina (VIM) y la nicotinamida fosforribosiltransferasa (NAMPT), que se sabe que desempeñan diversas funciones en las células cerebrales. El análisis posterior a la ejecución de los datos se realizó utilizando Skyline-daily (Ver 20.2.1.286). Se monitorizaron un total de 10 péptidos correspondientes a 3 proteínas...

Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Proteomics Workflow using Multiple Reaction Monitoring Based Detection of Proteins from Human Brain Tissue at JoVE.com

Quantitative Proteomics Workflow using Multiple Reaction Monitoring Based Detection of Proteins from Human Brain Tissue

El protocolo tiene como objetivo introducir el uso de un espectrómetro de masas de triple cuadrupolo para el monitoreo de reacción múltiple (MRM) de proteínas de muestras clínicas. Hemos proporcionado un flujo de trabajo sistemático desde la preparación de muestras hasta el análisis de datos para muestras clínicas con todas las precauciones necesarias a tomar.

Flujo de trabajo de proteómica cuantitativa utilizando la detección basada en el monitoreo de reacciones múltiples de proteínas del tejido cerebral humano

The proteomic analysis of the human brain tissue over the last decade has greatly enhanced our understanding of the brain. However, brain related ...

Los enfoques proteómicos dirigidos se están convirtiendo rápidamente en el método de elección para la validación de proteínas de experimentos basados en proteómica a corto plazo o de experimentos basados en biología molecular. El monitoreo de reacciones múltiples es uno de esos enfoques específicos que se utiliza cada vez más para detectar y cuantificar proteínas a partir de muestras biológicas. En este estudio hemos recorrido los diversos pasos involucrados en la detección y cuantificación de proteínas del tejido cerebral humano con la intención de presentar a los lectores los requisitos básicos de un experimento de MRM.Pesar alrededor de 50 mg de tejido cerebral y lavar el tejido con 300 microlitros de solución salina tamponada con fosfato 1x. Este paso se realiza para eliminar cualquier sangre en la superficie externa del tejido, y por lo tanto es aconsejable eliminar la mayor cantidad de sangre posible. Después de los lavados con PBS, agregue 300 microlitros de tampón de lisis al tubo que contiene el tejido.Lise el tejido con un sonicador de sonda mientras mantiene el tubo en un baño de hielo. Continúe con la homogeneización del tejido utilizando un batidor de cuentas para lisar completamente el tejido. Centrifugar el contenido del tubo a 6000 g durante 15 minutos a cuatro grados centígrados.Transfiera el sobrenadante a un tubo fresco y mezcle homogéneamente. Tome una pequeña alícuota del sobrenadante y cuantifique el contenido de proteína utilizando un ensayo de proteína estándar. Aquí mostramos un ejemplo de estimación de proteínas utilizando el ensayo de Bradford.Tome 50 microgramos de proteína en un tubo de microcentrífuga y reduzca el contenido agregando TCEP de tal manera que la concentración final sea de 20 milimolares. Incubar el contenido a 37 grados durante una hora. Después de la incubación, alquila las proteínas reducidas agregando yodoacetamida al tubo, de modo que la concentración final sea de 40 milimolares.Incubar el tubo en la oscuridad durante 30 minutos. Ahora agregue Buffer B al tubo que contiene las proteínas reducidas y alquiladas de tal manera que la concentración final de urea sea inferior a un molar. Agregue tripsina en 1 como a 30 proporción de enzima a proteína e incube los tubos durante la noche a 37 grados con agitación constante.Después de la digestión, concentre los péptidos digeridos en un concentrador de vacío. En este paso, los péptidos pueden reconstituirse y desalarse o almacenarse a menos 80 para su uso futuro. La desalinación, o limpieza de péptidos, es esencial antes de cargar las muestras en cualquier LC-MS MS. Las sales y otros contaminantes en la muestra pueden obstruir la columna y afectar la sensibilidad del instrumento a largo plazo.Este proceso se puede realizar utilizando puntas o columnas C18 STAGE disponibles comercialmente. Aquí hemos representado el flujo de trabajo para la desaline de péptidos utilizando una punta C18 STAGE. Después de la desalinación, seque los péptidos en un concentrador de vacío.Reconstituya estos péptidos limpios y proceda a la cuantificación utilizando el método Scopes. Para ello, cargue dos microlitros de la muestra en una placa de microgotas y calcule la concentración como se muestra en la diapositiva. La preparación de la lista de transición es un paso crucial en un experimento de SRM o MRM.Una lista de transición contiene toda la información requerida por el espectrómetro de masas para monitorear la transición. Esto incluye los valores m por z del precursor y los iones del producto, la energía de colisión de la transición, la polaridad del instrumento y el rango de tiempo para la adquisición de datos. Prepare la lista de transición con Skyline.Prepare un proteoma de fondo utilizando el archivo Human Proteome Fasta de UniProt y asegúrese de que esté seleccionado en la pestaña Fondo de Configuración de péptidos. En la pestaña Filtro, establezca una longitud mínima de 8 y una longitud máxima de 25. Continúe utilizando la configuración predeterminada si no hay otras modificaciones en los péptidos.Una vez que se hayan realizado los ajustes de péptidos, haga clic en Configuración de transición. En la pestaña Filtro, establezca Cargas precursoras como 2 y 3. Establezca las cargas de iones como 1 y establezca los tipos de iones en y.Los iones de producto se pueden seleccionar dependiendo de la elección del usuario. Deje todos los parámetros como predeterminados. Ahora inserte los ID de acceso de las proteínas diana seleccionadas.Esto se puede hacer haciendo clic en la pestaña Editar y luego seleccionando Insertar y finalmente pegando los ID de adhesión. Los ID se asignarán a las proteínas en el proteoma de fondo y se creará una lista de transición basada en la configuración de péptido y transición establecida anteriormente. Exporte esta lista de transición.Asegúrese de que el instrumento correcto está seleccionado haciendo clic en la opción desplegable Tipo de instrumento. En este caso, el instrumento es Thermo Altis. Dado que la lista de transición indefinida tiene demasiadas transiciones, mantenga un límite de solo 350 transiciones por lista y expórtela como varios métodos.Se utiliza un sistema de disolvente binario. El disolvente A es 1% FA y el disolvente B es 80% ACN. Mantenga el caudal a 450 microlitros por minuto y el gradiente como se muestra.Ajuste la temperatura del compartimento de la columna a 45 grados centígrados. Para obtener más detalles sobre la columna y el sistema LC, consulte el texto. Asegúrese de que la configuración de MS en su TSQ Altis sea la que se muestra aquí.Importe una sola lista de transición para crear un nuevo método. Sugerimos mantener la resolución para el cuadrupolo 1 y el cuadrupolo 3 en 7. Estos se pueden optimizar aún más si es necesario.Para garantizar la coherencia en las ejecuciones y, en consecuencia, la calidad de los datos, prepare la secuencia de ejecución como se muestra. Comience con un par de espacios en blanco, consulte el texto para la composición de la mezcla en blanco, seguido de un BSA de luz estándar de control de calidad de concentración conocida para monitorear cualquier variación en la respuesta diaria del instrumento. El control de calidad realizado debe ser justo antes de las muestras.A continuación, alinee todas las muestras con espacios en blanco en el medio. Inyecte volúmenes iguales de cada muestra, lo que representa de 25 a 1 nanogramo de péptidos por inyección. Para hacer un método refinado, primero ejecute los métodos indefinidos en muestras enteras.Importe los resultados en Skyline y compruebe manualmente cada péptido. Para cada péptido, seleccione un precursor que muestre picos consistentemente buenos en todas las muestras. Elimine los precursores y péptidos que no muestren buenos picos.Asegúrese de que todos los picos estén anotados correctamente. Para seleccionar el pico correcto y refinar aún más las transiciones debajo de cada precursor, se puede usar una biblioteca. Una biblioteca es un conjunto de datos espectrales de MS-MS emparejados con péptidos y transiciones de los datos experimentales actuales.Elija los picos que tengan valores DART P más cercanos a 1 y elimine las transiciones que no coincidan con la biblioteca. Un valor DART P denota qué tan buena es la coincidencia entre el pico experimental y el pico de la biblioteca. Después de una o dos rondas de optimización, una lista refinada estará lista.Esta lista refinada se puede ejecutar para muestras individuales. Importe las carreras refinadas en Skyline y anote los picos correctamente. Utilice la ficha Anotación en Configuración del documento para anotar cuidadosamente cada ejemplo de la cuadrícula del documento.Utilice la función Comparación de grupos para crear comparaciones entre la condición 1 y la condición 2 del experimento. Esto dará una tabla con valores de P ajustados y valores de cambio de pliegue entre los dos grupos. Hasta donde sabemos, este es el primer estudio que emplea el uso de MRM para detectar péptidos para las proteínas Apolipoproteína A-1, Vimentina y Nicotinamida fosforribosiltransferasa en muestras de tejido cerebral humano.La optimización de varios parámetros, como el gradiente LC, el tiempo de permanencia, el tiempo de ciclo y la energía de colisión, puede influir en gran medida en el éxito de un experimento MRM. Creemos que esta técnica se puede utilizar para desarrollar patrones de biomarcadores con capacidad para distinguir entre diferentes condiciones clínicas y enfermedades.

Research

JoVE Journal

Biology

A Chromatin Assay for Human Brain Tissue

Un ensayo de la cromatina de tejido cerebral humano

Chronic neuropsychiatric illnesses such as schizophrenia, bipolar disease and autism are thought to result from a combination of genetic and environmental ...

Investigación

Biología

Neuronal Nuclei Isolation from Human Postmortem Brain Tissue

Aislamiento de los núcleos neuronales a partir de tejido cerebral humano post-mortem

Neurons in the human brain become postmitotic largely during prenatal development, and thus maintain their nuclei throughout the full lifespan. However, ...

Monitoring Acupuncture Effects on Human Brain by fMRI

Efectos de la acupuntura en vigilancia por fMRI del cerebro humano

Functional MRI is used to study the effects of acupuncture on the BOLD response and the functional connectivity of the human brain.  Results demonstrate ...

Identification of protein complexes with quantitative proteomics in S. cerevisiae

Identificación de los complejos de proteínas con la proteómica cuantitativa en S. cerevisiae

Lipids are the building blocks of cellular membranes that function as barriers and in compartmentalization of cellular processes, and recently, as ...

Obtaining High Quality RNA from Single Cell Populations in Human Postmortem Brain Tissue

La obtención de ARN de alta calidad a partir de poblaciones de células individuales en tejido cerebral humano post-mortem

We proposed to investigate the gray matter reduction in the superior temporal gyrus seen in schizophrenia patients, by interrogating gene expression ...

High-throughput Crystallization of Membrane Proteins Using the Lipidic Bicelle Method

De alto rendimiento de cristalización de proteínas de membrana Utilizando el Método lipídico Bicelle

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane ...

A Quantitative Fitness Analysis Workflow

Un flujo de trabajo de Análisis Cuantitativo Gimnasio

Quantitative Fitness Analysis (QFA) is an experimental and computational workflow for comparing fitnesses of microbial cultures grown in parallel1,2,3,4. ...

Proteomic Sample Preparation from Formalin Fixed and Paraffin Embedded Tissue

Proteómica Preparación de muestras de formol fija y embebidos en parafina de tejidos

Preserved clinical material is a unique source for proteomic investigation of human disorders. Here we describe an optimized protocol allowing large scale ...

Identification of Protein Interaction Partners in Mammalian Cells Using SILAC-immunoprecipitation Quantitative Proteomics

Identificación de proteínas compañeros de interacción en células de mamífero utilizando SILAC-inmunoprecipitación cuantitativos Proteómica

Quantitative proteomics combined with immuno-affinity purification, SILAC immunoprecipitation, represent a powerful means for the discovery of novel ...

Selected Reaction Monitoring Mass Spectrometry for Absolute Protein Quantification

Reacción seleccionada Monitoreo espectrometría de masas para Absolute Proteína cuantificación

Absolute quantification of target proteins within complex biological samples is critical to a wide range of research and clinical applications. This ...