Name: quantitative proteomics workflow using multiple reaction monitoring based detection of proteins from human brain tissue
Uploaded: 2021-08-28T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Proteomics Workflow using Multiple Reaction Monitoring Based Detection of Proteins from Human Brain Tissue at JoVE.com

Vi bekräftar MHRD-UAY Project (UCHHATAR AVISHKAR YOJANA), projekt #34_IITB till SS och MASSFIITB Facility vid IIT Bombay med stöd av institutionen för bioteknik (BT/PR13114/INF/22/206/2015) för att utföra alla MS-relaterade experiment.
Vi vill särskilt tacka Rishabh Yadav för att han gjorde och redigerade hela videon och Mr. Nishant Nerurkar för hans arbete med att redigera ljudet.

Denna studie omfattar hjärnvävnadsprover från mänskliga deltagare, granskade och godkända av TMH och IITB IEC - (IITB-IEC/2018/019). Deltagarna gav sitt informerade och skriftliga samtycke till att delta i denna studie.
1 Proteinextraktion från hjärnvävnad
<ol><li>Väg cirka 50 mg hjärnvävnad och tvätta vävnaden med 300 μL 1x fosfatbuffert saltlösning (PBS) med hjälp av en mikropipett. OBS: Detta steg utförs för att avlägsna blod på vävnadens yttre yta och måste uppre...

<ol>
	<li>Picotti, P., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selected+reaction+monitoring-based+proteomics:+Workflows,+potential,+pitfalls+and+future+directions.">Selected reaction monitoring-based proteomics: Workflows, potential, pitfalls and future directions.</a> Nature Methods. , (2012).</li><li>Carr, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+peptide+measurements+in+biology+and+medicine:+Best+practices+for+mass+spectrometry-based+assay+development+using+a+fit-for-purpose+approach.">Targeted peptide measurements in biology and medicine: Best practices for mass spectrometry-based assay development using a fit-for-purpose approach.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 13 (3), 907-917 (2014).</li><li>Pitt, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+and+applications+of+liquid+chromatography-mass+spectrometry+in+clinical+biochemistry.">Principles and applications of liquid chromatography-mass spectrometry in clinical biochemistry.</a> The Clinical biochemist Reviews. 30 (1), 19-34 (2009).</li><li>Hosp, F., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Primer+on+Concepts+and+Applications+of+Proteomics+in+Neuroscience.">A Primer on Concepts and Applications of Proteomics in Neuroscience.</a> Neuron. 96 (3), 558-571 (2017).</li><li>Scopes, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+protein+by+spectrophotometry+at+205+nm.">Measurement of protein by spectrophotometry at 205 nm.</a> Analytical Biochemistry. , (1974).</li><li>Kusebauch, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+SRMAtlas:+A+Resource+of+Targeted+Assays+to+Quantify+the+Complete+Human+Proteome.">Human SRMAtlas: A Resource of Targeted Assays to Quantify the Complete Human Proteome.</a> Cell. , (2016).</li><li>MacLean, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skyline:+an+open+source+document+editor+for+creating+and+analyzing+targeted+proteomics+experiments.">Skyline: an open source document editor for creating and analyzing targeted proteomics experiments.</a> Bioinformatics. 26 (7), 966-968 (2010).</li><li>Gerber, S. A., Rush, J., Stemman, O., Kirschner, M. W., Gygi, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absolute+quantification+of+proteins+and+phosphoproteins+from+cell+lysates+by+tandem+MS.">Absolute quantification of proteins and phosphoproteins from cell lysates by tandem MS.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2003).</li><li>Escher, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+iRT,+a+normalized+retention+time+for+more+targeted+measurement+of+peptides.">Using iRT, a normalized retention time for more targeted measurement of peptides.</a> Proteomics. , (2012).</li><li>Gillette, M. A., Carr, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+peptides+and+proteins+in+biomedicine+by+targeted+mass+spectrometry.">Quantitative analysis of peptides and proteins in biomedicine by targeted mass spectrometry.</a> Nature Methods. 10 (1), 28-34 (2013).</li><li>Whiteaker, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+targeted+proteomics-based+pipeline+for+verification+of+biomarkers+in+plasma.">A targeted proteomics-based pipeline for verification of biomarkers in plasma.</a> Nature Biotechnology. , (2011).</li><li>H&#252;ttenhain, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproducible+quantification+of+cancer-associated+proteins+in+body+fluids+using+targeted+proteomics.">Reproducible quantification of cancer-associated proteins in body fluids using targeted proteomics.</a> Science Translational Medicine. 4 (142), 94 (2012).</li><li>Mermelekas, G., Vlahou, A., Zoidakis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SRM/MRM+targeted+proteomics+as+a+tool+for+biomarker+validation+and+absolute+quantification+in+human+urine.">SRM/MRM targeted proteomics as a tool for biomarker validation and absolute quantification in human urine.</a> Expert Review of Molecular Diagnostics. 15 (11), 1441-1454 (2015).</li><li>Koldamova, R. P., Lefterov, I. M., Lefterova, M. I., Lazo, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apolipoprotein+A-I+directly+interacts+with+amyloid+precursor+protein+and+inhibits+A&#946;+aggregation+and+toxicity.">Apolipoprotein A-I directly interacts with amyloid precursor protein and inhibits A&#946; aggregation and toxicity.</a> Biochemistry. , (2001).</li><li>Jiang, S. X., Slinn, J., Aylsworth, A., Hou, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vimentin+participates+in+microglia+activation+and+neurotoxicity+in+cerebral+ischemia.">Vimentin participates in microglia activation and neurotoxicity in cerebral ischemia.</a> Journal of Neurochemistry. , (2012).</li><li>Liu, L. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nicotinamide+Phosphoribosyltransferase+May+Be+Involved+in+Age-Related+Brain+Diseases.">Nicotinamide Phosphoribosyltransferase May Be Involved in Age-Related Brain Diseases.</a> PLoS ONE. , (2012).</li><li>Abbatiello, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+guidelines+for+publication+of+manuscripts+describing+development+and+application+of+targeted+mass+spectrometry+measurements+of+peptides+and+proteins.">New guidelines for publication of manuscripts describing development and application of targeted mass spectrometry measurements of peptides and proteins.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 16 (3), 327-328 (2017).</li></ol>

Tekniker som Immunohistochemistry och Western blotting ansågs vara guldstandarderna för validering av proteinmål i många år. Dessa metoder använder sig än i dag av smärre ändringar i protokollet och litet beroende av teknik, vilket gör dem mycket besvärliga och tråkiga. Utöver detta innebär de också användning av dyra antikroppar som inte alltid visar samma specificitet över partier och kräver en hel del expertis. Dessutom har endast en liten del av proteiner som identifieras med hjälp av tekniker med...

Under det senaste decenniet har den snabba utvecklingen inom masspektrometri (MS) i kombination med ökad förståelse för kromatografitekniker i hög grad bidragit till utvecklingen av MS-baserade proteomiker. Molekylärbiologiska tekniker som western blotting och immunohistochemistry har länge lidit av reproducerbarhetsproblem, långsam leveranstid, variabilitet mellan observatörer och deras oförmåga att exakt kvantifiera proteiner, för att nämna några. För detta ändamål fortsätter den överlägsna känsligheten hos proteomiska metoder med hög genomströmning att erbjuda molekylärbiologer ett alternativt och mer tillförlitligt verktyg i sin strävan att bättre förstå proteinernas roller i celler. Hagelgevärsproteomikmetoder (Data dependent Acquisition eller DDA) misslyckas dock ofta med att upptäcka låga rikliga proteiner i komplexa vävnader förutom att vara starkt beroende av instrumentets känslighet och upplösning. Under de senaste åren har labb runt om i världen utvecklat tekniker som Data Independent Acquisition (DIA) som kräver ökad datorkraft och pålitlig programvara som kan hantera dessa mycket komplexa datamängder. Dessa tekniker är dock fortfarande ett pågående arbete och inte särskilt användarvänligt. Riktade MS-baserade proteomikmetoder ger en perfekt balans mellan ms-metodernas höga genomströmningskaraktär och känsligheten hos molekylärbiologiska metoder som ELISA. Ett riktat masspektrometribaserat proteomikexperiment fokuserar på att upptäcka hypotesdrivna proteiner eller peptider från upptäcktsbaserade hagelgevärsproteomiska experiment eller genom tillgänglig litteratur1,2. Multipla reaktionsövervakning (MRM) är en sådan riktad MS-metod som använder en tandem fyrdubbel masspektrometer för korrekt detektion och kvantifiering av proteiner/peptider från komplexa prover. Tekniken ger högre känslighet och specificitet trots att det kräver användning av ett lågupplöst instrument.
En fyrdubbel är tillverkad av 4 parallella stavar, med varje stång ansluten till den diagonalt motsatta stången. Ett fluktuerande fält skapas mellan fyrdubbelstavarna genom att använda alternerande RF- och LIKSTRÖMSspänningar. Jonens bana inuti fyrdubbla påverkas av närvaron av samma spänningar över motsatta stavar. Genom att applicera RF på likströmsspänning kan jonens bana stabiliseras. Det är denna egenskap hos fyrdubbla som gör att den kan användas som ett massfilter som selektivt kan låta specifika joner passera igenom. Beroende på behovet kan en fyrdubbel manövreras i antingen statiskt läge eller skanningsläge. Det statiska läget tillåter endast joner med en angiven m/z att passera genom, vilket gör läget mycket selektivt och specifikt för jonen av intresse. Skanningsläget å andra sidan tillåter joner över hela m/z-området att passera igenom. Tandem fyrdubbla masspektrometrar kan således fungera på 4 möjliga sätt: i) den första fyrdubbla som arbetar i statiskt läge medan den andra arbetar i skanningsläge; ii) Den första fyrdubbel som arbetar i skanningsläge medan den andra arbetar i statiskt läge. iii) Båda fyrlingarna i skanningsläge. och iv) båda fyrlingarna i statiskt läge3. I ett typiskt MRM-experiment arbetar båda fyrdubbelerna i statiskt läge så att specifika prekursorer och deras resulterande produkter efter fragmentering kan övervakas. Detta gör tekniken mycket känslig och selektiv och möjliggör noggrann kvantifiering.
För molekylärbiologer är den mänskliga hjärnvävnaden och dess celler en skattkista. Dessa anmärkningsvärda enheter av ett ständigt intressant organ i människokroppen kan ge molekylära och cellulära insikter om dess funktion. Proteomiska undersökningar av hjärnvävnaden kan inte bara hjälpa oss att förstå den systemiska funktionen hos en frisk hjärna utan också de cellulära vägarna som blir dysregulerade när de orsakas av någon sjukdom4. Hjärnvävnaden med all sin heterogenitet är dock ett mycket komplext organ att analysera och kräver ett samordnat tillvägagångssätt för en bättre förståelse av förändringarna på molekylär nivå. Följande arbete beskriver hela arbetsflödet som börjar direkt från att extrahera proteiner från hjärnvävnad, skapa och optimera metoderna för MRM-analys till validering av målen (figur 1). Här har vi systematiskt lyft fram de viktigaste stegen i ett framgångsrikt MRM-baserat experiment med hjälp av mänsklig hjärnvävnad i syfte att introducera tekniken och dess utmaningar för ett bredare forskarsamhälle.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile (MS grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A/0620/21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>TC194-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Fischer Scienific</td>
			<td>BP510-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid (MS grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>147930250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1149-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol (MS grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Q13827</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Fischer Scienific</td>
			<td>BP214-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol (MS grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A456-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS grade water</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>51140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>TL1006-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Roche Diagnostics</td>
			<td>11873580001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>DF6D661300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCEP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>646547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Merck</td>
			<td>648310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin (MS grade)</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>90058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Merck</td>
			<td>MB1D691237</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Supplies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypersil Gold C18 column</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>25002-102130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipettes</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F167380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stage tips</td>
			<td>MilliPore</td>
			<td>ZTC18M008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zirconia/Silica beads</td>
			<td>BioSpec products</td>
			<td>11079110z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bead beater (Homogeniser)</td>
			<td>Bertin Minilys</td>
			<td>P000673-MLYS0-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader (spectrophotometer)</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>MultiSkan Go</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td>Eutech</td>
			<td>CyberScan pH 510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Probe Sonicator</td>
			<td>Sonics Materials, Inc</td>
			<td>VCX 130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking Drybath</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>88880028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TSQ Altis mass spectrometer</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>TSQ02-10002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>uHPLC - Vanquish</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>VQF01-20001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum concentrator</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>Savant ISS 110</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative proteomics workflow using multiple reaction monitoring based detection of proteins from human brain tissue

Den proteomiska analysen av den mänskliga hjärnvävnaden under det senaste decenniet har kraftigt förbättrat vår förståelse av hjärnan. Hjärnrelaterade sjukdomar fortsätter dock att vara en stor bidragande orsak till dödsfall runt om i världen, vilket kräver behovet av ännu större förståelse för deras patobiologi. Traditionella antikroppsbaserade tekniker som western blotting eller immunohistochemistry lider av att vara låggenomströmning förutom att vara arbetsintensiva och kvalitativa eller semikvantitativa. Även konventionella masspektrometribaserade hagelgevärsmetoder misslyckas med att ge avgörande bevis för att stödja en viss hypotes. Riktade proteomics metoder är till stor del hypotesdrivna och skiljer sig från konventionella hagelgevär proteomics metoder som har använts länge. Övervakning av flera reaktioner är en sådan riktad metod som kräver användning av en speciell masspektrometer som kallas tandem fyrdubbel masspektrometer eller trippel fyrdubbel masspektrometer. I den aktuella studien har vi systematiskt lyft fram de viktigaste stegen i att utföra ett framgångsrikt tandem fyrdubbelt masspektrometribaserat proteomikarbetsflöde med hjälp av mänsklig hjärnvävnad i syfte att introducera detta arbetsflöde till en bredare forskargemenskap.

Vi utförde relativ kvantifiering av 3 proteiner från 10 prover, 5 prover från varje grupp av patienter med avvikelser i hjärnan. Dessa proteiner inkluderade Apolipoprotein A-I (APOA-I), Vimentin (VIM) och Nikotinamidfosforibosyltransferas (NAMPT) som är kända för att utföra olika roller i hjärncellerna. Efterkörningsanalys av data utfördes med Skyline-daily (Ver 20.2.1.286). Totalt övervakades 10 peptider motsvarande 3 proteiner. Dessa inkluderade 3 peptider för APOA-I, 4 peptider för VIM och 3 peptider fö...

Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Proteomics Workflow using Multiple Reaction Monitoring Based Detection of Proteins from Human Brain Tissue at JoVE.com

Quantitative Proteomics Workflow using Multiple Reaction Monitoring Based Detection of Proteins from Human Brain Tissue

Protokollet syftar till att införa användning av en trippel fyrdubbel masspektrometer för multipla reaktionsövervakning (MRM) av proteiner från kliniska prover. Vi har tillhandahållit ett systematiskt arbetsflöde från provberedning till dataanalys för kliniska prover med alla nödvändiga försiktighetsåtgärder som ska vidtas.

Kvantitativt proteomikarbetsflöde med hjälp av flera reaktionsövervakningsbaserade detektion av proteiner från mänsklig hjärnvävnad

The proteomic analysis of the human brain tissue over the last decade has greatly enhanced our understanding of the brain. However, brain related ...

Riktade proteommiska metoder håller snabbt på att bli den metod som kan väljas för validering av proteiner från kortsiktiga proteomikbaserade experiment eller från molekylärbiologiska experiment. Övervakning av flera reaktioner är ett sådant målinriktat tillvägagångssätt som i allt högre grad används för att upptäcka och kvantifiera proteiner från biologiska prover. I denna studie har vi gått igenom de olika stegen som är involverade i att upptäcka och kvantifiera proteiner från mänsklig hjärnvävnad med avsikt att introducera läsarna till de grundläggande kraven för ett MRM-experiment.Väg cirka 50 mg hjärnvävnad och tvätta vävnaden med 300 mikroliter 1x fosfatbuffrad saltlösning. Detta steg utförs för att ta bort blod på vävnadens yttre yta, och därför är det lämpligt att ta bort så mycket blod som möjligt. Efter tvätt med PBS, tillsätt 300 mikroliter lysbuffert till röret som innehåller vävnaden.Lysa vävnaden med hjälp av en sondsonicator samtidigt som röret på ett isbad. Fortsätt med vävnad homogenisering med en pärlviser för att helt lysa vävnaden. Centrifugera innehållet i röret vid 6000 g i 15 minuter vid fyra grader celsius.Överför supernaten till ett färskt rör och blanda homogent. Ta en liten alikvot av supernatanten och kvantifiera proteinhalten med hjälp av en standardproteinanalys. Här visar vi ett exempel på proteinuppskattning med Bradford Assay.Ta 50 mikrogram protein i ett mikrocentrifugrör och minska innehållet genom att tillsätta TCEP så att den slutliga koncentrationen är 20 millimolar. Inkubera innehållet vid 37 grader i en timme. Efter inkubation alkylerar alkylat de reducerade proteinerna genom att tillsätta jodacetamid till röret, så att den slutliga koncentrationen är 40 millimolar.Inkubera röret i mörker i 30 minuter. Lägg nu till buffert B till röret som innehåller de reducerade och alkylerade proteinerna så att den slutliga koncentrationen av urea är mindre än en molar. Tillsätt trypsin i 1 om 30 enzym-till-protein-förhållande och inkubera rören över natten vid 37 grader med konstant skakning.Efter matsmältningen, koncentrera de smälta peptiderna i en vakuumkoncentrator. I detta steg kan peptiderna antingen rekonstitueras och avsaltas eller lagras vid minus 80 för framtida användning. Avsaltning, eller peptidrengöring, är viktigt innan proverna laddas på någon LC-MS MS. Salter och andra föroreningar i provet kan täppa till kolonnen och påverka instrumentets känslighet på lång sikt.Den här processen kan utföras med hjälp av kommersiellt tillgängliga C18 STAGE-tips eller kolumner. Här har vi skildrat arbetsflödet för peptiddesaltning med hjälp av ett C18 STAGE-tips. Torka peptiderna i en vakuumkoncentrator efter avsaltning.Rekonstruera dessa rena peptider och fortsätt för kvantifiering med hjälp av Scopes-metoden. För detta, ladda två mikroliter av provet i en mikrodroppplatta och beräkna koncentrationen som visas i bilden. Förberedelse av övergångslista är ett avgörande steg i ett SRM- eller MRM-experiment.En övergångslista innehåller all information som krävs av masspektrometern för att övervaka övergången. Detta inkluderar m by z-värdena för föregångaren och produktjonerna, kollisionsenergin i övergången, instrumentets polaritet och tidsintervallet för datainsamling. Förbered övergångslistan med Skyline.Förbered en bakgrundsproteom med human proteome fasta fil från UniProt och se till att den väljs under fliken Bakgrund i peptidinställningar. På fliken Filter anger du en minsta längd på 8 och maximal längd på 25. Fortsätt att använda standardinställningarna om det inte finns några andra modifieringar i peptiderna.När peptidinställningarna har gjorts klickar du på Övergångsinställningar. Ställ in prekursoravgifter som 2 och 3 under fliken Filter. Ställ in jonladdningar som 1 och ställ in jontyper på y.Produktjoner kan väljas beroende på användarens val. Lämna alla parametrar som standard. Sätt nu in anslutnings-ID:t för de valda målproteinerna.Detta kan göras genom att klicka på fliken Redigera och sedan välja Infoga och slutligen klistra in anslutnings-ID: t. ID:t kommer att mappas till proteinerna i bakgrundsproteomen och en övergångslista skapas utifrån de peptid- och övergångsinställningar som ställts in tidigare. Exportera den här övergångslistan.Se till att rätt instrument väljs genom att klicka på alternativet Rullgardinsmenyn Instrumenttyp. I detta fall är instrumentet Thermo Altis. Eftersom den odefinierade övergångslistan har för många övergångar, behåll en gräns på endast 350 övergångar per lista och exportera som flera metoder.Ett binärt lösningsmedelssystem används. Lösningsmedel A är 1%FA och lösningsmedel B är 80%ACN. Håll flödeshastigheten på 450 mikroliter per minut och övertoningen enligt bilden.Ställ in kolonnfackets temperatur på 45 grader Celsius. Mer information om kolumn- och LC-system finns i text. Se till att MS-inställningarna i TSQ Altis är som visas här.Importera en enda övergångslista för att skapa en ny metod. Vi föreslår att hålla upplösningen för fyrdubbel 1 och fyrdubbel 3 vid 7. Dessa kan optimeras ytterligare vid behov.Förbered körningssekvensen enligt bilden för att säkerställa konsekvens i körningar och därmed datakvaliteten. Börja med ett par ämnen, se texten för sammansättning av blindblandning, följt av en QC standardljus BSA av känd koncentration för att övervaka eventuella variationer i instrumentets dagsmässigt svar. QC gjort bör vara precis före proverna.Rada sedan upp alla exempel med lösa skott däremellan. Injicera lika stora volymer av varje prov, vilket motsvarar 25 till 1 nanogram peptider per injektion. Om du vill göra en förfinad metod kör du först de odefinierade metoderna mot hela prover.Importera resultat till Skyline och kontrollera varje peptid manuellt. För varje peptid väljer du en föregångare som visar genomgående bra toppar i alla prover. Ta bort prekursorer och peptider som inte visar bra toppar.Se till att alla toppar är korrekt kommenterade. Om du vill välja rätt topp och ytterligare förfina övergångarna under varje föregångare kan ett bibliotek användas. Ett bibliotek är en uppsättning MS-MS spektraldata som matchas med peptider och övergångar av aktuella experimentella data.Välj toppar som har DART P-värden närmare 1 och ta bort övergångar som inte matchar biblioteket. Ett DART P-värde anger hur bra matchningen är mellan den experimentella toppen och bibliotekstoppen. Efter en eller två optimeringsrundor kommer en förfinad lista att vara klar.Den här förfinade listan kan köras för enskilda exempel. Importera de raffinerade körningarna till Skyline och kommentera toppar korrekt. Använd fliken Anteckning under Dokumentinställningar för att kommentera varje exempel i dokumentrutnätet noggrant.Använd funktionen Gruppjämförelse för att skapa jämförelser mellan villkor 1 och villkor 2 i experimentet. Detta ger tabell med justerade P-värden och vikningsändringsvärden mellan de två grupperna. Vår kännedom om detta är den första studien som använder mrm för att upptäcka peptider för proteinerna Apolipoprotein A-1, Vimentin och Nikotinamidfosforibosyltransferas i mänskliga hjärnvävnadsprover.Att optimera olika parametrar som LC-gradient, uppehållstid, cykeltid och kollisionsenergi kan i hög grad påverka framgången för ett MRM-experiment. Vi tror att denna teknik kan användas för att utveckla mönster av biomarkörer med förmåga att skilja mellan olika kliniska tillstånd och sjukdomar.

Research

JoVE Journal

Biology

A Chromatin Assay for Human Brain Tissue

En kromatin-analys för mänskliga hjärnvävnaden

Chronic neuropsychiatric illnesses such as schizophrenia, bipolar disease and autism are thought to result from a combination of genetic and environmental ...

Neuronal Nuclei Isolation from Human Postmortem Brain Tissue

Neuronal Nuclei Isolering från Human obduktion hjärnvävnad

Neurons in the human brain become postmitotic largely during prenatal development, and thus maintain their nuclei throughout the full lifespan. However, ...

Monitoring Acupuncture Effects on Human Brain by fMRI

Övervakning Akupunktur Effekter på Human Brain av fMRI

Functional MRI is used to study the effects of acupuncture on the BOLD response and the functional connectivity of the human brain.  Results demonstrate ...

Identification of protein complexes with quantitative proteomics in S. cerevisiae

Kartläggning av protein komplex med kvantitativa proteomik i S. cerevisiae

Lipids are the building blocks of cellular membranes that function as barriers and in compartmentalization of cellular processes, and recently, as ...

Obtaining High Quality RNA from Single Cell Populations in Human Postmortem Brain Tissue

Erhålla hög kvalitet RNA från Single cellpopulationer i Human obduktion hjärnvävnad

We proposed to investigate the gray matter reduction in the superior temporal gyrus seen in schizophrenia patients, by interrogating gene expression ...

High-throughput Crystallization of Membrane Proteins Using the Lipidic Bicelle Method

Hög genomströmning Kristallisering av membranproteiner Använda Lipidic Bicelle Metod

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane ...

A Quantitative Fitness Analysis Workflow

En kvantitativ Fitness analys Workflow

Quantitative Fitness Analysis (QFA) is an experimental and computational workflow for comparing fitnesses of microbial cultures grown in parallel1,2,3,4. ...

Proteomic Sample Preparation from Formalin Fixed and Paraffin Embedded Tissue

Proteomic Provberedning från formalinfixerade och paraffininbäddade vävnads

Preserved clinical material is a unique source for proteomic investigation of human disorders. Here we describe an optimized protocol allowing large scale ...

Identification of Protein Interaction Partners in Mammalian Cells Using SILAC-immunoprecipitation Quantitative Proteomics

Identifiering av proteininteraktioner Partners i däggdjursceller med användning SILAC-immunoprecipitation Kvantitativa Proteomics

Quantitative proteomics combined with immuno-affinity purification, SILAC immunoprecipitation, represent a powerful means for the discovery of novel ...

Selected Reaction Monitoring Mass Spectrometry for Absolute Protein Quantification

Vald Reaction Monitoring masspektrometri för Absolute protein kvantifiering

Absolute quantification of target proteins within complex biological samples is critical to a wide range of research and clinical applications. This ...