Name: quantitative proteomics workflow using multiple reaction monitoring based detection of proteins from human brain tissue
Uploaded: 2021-08-28T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Proteomics Workflow using Multiple Reaction Monitoring Based Detection of Proteins from Human Brain Tissue at JoVE.com

MS ile ilgili tüm deneyleri gerçekleştirmek için Biyoteknoloji Bölümü (BT/PR13114/INF/22/206/2015) tarafından desteklenen IIT Bombay'daki SS ve MASSFIITB Tesisi'ne #34_IITB MHRD-UAY Projesi'ni (UCHHATAR AVISHKAR YOJANA) kabul ediyoruz.
Tüm videoyu yaptığı ve düzenlediği için Bay Rishabh Yadav'a ve sesi düzenleme çalışmalarından dolayı Bay Nishant Nerurkar'a özel teşekkürlerimizi sunuyoruz.

Bu çalışma, TMH ve IITB IEC tarafından incelenen ve onaylanan insan katılımcılardan alınan beyin dokusu örneklerini içerir - (IITB-IEC/2018/019). Katılımcılar bu çalışmaya katılmak için bilgilendirilmiş ve yazılı onaylarını sunmaktadır.
1 Beyin dokusundan protein ekstraksiyonu
<ol><li>Yaklaşık 50 mg beyin dokusu ağırlığında ve bir mikropipette kullanarak dokuyu 300 μL 1x fosfat tampon salin (PBS) ile yıkayın. NOT: Bu adım, dokunun dış yüzeyindeki herh...

<ol>
	<li>Picotti, P., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selected+reaction+monitoring-based+proteomics:+Workflows,+potential,+pitfalls+and+future+directions.">Selected reaction monitoring-based proteomics: Workflows, potential, pitfalls and future directions.</a> Nature Methods. , (2012).</li><li>Carr, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+peptide+measurements+in+biology+and+medicine:+Best+practices+for+mass+spectrometry-based+assay+development+using+a+fit-for-purpose+approach.">Targeted peptide measurements in biology and medicine: Best practices for mass spectrometry-based assay development using a fit-for-purpose approach.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 13 (3), 907-917 (2014).</li><li>Pitt, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+and+applications+of+liquid+chromatography-mass+spectrometry+in+clinical+biochemistry.">Principles and applications of liquid chromatography-mass spectrometry in clinical biochemistry.</a> The Clinical biochemist Reviews. 30 (1), 19-34 (2009).</li><li>Hosp, F., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Primer+on+Concepts+and+Applications+of+Proteomics+in+Neuroscience.">A Primer on Concepts and Applications of Proteomics in Neuroscience.</a> Neuron. 96 (3), 558-571 (2017).</li><li>Scopes, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+protein+by+spectrophotometry+at+205+nm.">Measurement of protein by spectrophotometry at 205 nm.</a> Analytical Biochemistry. , (1974).</li><li>Kusebauch, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+SRMAtlas:+A+Resource+of+Targeted+Assays+to+Quantify+the+Complete+Human+Proteome.">Human SRMAtlas: A Resource of Targeted Assays to Quantify the Complete Human Proteome.</a> Cell. , (2016).</li><li>MacLean, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skyline:+an+open+source+document+editor+for+creating+and+analyzing+targeted+proteomics+experiments.">Skyline: an open source document editor for creating and analyzing targeted proteomics experiments.</a> Bioinformatics. 26 (7), 966-968 (2010).</li><li>Gerber, S. A., Rush, J., Stemman, O., Kirschner, M. W., Gygi, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absolute+quantification+of+proteins+and+phosphoproteins+from+cell+lysates+by+tandem+MS.">Absolute quantification of proteins and phosphoproteins from cell lysates by tandem MS.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2003).</li><li>Escher, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+iRT,+a+normalized+retention+time+for+more+targeted+measurement+of+peptides.">Using iRT, a normalized retention time for more targeted measurement of peptides.</a> Proteomics. , (2012).</li><li>Gillette, M. A., Carr, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+peptides+and+proteins+in+biomedicine+by+targeted+mass+spectrometry.">Quantitative analysis of peptides and proteins in biomedicine by targeted mass spectrometry.</a> Nature Methods. 10 (1), 28-34 (2013).</li><li>Whiteaker, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+targeted+proteomics-based+pipeline+for+verification+of+biomarkers+in+plasma.">A targeted proteomics-based pipeline for verification of biomarkers in plasma.</a> Nature Biotechnology. , (2011).</li><li>H&#252;ttenhain, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproducible+quantification+of+cancer-associated+proteins+in+body+fluids+using+targeted+proteomics.">Reproducible quantification of cancer-associated proteins in body fluids using targeted proteomics.</a> Science Translational Medicine. 4 (142), 94 (2012).</li><li>Mermelekas, G., Vlahou, A., Zoidakis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SRM/MRM+targeted+proteomics+as+a+tool+for+biomarker+validation+and+absolute+quantification+in+human+urine.">SRM/MRM targeted proteomics as a tool for biomarker validation and absolute quantification in human urine.</a> Expert Review of Molecular Diagnostics. 15 (11), 1441-1454 (2015).</li><li>Koldamova, R. P., Lefterov, I. M., Lefterova, M. I., Lazo, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apolipoprotein+A-I+directly+interacts+with+amyloid+precursor+protein+and+inhibits+A&#946;+aggregation+and+toxicity.">Apolipoprotein A-I directly interacts with amyloid precursor protein and inhibits A&#946; aggregation and toxicity.</a> Biochemistry. , (2001).</li><li>Jiang, S. X., Slinn, J., Aylsworth, A., Hou, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vimentin+participates+in+microglia+activation+and+neurotoxicity+in+cerebral+ischemia.">Vimentin participates in microglia activation and neurotoxicity in cerebral ischemia.</a> Journal of Neurochemistry. , (2012).</li><li>Liu, L. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nicotinamide+Phosphoribosyltransferase+May+Be+Involved+in+Age-Related+Brain+Diseases.">Nicotinamide Phosphoribosyltransferase May Be Involved in Age-Related Brain Diseases.</a> PLoS ONE. , (2012).</li><li>Abbatiello, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+guidelines+for+publication+of+manuscripts+describing+development+and+application+of+targeted+mass+spectrometry+measurements+of+peptides+and+proteins.">New guidelines for publication of manuscripts describing development and application of targeted mass spectrometry measurements of peptides and proteins.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 16 (3), 327-328 (2017).</li></ol>

İmmünohistokinoloji ve Batı şişkinliği gibi teknikler uzun yıllar boyunca protein hedeflerinin doğrulanmasında altın standartlar olarak kabul edildi. Bu yöntemler, protokoldeki küçük değişiklikler ve teknolojiye çok az bağımlılık ile bugün bile kullanım bulur ve bu da onları çok hantal ve sıkıcı hale getirir. Bunun yanı sıra, partiler arasında her zaman aynı özgüllüğü göstermeyen ve çok fazla uzmanlık gerektiren pahalı antikorların kullanımını da içerirler. Ek olarak, kütle...

Son on yılda, kütle spektrometreslerindeki (MS) hızlı gelişmeler ve kromatografi tekniklerinin daha fazla anlaşılması, MS tabanlı proteomiklerin ilerlemesine büyük ölçüde yardımcı oldu. Batı şişkinliği ve immünhistokimya gibi moleküler biyoloji tabanlı teknikler uzun zamandır tekrarlanabilirlik sorunları, yavaş geri dönüş süresi, gözlemciler arası değişkenlik ve proteinleri doğru bir şekilde ölçememelerinden muzdariptir. Bu amaçla, yüksek verimli proteomik yaklaşımların üstün duyarlılığı, moleküler biyologlara proteinlerin hücrelerdeki rollerini daha iyi anlama arayışında alternatif ve daha güvenilir bir araç sunmaya devam ediyor. Bununla birlikte, av tüfeği proteomik yaklaşımları (Veriye bağımlı Edinme veya DDA), genellikle cihazın hassasiyetine ve çözünürlüğüne büyük ölçüde güvenmenin yanı sıra karmaşık dokularda düşük bol proteinleri tespit edemez. Son birkaç yıldır, dünyanın dört bir yanındaki laboratuvarlar, daha fazla bilgi işlem gücü ve bu son derece karmaşık veri kümelerini işleyebilen güvenilir yazılım gerektiren Veri Bağımsız Edinimi (DIA) gibi teknikler geliştiriyor. Ancak, bu teknikler hala devam eden bir çalışmadır ve çok kullanıcı dostu değildir. Hedeflenen MS tabanlı proteomik yaklaşımlar, MS yaklaşımlarının yüksek verimli doğası ile ELISA gibi moleküler biyoloji yaklaşımlarının hassasiyeti arasında mükemmel bir denge sağlar. Hedefli kütle spektrometresi tabanlı proteomik deney, hipotez güdümlü proteinleri veya peptitleri keşif tabanlı av tüfeği proteomik deneylerinden veya mevcut literatür1,2aracılığıyla tespit etmeye odaklanır. Çoklu Reaksiyon İzleme (MRM), karmaşık örneklerden proteinlerin/peptitlerin doğru tespiti ve nicelleştirilmesi için tandem dörtlü kütle spektrometresi kullanan bu tür hedefli bir MS yaklaşımıdır. Teknik, düşük çözünürlüklü bir cihazın kullanılmasını gerektirmesine rağmen daha yüksek hassasiyet ve özgüllük sunar.
Dörtgen, her çubuğu çapraz olarak karşı çubuğa bağlı olan 4 paralel çubuktan yapılmıştır. Dörtlü çubuklar arasında alternatif RF ve DC gerilimleri uygulanarak dalgalı bir alan oluşturulur. Dörtlünün içindeki iyonların yörüngesi, karşı çubuklar boyunca aynı voltajların varlığından etkilenir. RF'yi DC voltaja uygulayarak, iyonların yörüngesi stabilize edilebilir. Dörtlünün bu özelliği, belirli iyonların geçmesine seçici olarak izin verebilen bir kütle filtresi olarak kullanılmasına izin verir. İhtiyace bağlı olarak, bir dörtlü statik modda veya tarama modunda çalıştırılabilir. Statik mod, yalnızca belirli bir m/z'ye sahip iyonların geçmesine izin verir, bu da modu son derece seçici ve ilgi iyonlarına özgü hale getirir. Öte yandan tarama modu, tüm m/z aralığındaki iyonların geçmesine izin verir. Böylece, tandem dörtlü kütle spektrometreleri 4 olası şekilde çalışabilir: i) statik modda çalışan ilk dörtlü, ikincisi ise tarama modunda çalışır; ii) tarama modunda çalışan ilk dörtlü, ikincisi ise statik modda çalışır; iii) tarama modunda çalışan her iki dörtlü; ve iv) statik modda çalışan her iki dörtlü3. Tipik bir MRM deneyinde, her iki dörtlü de statik modda çalışır ve parçalanmadan sonra belirli öncüllerin ve elde edilen ürünlerinin izlenmesini sağlar. Bu, tekniği çok hassas ve seçici hale getirerek doğru niceleme sağlar.
Moleküler biyologlar için, insan beyin dokusu ve hücreleri bir hazinedir. İnsan vücudunun sürekli ilginç bir organının bu olağanüstü birimleri, işleyişi hakkında moleküler ve hücresel içgörüler sağlayabilir. Beyin dokusunun proteomik incelemeleri sadece sağlıklı bir beynin sistemik işleyişini anlamamıza yardımcı olmakla kalmaz, aynı zamanda bazı hastalıklar tarafından ortaya çıktığında disregüle olan hücresel yolları da anlamamıza yardımcı olabilir4. Bununla birlikte, tüm heterojenliği ile beyin dokusu analiz etmek için çok karmaşık bir organdır ve moleküler düzeydeki değişikliklerin daha iyi anlaşılması için uyumlu bir yaklaşım gerektirir. Aşağıdaki çalışma, beyin dokusundan proteinlerin çıkarılmasından, MRM test yöntemlerinin oluşturulmasından ve optimizelanmasından hedeflerin doğrulanmasına kadar tüm iş akışını açıklar (Şekil 1). Burada, tekniği ve zorluklarını daha geniş bir araştırma topluluğuna tanıtmak amacıyla insan beyin dokusunu kullanarak yapılan başarılı MRM tabanlı bir deneyde yer alan önemli adımları sistematik olarak vurguladık.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile (MS grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A/0620/21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>TC194-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Fischer Scienific</td>
			<td>BP510-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid (MS grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>147930250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1149-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol (MS grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Q13827</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Fischer Scienific</td>
			<td>BP214-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol (MS grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A456-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS grade water</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>51140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>TL1006-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Roche Diagnostics</td>
			<td>11873580001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>DF6D661300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCEP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>646547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Merck</td>
			<td>648310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin (MS grade)</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>90058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Merck</td>
			<td>MB1D691237</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Supplies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypersil Gold C18 column</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>25002-102130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipettes</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F167380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stage tips</td>
			<td>MilliPore</td>
			<td>ZTC18M008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zirconia/Silica beads</td>
			<td>BioSpec products</td>
			<td>11079110z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bead beater (Homogeniser)</td>
			<td>Bertin Minilys</td>
			<td>P000673-MLYS0-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader (spectrophotometer)</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>MultiSkan Go</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td>Eutech</td>
			<td>CyberScan pH 510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Probe Sonicator</td>
			<td>Sonics Materials, Inc</td>
			<td>VCX 130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking Drybath</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>88880028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TSQ Altis mass spectrometer</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>TSQ02-10002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>uHPLC - Vanquish</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>VQF01-20001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum concentrator</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>Savant ISS 110</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative proteomics workflow using multiple reaction monitoring based detection of proteins from human brain tissue

Son on yılda insan beyin dokusunun proteomik analizi beyin anlayışımızı büyük ölçüde artırdı. Bununla birlikte, beyinle ilgili bozukluklar, patobiyolojilerinin daha da fazla anlaşılması ihtiyacını gerektiren, dünyadaki ölümlerin önemli bir katkısı olmaya devam ediyor. Batı şişkinliği veya immünhistokimya gibi geleneksel antikor bazlı teknikler, emek yoğun ve nitel veya yarı nicel olmanın yanı sıra düşük verimden muzdariptir. Geleneksel kütle spektrometresi bazlı av tüfeği yaklaşımları bile belirli bir hipotezi destekleyecek kesin kanıtlar sunamaz. Hedefli proteomik yaklaşımlar büyük ölçüde hipotez odaklıdır ve uzun süredir kullanımda olan geleneksel av tüfeği proteomik yaklaşımlarından farklıdır. Çoklu reaksiyon izleme, tandem dörtlü kütle spektrometresi veya üçlü dörtlü kütle spektrometresi adı verilen özel bir kütle spektrometresinin kullanılmasını gerektiren bu tür hedefli bir yaklaşımdır. Mevcut çalışmada, bu iş akışını daha geniş bir araştırma topluluğuna tanıtmak amacıyla insan beyin dokusunu kullanarak başarılı bir tandem dörtlü kütle spektrometresi tabanlı proteomik iş akışının gerçekleştirilmesinde önemli adımları sistematik olarak vurguladık.

10 numuneden 3 proteinin, beyinde anormallikleri olan her hasta grubundan 5 numunenin göreli nicelemesini gerçekleştirdik. Bu proteinler arasında beyin hücrelerinde çeşitli roller üstlenerek bilinen Apolipoprotein A-I (APOA-I), Vimentin (VIM) ve Nikotinamid fosforibosyltransferaz (NAMPT) yer aldı. Verilerin çalıştırma sonrası analizi Skyline-daily (Ver 20.2.1.286) kullanılarak gerçekleştirildi. 3 proteine karşılık gelen toplam 10 peptit izlendi. Bunlar arasında APOA-I için 3 peptit, VIM için 4 pept...

Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Proteomics Workflow using Multiple Reaction Monitoring Based Detection of Proteins from Human Brain Tissue at JoVE.com

Quantitative Proteomics Workflow using Multiple Reaction Monitoring Based Detection of Proteins from Human Brain Tissue

Protokol, klinik örneklerden elde edilen proteinlerin Çoklu Reaksiyon İzlemesi (MRM) için üçlü dörtlü kütle spektrometresi kullanımını sağlamayı amaçlamaktadır. Alınması gereken tüm önlemlerle klinik numuneler için numune hazırlamadan veri analizine kadar sistematik bir iş akışı sağladık.

İnsan Beyin Dokusundan Proteinlerin Çoklu Reaksiyon İzleme Tabanlı Tespiti Kullanılarak Nicel Proteomik İş Akışı

The proteomic analysis of the human brain tissue over the last decade has greatly enhanced our understanding of the brain. However, brain related ...

Hedeflenen proteomik yaklaşımlar, proteinlerin kısa süreli proteomik tabanlı deneylerden veya moleküler biyoloji tabanlı deneylerden doğrulanması için tercih edilen yöntem haline gelmektedir. Çoklu reaksiyon izleme, biyolojik örneklerden elde edilen proteinleri tespit etmek ve ölçmek için giderek daha fazla kullanılan bu hedefli bir yaklaşımdır. Bu çalışmada, okuyucuları bir MRM deneyinin temel gereksinimleriyle tanıştırmak amacıyla insan beyin dokusundan proteinlerin tespit ve ölçülmesinde yer alan çeşitli adımlardan geçtik.Yaklaşık 50 mg beyin dokusu ağırlığında ve dokuyu 300 mikrolitre 1x fosfat tamponlu salin ile yıkayın. Bu adım, dokunun dış yüzeyindeki herhangi bir kanı çıkarmak için gerçekleştirilir ve bu nedenle mümkün olduğunca fazla kan çıkarılması tavsiye edilir. PBS ile yıkamaları takiben, dokuyu içeren tüpe 300 mikrolitre lizis tamponu ekleyin.Tüpü buz banyosunda tutarken sonda sonicator kullanarak dokuyu lyse. Dokuyu tamamen izlendirmek için boncuk çırpıcı kullanarak doku homojenizasyonuna devam edin. Tüpün içeriğini 6000 g'da dört santigrat derecede 15 dakika santrifüjleyin.Süpernatant taze bir tüpe aktarın ve homojen bir şekilde karıştırın. Süpernatanttan küçük bir aliquot alın ve standart bir protein tahlili kullanarak protein içeriğini ölçün. Burada Bradford Assay kullanarak protein tahmini örneği gösteriyoruz.Bir mikrosantrifüj tüpüne 50 mikrogram protein alın ve son konsantrasyon 20 milimolar olacak şekilde TCEP ekleyerek içeriği azaltın. İçeriği bir saat boyunca 37 derecede kuluçkaya yatır. Kuluçkadan sonra, tüpe iodoasetamid ekleyerek azaltılmış proteinleri alkillatın, böylece son konsantrasyon 40 milimolardır.Tüpü 30 dakika boyunca karanlıkta kuluçkaya bırakın. Şimdi tüpe B Tamponu ekleyin, azaltılmış ve alkillenmiş proteinleri içeriyordu, böylece ürenin son konsantrasyonu bir azı dişinden az. 30 enzim-protein oranına kadar 1'de tripsin ekleyin ve tüpleri sürekli sallanarak 37 derecede bir gecede kuluçkaya yatırın.Sindirimden sonra, sindirilen peptitleri bir vakum konsantratöründe konsantre edin. Bu adımda, peptitler yeniden inşa edilebilir ve tuzdan arındırılabilir veya gelecekteki kullanım için eksi 80'de saklanabilir. Numuneleri herhangi bir LC-MS MS'e yüklemeden önce tuzdan arındırma veya peptit temizleme önemlidir. Numunedeki tuzlar ve diğer kirleticiler sütunu tıkayabilir ve uzun vadede cihazın hassasiyetini etkileyebilir.Bu işlem, piyasada bulunan C18 STAGE ipuçları veya sütunları kullanılarak gerçekleştirilebilir. Burada bir C18 STAGE ucu kullanarak peptit tuzdan arındırma için iş akışını tasvir ettik. Tuzdan arındırma yaptıktan sonra, peptitleri bir vakum konsantratöründe kurutun.Bu temiz peptitleri yeniden oluşturan ve Scopes yöntemini kullanarak niceleme için devam edin. Bunun için, numunenin iki mikrolitresini bir mikro damla plakasına yükleyin ve slaytta gösterildiği gibi konsantrasyonu hesaplayın. Geçiş listesi hazırlığı, bir SRM veya MRM denemesinde çok önemli bir adımdır.Bir geçiş listesi, geçişi izlemek için kütle spektrometresinin gerektirdiği tüm bilgileri içerir. Bu, öncül ve ürün iyonlarının m by z değerlerini, geçişin çarpışma enerjisini, cihazın polaritesini ve veri toplama zaman aralığını içerir. Skyline'ı kullanarak geçiş listesini hazırlayın.UniProt'tan Human Proteome Fasta dosyasını kullanarak bir arka plan proteom hazırlayın ve Peptit Ayarları'nın Arka Plan sekmesi altında seçildiğinden emin olun. Filtre sekmesinde, en az 8 uzunluk ve maksimum 25 uzunluk ayarlayın. Peptitlerde başka değişiklik yoksa varsayılan ayarları kullanmaya devam edin.Peptit ayarları yapıldıktan sonra Geçiş Ayarları'na tıklayın. Filtre sekmesinin altında Öncül ücretleri 2 ve 3 olarak ayarlayın. İyon ücretlerini 1 olarak ayarlayın ve İyon türlerini y olarak ayarlayın.Ürün iyonları kullanıcının seçimine bağlı olarak seçilebilir. Tüm parametreleri varsayılan olarak bırakın. Şimdi seçilen hedef proteinlerin katılım kimliklerini ekleyin.Bu, Düzenle sekmesine tıklayıp Ekle'yi seçip son olarak katılım kimliklerini yapıştırarak yapılabilir. Kimlikler, arka plan proteomunda bulunan proteinlere ve daha önce belirlenen peptit ve geçiş ayarlarına göre oluşturulan bir geçiş listesine eşlenecektir. Bu geçiş listesini verin.Enstrüman türü açılır menüsü seçeneğine tıklayarak doğru cihazın seçildiğini emin olun. Bu durumda, cihaz Thermo Altis'tir. Tanımlanmamış geçiş listesinde çok fazla geçiş olduğundan, liste başına yalnızca 350 geçiş sınırı tutun ve birden çok yöntem olarak dışa aktar.İkili çözücü sistemi kullanılır. Solvent A %1 FA ve Solvent B %80 ACN'dir. Akış hızını dakikada 450 mikroliterde ve gösterildiği gibi degradede tutun.Sütun bölmesi sıcaklığını 45 santigrat derece olarak ayarlayın. Sütun ve LC sistemi hakkında daha fazla bilgi için metne bakın. TSQ Altis'inizdeki MS ayarlarının burada gösterildiği gibi olduğundan emin olun.Yeni bir yöntem oluşturmak için tek bir geçiş listesi alın. Dörtlü 1 ve dörtlü 3 çözünürlüğünü 7'de tutmanızı öneririz. Bunlar gerekirse daha da optimize edilebilir.Çalıştırmalarda tutarlılık ve dolayısıyla veri kalitesini sağlamak için, çalışma sıranızı gösterildiği gibi hazırlayın. Birkaç boşlukla başlayın, boş karışımın bileşimi için metne bakın, ardından cihazın gün açısından tepkisindeki herhangi bir varyasyonu izlemek için bilinen konsantrasyonda bir QC standart ışık BSA'sı. QC'nin işi numunelerden hemen önce olmalı.Sonra tüm örnekleri arada boşluklarla hizala. Enjeksiyon başına 25 ila 1 nanogram peptit oluşturan her numunenin eşit hacimlerini enjekte edin. İyileştirilmiş bir yöntem yapmak için, önce tanımlanmamış yöntemleri tüm örneklere karşı çalıştırın.Sonuçları Skyline'a içe aktarın ve her peptidi manuel olarak kontrol edin. Her peptit için, tüm örneklerde sürekli olarak iyi zirveler gösteren bir öncü seçin. İyi zirveler göstermeyen öncülleri ve peptitleri silin.Tüm zirvelere düzgün bir şekilde açıklama ekli olduğundan emin olun. Doğru tepe noktasını seçmek ve her öncül altındaki geçişleri daha da iyileştirmek için bir kitaplık kullanılabilir. Kitaplık, peptitler ve mevcut deneysel verilerin geçişleriyle eşleşen bir MS-MS spektral veri kümesidir.DART P değerleri 1'e yakın olan tepeleri seçin ve kitaplıkla eşleşmeyen geçişleri kaldırın. DART P değeri, deneysel tepe ile kütüphane zirvesi arasındaki eşleşmenin ne kadar iyi olduğunu gösterir. Bir veya iki tur optimizasyondan sonra, rafine bir liste hazır olacaktır.Bu rafine liste tek tek örnekler için çalıştırılabilir. Rafine çalıştırmaları Skyline'a içe aktarın ve tepelere düzgün bir şekilde açıklama ekleme. Belge kılavuzundaki her örneğe dikkatlice açıklama eklemek için Belge Ayarları altındaki Ek Açıklama sekmesini kullanın.Denemenizin Koşul 1 ve Koşul 2 arasında karşılaştırmalar oluşturmak için Grup Karşılaştırma özelliğini kullanın. Bu, ayarlanmış P değerlerine sahip tablo ve iki grup arasında katlama değişim değerleri verecektir. Bilgimize göre, bu, insan beyin dokusu örneklerinde Apolipoprotein A-1, Vimentin ve Nikotinamid fosforibosyltransfeaz proteinleri için peptitleri tespit etmek için MRM kullanımını kullanan ilk çalışmadır.LC gradyanı, durma süresi, çevrim süresi ve çarpışma enerjisi gibi çeşitli parametreleri optimize etmek, MRM deneyinin başarısını büyük ölçüde etkileyebilir. Bu tekniğin, farklı klinik koşullar ve hastalıkları ayırt etme yeteneğine sahip biyobelirteç kalıpları geliştirmek için kullanılabileceğini inanıyoruz.

Research

JoVE Journal

Biology

A Chromatin Assay for Human Brain Tissue

İnsan Beyninin Doku Kromatin Testi

Chronic neuropsychiatric illnesses such as schizophrenia, bipolar disease and autism are thought to result from a combination of genetic and environmental ...

Neuronal Nuclei Isolation from Human Postmortem Brain Tissue

İnsan Postmortem Beyin Dokusu Nöronal Çekirdekler İzolasyon

Neurons in the human brain become postmitotic largely during prenatal development, and thus maintain their nuclei throughout the full lifespan. However, ...

Monitoring Acupuncture Effects on Human Brain by fMRI

FMRI İnsan Beyninin izlenmesi Akupunktur Etkileri

Functional MRI is used to study the effects of acupuncture on the BOLD response and the functional connectivity of the human brain.  Results demonstrate ...

Identification of protein complexes with quantitative proteomics in S. cerevisiae

S. cerevisiae, kantitatif proteomik protein kompleksleri tanımlanması

Lipids are the building blocks of cellular membranes that function as barriers and in compartmentalization of cellular processes, and recently, as ...

Obtaining High Quality RNA from Single Cell Populations in Human Postmortem Brain Tissue

İnsan Postmortem Beyin Dokusu Tek Hücre Popülasyonlar Yüksek Kalite RNA Alınması

We proposed to investigate the gray matter reduction in the superior temporal gyrus seen in schizophrenia patients, by interrogating gene expression ...

High-throughput Crystallization of Membrane Proteins Using the Lipidic Bicelle Method

Yüksek verim Kristalizasyon lipidik Bicelle Yöntemiyle Membran Proteinleri

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane ...

A Quantitative Fitness Analysis Workflow

Kantitatif Spor Analizi İş Akışı

Quantitative Fitness Analysis (QFA) is an experimental and computational workflow for comparing fitnesses of microbial cultures grown in parallel1,2,3,4. ...

Proteomic Sample Preparation from Formalin Fixed and Paraffin Embedded Tissue

Formalin gelen Proteomic Numune Hazırlama parafin blok doku Sabit ve

Preserved clinical material is a unique source for proteomic investigation of human disorders. Here we describe an optimized protocol allowing large scale ...

Identification of Protein Interaction Partners in Mammalian Cells Using SILAC-immunoprecipitation Quantitative Proteomics

SILAC-immunoprecipitation Kantitatif PROTEOMİK kullanma Memeli Hücrelerde Protein Etkileşim Ortakların Kimlik

Quantitative proteomics combined with immuno-affinity purification, SILAC immunoprecipitation, represent a powerful means for the discovery of novel ...

Selected Reaction Monitoring Mass Spectrometry for Absolute Protein Quantification

Mutlak Protein Niceleme Kütle Spektrometresi İzleme Seçilen Tepki

Absolute quantification of target proteins within complex biological samples is critical to a wide range of research and clinical applications. This ...