Name: genome engineering of primary human b cells using crispr/cas9
Uploaded: 2020-11-03T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Genome Engineering of Primary Human B Cells Using CRISPR/Cas9 at JoVE.com

इस काम को बच्चों के कैंसर अनुसंधान कोष (CCRF) और NIH R01 AI146009 से बी एस.M के लिए वित्त पोषित किया गया था ।

एक स्थानीय ब्लड बैंक से स्वस्थ रक्तदाताओं से ल्यूकाफेरेसिस के नमूने प्राप्त किए गए । यहां वर्णित सभी प्रयोगों को संस्थागत समीक्षा बोर्ड (आईआरबी) द्वारा अनुसंधान के लिए छूट देने की ठान ली गई थी और मिने?...

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	<li>LeBien, T. W., Thomas, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B+lymphocytes:+how+they+develop+and+function.">B lymphocytes: how they develop and function.</a> Blood. 112 (5), 1570-1580 (2008).</li><li>Nutt, S. L., Hodgkin, P. D., Tarlinton, D. M., Corcoran, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+generation+of+antibody-secreting+plasma+cells.">The generation of antibody-secreting plasma cells.</a> Nature Reviews Immunology. 15, 160-171 (2015).</li><li>Slifka, M. K., Antia, R., Whitmire, J. 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L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+protein-secreting+plasma+cells+by+homology-directed+repair+in+primary+human+B+cells.">Engineering protein-secreting plasma cells by homology-directed repair in primary human B cells.</a> Molecular Therapy. 26 (2), 456-467 (2018).</li><li>Cui, Y., Xu, J., Cheng, M., Liao, X., Peng, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+of+CRISPR/Cas9+sgRNA+design+tools.">Review of CRISPR/Cas9 sgRNA design tools.</a> Interdisciplinary Sciences. 10 (2), 455-465 (2018).</li><li>Rees, H. A., Liu, D. 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O., Porteus, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-mediated+integration+of+large+gene+cassettes+using+AAV+donor+vectors.">CRISPR-mediated integration of large gene cassettes using AAV donor vectors.</a> Cell Reports. 20 (3), 750-756 (2017).</li><li>Shirley, J. L., de Jong, Y. P., Terhorst, C., Herzog, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+responses+to+viral+gene+therapy+vectors.">Immune responses to viral gene therapy vectors.</a> Molecular Therapy. 28 (3), 709-722 (2020).</li><li>Martino, A. T., Markusic, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+response+mechanisms+against+AAV+vectors+in+animal+models.">Immune response mechanisms against AAV vectors in animal models.</a> Molecular Therapy - Methods and Clinical Development. 17, 198-208 (2020).</li></ol>

प्राथमिक मानव बी कोशिकाओं में सटीक जीनोम इंजीनियरिंग हाल ही में9,10तक चुनौतीपूर्ण रही है । हमने पहले प्राथमिक मानव बी कोशिकाओं9को इंजीनियर करने के लिए CRISPR/Cas9 का उपयोग करके ?...

बी कोशिकाएं हेमेटोपोइटिक स्टेम सेल से प्राप्त लिम्फोसाइट वंश का एक उपसमूह हैं। वे प्रतिरक्षा चुनौतियों के प्रत्युत्तर में बड़ी मात्रा में एंटीबॉडी का उत्पादन करके अनुकूली ह्यूमरल इम्यून सिस्टम में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। बी कोशिकाएं स्मृति बी कोशिकाओं और मरणासन्न विभेदित, लंबे समय तक रहने वाली प्लाज्मा कोशिकाओं के अग्रदूत भी हैं, जिससे स्थायी ह्यूमरल प्रतिरक्षा2प्रदान की जाती है। प्लाज्मा कोशिकाओं, विशेष रूप से, उनके लिए एक विशिष्ट एंटीबॉडी की बड़ी मात्रा में उत्पादन करने की क्षमता में प्रतिरक्षा कोशिकाओं के बीच अद्वितीय हैं, जबकि साल या दशकों के लिए जीवित3। इसके अतिरिक्त, परिधीय रक्त से अलगाव की आसानी बी-सेल वंश को उपन्यास सेल-आधारित चिकित्सा4के लिए एक उत्कृष्ट उम्मीदवार बनाती है।
पहले, यादृच्छिक एकीकरण विधियों, जैसे लेंटीविराल वैक्टर या स्लीपिंग ब्यूटी ट्रांसपोसन का उपयोग करने वाले, ट्रांसजीन डिलीवरी और अभिव्यक्ति5,6,7,8के लिए बी कोशिकाओं को इंजीनियर करने के लिए उपयोग किया गया है। हालांकि, इन दृष्टिकोणों की गैर-विशिष्ट प्रकृति बी कोशिकाओं में एक विशिष्ट जीन के जैविक कार्यों का अध्ययन करना मुश्किल बनाती है और इसमें सम्मिलनीय म्यूटेनेसिस और वेरिएबल ट्रांसजीन अभिव्यक्ति और/या चिकित्सीय सेटिंग में मुंह बंद होने का अंतर्निहित जोखिम होता है ।
CRISPR/Cas9 प्रणाली एक शक्तिशाली जीनोम इंजीनियरिंग उपकरण है जो शोधकर्ताओं को कई प्रजातियों में विभिन्न कोशिकाओं के जीनोम को ठीक से संपादित करने की अनुमति देता है । हाल ही में, हमारे अपने सहित दो समूहों ने प्राथमिक मानव बी कोशिकाओं9,10के पूर्व वीवो विस्तार और लक्षित जीनोम इंजीनियरिंग के लिए सफलतापूर्वक तरीके विकसित किए हैं। हम एक ल्यूकाफोरसिस नमूने से प्राथमिक मानव बी कोशिकाओं को शुद्ध करने की प्रक्रिया का वर्णन करेंगे। उसके बाद, हम बी-सेल विस्तार और अलग बी कोशिकाओं की सक्रियता के लिए हमारे अद्यतन प्रोटोकॉल का वर्णन करेंगे। इसके बाद हम सक्रिय बी कोशिकाओं में CD19 sgRNA के साथ CRISPR/Cas9 mRNA को पेश करने के लिए इलेक्ट्रोपाउशन द्वारा भेदभाव 19 (सीडी 19), एक विशिष्ट बी-सेल रिसेप्टर और बी कोशिकाओं की एक बानगी के क्लस्टर को खटखटाने के लिए एक प्रक्रिया का वर्णन करेंगे ।
Cas9 mRNA अनुवाद हो जाता है और CD19 sgRNA के लिए एक CRISPR/Cas9-sgRNA ribonucleoprotein परिसर (RNP) बनाने के लिए बांधता है । इसके बाद, परिसर में sgRNA Cas9 जीन के exon 2 पर लक्ष्य अनुक्रम पर डबल स्ट्रैंड ब्रेक (डीएसबी) बनाने के लिए जाता है । कोशिकाएं न्यूक्लियोटिड्स को शुरू करने या हटाने के द्वारा डीएसबी की मरम्मत करेंगी, जिससे फ्रेमशिफ्ट उत्परिवर्तन हो जाएगा और जीन को खटखटाया जा सकेगा । हम तो प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा CD19 के नुकसान को मापने और अपघटन (ज्वार) विश्लेषण द्वारा indels की ट्रैकिंग द्वारा indel गठन का विश्लेषण करेंगे ।
इसके बाद हम एडेनो से जुड़े वायरस इंटीग्रेशन साइट 1 (AAVS1) जीन में बढ़ी हुई ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन(ईजीएफपी) की साइट-विशिष्ट प्रविष्टि को मध्यस्थता करने के लिए एक रिकॉम्बिनेंट AAV6 वेक्टर (rAAV6, होमोलॉजी-निर्देशित मरम्मत (एचडीआर) के लिए एक दाता टेम्पलेट के साथ CRISPR/Cas9 का उपयोग करने की प्रक्रिया का वर्णन करेंगे । AAVS1 जीन ज्ञात जैविक कार्यों और मानव जीनोम पर एक एएवी वायरल एकीकरण साइट के बिना एक सक्रिय लोकस है; इसलिए, इसे जीनोम इंजीनियरिंग के लिए "सुरक्षित बंदरगाह" माना जाता है। यहां, हम रिपोर्ट करते हैं कि बी कोशिकाओं के विस्तार और सक्रियण ने संस्कृति के 7 दिनों(चित्रा 1)में 44 गुना विस्तार की अनुमति दी। बी कोशिकाओं के इलेक्ट्रोपाउशन ने 24 घंटे के बाद ट्रांसफैक्शन पर समग्र कोशिका स्वास्थ्य(चित्रा 2 ए)की थोड़ी कमी दिखाई । सीडी 19 मार्कर(चित्रा 2B)के स्कैटर प्लॉट विश्लेषण ने संपादित कोशिकाओं(चित्रा 2 सी)में 83% की कमी दिखाई।
क्रोमेटोग्राफ(चित्रा 3 ए)के ज्वार विश्लेषण से पता चला है कि% इनडेल फ्लो साइटोमेट्री(चित्रा 3B)द्वारा% प्रोटीन हानि के समान थे। केवाई प्रयोग के फ्लो साइटोमेट्री विश्लेषण से पता चला है कि आरएनपी के साथ मिलकर एएवी वेक्टर(चित्रा 4)प्राप्त करने वाली कोशिकाओं ने 64% ईजीएफपी-पॉजिटिव कोशिकाओं(चित्रा 5A)को व्यक्त किया और बाद में जंक्शन पॉलीमरेज चेन रिएक्शन (पीसीआर)(चित्रा 5B)द्वारा सफल एकीकरण प्रदर्शित किया। सेल की गिनती से पता चला है कि सभी नमूनों को जल्दी से 3 दिनों के भीतर बरामद के बाद इंजीनियरिंग(चित्रा 5C)।

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alt-R S.p. Cas9 Nuclease V3 protein, 500 ug</td>
			<td>IDT</td>
			<td>1081059</td>
			<td>smaller size is also available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amaxa P3 primary cell 4D- Nucleofector X Kit S (32 RCT)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>V4XP-3032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium-chloride-potassium (ACK) lysing buffer</td>
			<td>Quality Biological</td>
			<td>118-156-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CleanCap chemically modified Cas9 mRNA</td>
			<td>Trilink Biotechnology</td>
			<td>L-7206-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CpG ODN 2006 (ODN 7909) 5 mg</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>TLRL-2006-5</td>
			<td>different sizes available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostor CS10, 100 mL</td>
			<td>STEMCELL Technology</td>
			<td>7930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTS Immune Cell SR</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A2596101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySep human B cells isolation kit</td>
			<td>STEMCELL Technology</td>
			<td>17954</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eBioscience fixable viability dye eFlour 780</td>
			<td>eBiosciences</td>
			<td>65-0865-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excellerate B cell media, Xeno-free</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>CCM031</td>
			<td>B-cell basal medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 14 mL Polypropylene Round-bottom Tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>S11550</td>
			<td>For thawing B cells only</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll-Paque Plus</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-1440-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneMate SnapStrip&#174; 8-Strip 0.2 mL PCR Tubes with Individual Attached Dome Caps</td>
			<td>BioExpress</td>
			<td>T-3035-1 / 490003-692</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyclone 0.0067M PBS (No Ca, No Mg) or 1x PBS</td>
			<td>GE lifesciences</td>
			<td>SH30256.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lonza 4D Nucleofector core unit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>AAF-1002B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lonza 4D Nucleofector X unit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>AAF-1002X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mega CD40 Ligand</td>
			<td>Enzo Life Sciences</td>
			<td>ALX-522-110-C010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mr. Frosty</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1562-1EA</td>
			<td>For freezing cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/Strep 100X</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>TMS-AB2-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP anti-human CD19 clone HIB19</td>
			<td>biolegend</td>
			<td>302228</td>
			<td>smaller size is also available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rAAV6 SA-GFP pakaging ( with our SA-GFP cassette see Figure 4.)</td>
			<td>Vigene Biosciences</td>
			<td>N/A</td>
			<td>large scale packaging, 1e13 GC/mL, 500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human IL-10 protein 250 ug</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>217-IL-250</td>
			<td>different sizes available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human IL-15 protein 25 ug</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>247-ILB-025</td>
			<td>different sizes available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The Big Easy EasySep Magnet</td>
			<td>STEMCELL Technology</td>
			<td>18001</td>
			<td>different sizes available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-EDTA (TE) buffer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2476100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

genome engineering of primary human b cells using crispr/cas9

बी कोशिकाएं हेमेटोपोइटिक स्टेम कोशिकाओं से प्राप्त लिम्फोसाइट्स हैं और अनुकूली प्रतिरक्षा प्रणाली के विनोदी हाथ का एक प्रमुख घटक हैं। वे परिधीय रक्त से अलगाव की आसानी, विट्रो में विस्तार करने की उनकी क्षमता, और वीवो में उनकी दीर्घायु के कारण सेल आधारित चिकित्सा के लिए आकर्षक उम्मीदवार बनाते हैं । इसके अतिरिक्त, उनके सामान्य जैविक कार्य- बड़ी मात्रा में एंटीबॉडी का उत्पादन करने के लिए- बहुत बड़ी मात्रा में चिकित्सीय प्रोटीन व्यक्त करने के लिए उपयोग किया जा सकता है, जैसे कि संक्रमण से लड़ने के लिए एक रीकॉम्बिनेंट एंटीबॉडी, या एंजाइमोपैथी के उपचार के लिए एक एंजाइम। यहां, हम प्राथमिक मानव बी कोशिकाओं को परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं (पीबीएमसी) से अलग करने और विट्रो में अलग-थलग बी कोशिकाओं को सक्रिय/विस्तारित करने के लिए विस्तृत तरीके प्रदान करते हैं । हम तो बी कोशिकाओं में अंतर्जात जीन के साइट विशिष्ट KO के लिए CRISPR/Cas9 प्रणाली का उपयोग करने में शामिल कदम प्रदर्शित करता है । यह विधि विभिन्न जीनों के कुशल KO के लिए अनुमति देती है, जिसका उपयोग ब्याज के जीन के जैविक कार्यों का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है। इसके बाद हम बी कोशिकाओं में ट्रांसजीन अभिव्यक्ति कैसेट के कुशल साइट-विशिष्ट एकीकरण के लिए एक रिकॉम्बिनेंट, एडेनो-संबद्ध, वायरल (आरएवी) वेक्टर के साथ CRISPR/Cas9 प्रणाली का उपयोग करने के लिए कदम प्रदर्शित करते हैं । साथ में, यह प्रोटोकॉल एक कदम-दर-कदम इंजीनियरिंग मंच प्रदान करता है जिसका उपयोग प्राथमिक मानव बी कोशिकाओं में जीन के जैविक कार्यों के साथ-साथ बी-सेल चिकित्सा के विकास के लिए किया जा सकता है।

अद्यतन विस्तार और सक्रियण प्रोटोकॉल ने 7 दिनों में 44 गुना तक बी कोशिकाओं के तेजी से विस्तार को सक्षम किया(चित्र 1,n =3 दाताओं)। KO प्रयोग में, ट्राइपैन ब्लू स्टेनिंग का उपयोग करके बी-सेल काउंट ने न?...

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Genome Engineering of Primary Human B Cells Using CRISPR/Cas9

यहां हम बी कोशिकाओं में जीन के जैविक कार्यों और बी-सेल चिकित्सा के विकास का अध्ययन करने के लिए जीन नॉकआउट (KO) और नॉक-इन (KI) के लिए प्राथमिक मानव बी कोशिकाओं के CRISPR/Cas9-आधारित जीनोम इंजीनियरिंग के लिए एक विस्तृत, कदम-दर-कदम प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं ।

CRISPR/Cas9 का उपयोग कर प्राथमिक मानव बी कोशिकाओं के जीनोम इंजीनियरिंग

B cells are lymphocytes derived from hematopoietic stem cells and are a key component of the humoral arm of the adaptive immune system. They make ...

Research

JoVE Journal

Biology

Gross and Fine Dissection of Inner Ear Sensory Epithelia in Adult Zebrafish (Danio rerio)

Gross and Fine Dissection of Inner Ear Sensory Epithelia in Adult Zebrafish Danio rerio

प्रौढ़ Zebrafish में इनर कान संवेदी epithelia के सकल और ठीक विच्छेदन ( Danio rerio)

Neurosensory epithelia in the inner ear are the crucial structures for hearing and balance functions. Therefore, it is important to understand the ...

Generation of Human CD40-activated B cells

मानव CD40 सक्रिय बी कोशिकाओं का सृजन

CD40-activated B cells (CD40-B cells) have been identified as an alternative source of immuno-stimulatory antigen-presenting cells (APC) for cancer ...

Na&iuml;ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures

NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures

प्राथमिक मानव तंतुकोशिका संस्कृति से भोले वयस्क स्टेम सेल अलगाव

Over the last decade, several adult stem cell  populations have been identified in human skin 1-4.  The isolation of multipotent adult dermal precursors ...

Mouse Genome Engineering Using Designer Nucleases

डिजाइनर न्युक्लिअसिज़ का उपयोग कर माउस जीनोम इंजीनियरिंग

Transgenic mice carrying site-specific genome modifications (knockout, knock-in) are of vital importance for dissecting complex biological systems as well ...

Generation of Genomic Deletions in Mammalian Cell Lines via CRISPR/Cas9

CRISPR / Cas9 के माध्यम से स्तनधारी सेल लाइनों में जीनोमिक विलोपन का सृजन

The prokaryotic clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated (Cas) 9 system may be re-purposed for site-specific ...

Whole Cell Electrophysiology of Primary Cultured Murine Enterochromaffin Cells

प्राथमिक संस् Murine Enterochromaffin कक्षों की संपूर्ण कक्ष इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी

Enterochromaffin (EC) cells in the gastrointestinal (GI) epithelium constitute the largest subpopulation of enteroendocrine cells. As specialized sensory ...

In Situ Monitoring of Transiently Formed Molecular Chaperone Assemblies in Bacteria, Yeast, and Human Cells

बैक्टीरिया, खमीर, और मानव कोशिकाओं में क्षणिक रूप से गठित आणविक Chaperone विधानसभाओं की सीटू निगरानी में

J-domain proteins (JDPs) form the largest and the most diverse co-chaperone family in eukaryotic cells. Recent findings show that specific members of the ...

Silencing the Spark: CRISPR/Cas9 Genome Editing in Weakly Electric Fish

स्पार्क को सिलिंग: कमजोर इलेक्ट्रिक मछली में CRISPR/Cas9 जीनोम संपादन

Electroreception and electrogenesis have changed in the evolutionary history of vertebrates. There is a striking degree of convergence in these ...

Preparing and Injecting Embryos of Culex Mosquitoes to Generate Null Mutations using CRISPR/Cas9

Preparing and Injecting Embryos of Culex Mosquitoes to Generate Null Mutations using CRISPR/Cas9

CRISPR/Cas9 का उपयोग करके नल उत्परिवर्तन उत्पन्न करने के लिए क्यूलेक्स मच्छरों के भ्रूण तैयार करना और इंजेक्शन लगाना

Culex mosquitoes are the major vectors of several diseases that negatively impact human and animal health including West Nile virus and diseases caused by ...

Construction of Homozygous Mutants of Migratory Locust Using CRISPR/Cas9 Technology

The migratory locust, Locusta migratoria, is not only one of the worldwide plague locusts that caused huge economic losses to human beings but also an ...