Name: genome engineering of primary human b cells using crispr/cas9
Uploaded: 2020-11-03T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Genome Engineering of Primary Human B Cells Using CRISPR/Cas9 at JoVE.com

この研究は、小児がん研究基金(CCRF)とNIH R01 AI146009からB.S.Mに資金提供されました。

健康なドナーからの白血病サンプルは、地元の血液銀行から得られた。ここで説明したすべての実験は、機関審査委員会(IRB)によって研究のために免除されると判断され、ミネソタ大学の機関バイオセーフティ委員会(IBC)によって承認されました。
注:すべての実験は、無菌/無菌技術と適切なバイオセーフティレベル2機器で、血液媒介病原体のための普遍的な予防措置に?...

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	<li>LeBien, T. W., Thomas, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B+lymphocytes:+how+they+develop+and+function.">B lymphocytes: how they develop and function.</a> Blood. 112 (5), 1570-1580 (2008).</li><li>Nutt, S. L., Hodgkin, P. D., Tarlinton, D. M., Corcoran, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+generation+of+antibody-secreting+plasma+cells.">The generation of antibody-secreting plasma cells.</a> Nature Reviews Immunology. 15, 160-171 (2015).</li><li>Slifka, M. K., Antia, R., Whitmire, J. K., Ahmed, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Humoral+immunity+due+to+long-lived+plasma+cells.">Humoral immunity due to long-lived plasma cells.</a> Immunity. 8 (3), 363-372 (1998).</li><li>Spriggs, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+human+CD40+ligand+stimulates+B+cell+proliferation+and+immunoglobulin+E+secretion.">Recombinant human CD40 ligand stimulates B cell proliferation and immunoglobulin E secretion.</a> Journal of Experimental Medicines. 176 (6), 1543-1550 (1992).</li><li>Fusil, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+lentiviral+vector+allowing+physiologically+regulated+membrane-anchored+and+secreted+antibody+expression+depending+on+B-cell+maturation+status.">A lentiviral vector allowing physiologically regulated membrane-anchored and secreted antibody expression depending on B-cell maturation status.</a> Molecular Therapy. 23 (11), 1734-1747 (2015).</li><li>Luo, X. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+human+hematopoietic+stem/progenitor+cells+to+produce+a+broadly+neutralizing+anti-HIV+antibody+after+in+vitro+maturation+to+human+B+lymphocytes.">Engineering human hematopoietic stem/progenitor cells to produce a broadly neutralizing anti-HIV antibody after in vitro maturation to human B lymphocytes.</a> Blood. 113 (7), 1422-1431 (2008).</li><li>Mock, U., Thiele, R., Uhde, A., Fehse, B., Horn, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+lentiviral+transduction+and+transgene+expression+in+primary+human+B+cells.">Efficient lentiviral transduction and transgene expression in primary human B cells.</a> Human Gene Therapy Methods. 23 (6), 408-415 (2012).</li><li>Heltemes-Harris, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sleeping+Beauty+transposon+screen+identifies+signaling+modules+that+cooperate+with+STAT5+activation+to+induce+B-cell+acute+lymphoblastic+leukemia.">Sleeping Beauty transposon screen identifies signaling modules that cooperate with STAT5 activation to induce B-cell acute lymphoblastic leukemia.</a> Oncogene. 35 (26), 3454-3464 (2016).</li><li>Johnson, M. J., Laoharawee, K., Lahr, W. S., Webber, B. R., Moriarity, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+of+primary+human+B+cells+with+CRISPR/Cas9+targeted+nuclease.">Engineering of primary human B cells with CRISPR/Cas9 targeted nuclease.</a> Scientific Reports. 8, 12144 (2018).</li><li>Hung, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+protein-secreting+plasma+cells+by+homology-directed+repair+in+primary+human+B+cells.">Engineering protein-secreting plasma cells by homology-directed repair in primary human B cells.</a> Molecular Therapy. 26 (2), 456-467 (2018).</li><li>Cui, Y., Xu, J., Cheng, M., Liao, X., Peng, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+of+CRISPR/Cas9+sgRNA+design+tools.">Review of CRISPR/Cas9 sgRNA design tools.</a> Interdisciplinary Sciences. 10 (2), 455-465 (2018).</li><li>Rees, H. A., Liu, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Base+editing:+precision+chemistry+on+the+genome+and+transcriptome+of+living+cells.">Base editing: precision chemistry on the genome and transcriptome of living cells.</a> Nature Reviews Genetics. 19 (12), 770-788 (2018).</li><li>Spiegel, A., Bachmann, M., Jurado Jim&#233;nez, G., Sarov, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9-based+knockout+pipeline+for+reverse+genetics+in+mammalian+cell+culture.">CRISPR/Cas9-based knockout pipeline for reverse genetics in mammalian cell culture.</a> Methods. 164-165, 49-58 (2019).</li><li>Suzuki, T., Kazuki, Y., Oshimura, M., Hara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+system+for+simultaneous+or+sequential+integration+of+multiple+gene-loading+vectors+into+a+defined+site+of+a+human+artificial+chromosome.">A novel system for simultaneous or sequential integration of multiple gene-loading vectors into a defined site of a human artificial chromosome.</a> PLoS One. 9, 110404 (2014).</li><li>Bak, R. O., Porteus, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-mediated+integration+of+large+gene+cassettes+using+AAV+donor+vectors.">CRISPR-mediated integration of large gene cassettes using AAV donor vectors.</a> Cell Reports. 20 (3), 750-756 (2017).</li><li>Shirley, J. L., de Jong, Y. P., Terhorst, C., Herzog, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+responses+to+viral+gene+therapy+vectors.">Immune responses to viral gene therapy vectors.</a> Molecular Therapy. 28 (3), 709-722 (2020).</li><li>Martino, A. T., Markusic, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+response+mechanisms+against+AAV+vectors+in+animal+models.">Immune response mechanisms against AAV vectors in animal models.</a> Molecular Therapy - Methods and Clinical Development. 17, 198-208 (2020).</li></ol>

原発ヒトB細胞における精密ゲノム工学は最近9,10まで挑戦されてきた。我々は以前にCRISPR /Cas9を使用して主要なヒトB細胞9を設計するプロトコルを公開していた。ここでは、CD19の効率的なKOまたはノックインEGFPを可能にするB細胞の分離、拡張、およびエンジニアリングのための改良されたプロトコルの概要を説明します。</...

B細胞は造血幹細胞由来のリンパ球系統のサブグループである。彼らは免疫課題に応答して大量の抗体を産生することによって適応体性免疫系において重要な役割を果たす1.B細胞はまた、メモリB細胞および末期分化された、長命の形質細胞の前駆体であり、それによって持続性の液性免疫2を提供する。特に、形質細胞は、何年も何十年も生存しながら特定の抗体を大量に産生する能力において、免疫細胞の中でユニークである3。さらに、末梢血からの分離の容易さは、B細胞系統を新しい細胞ベース療法の優れた候補にする4.
これまで、レンチウイルスベクターや眠れる森の美女トランスポゾンを用いたようなランダムな統合方法は、トランスジーン送達および発現5、6、7、8のB細胞を設計するために使用されてきた。しかし、これらのアプローチの非特異的な性質は、B細胞における特定の遺伝子の生物学的機能を研究することを困難にし、治療環境における挿入突然変異誘発および可変トランスジーン発現および/またはサイレンシングの固有のリスクを伴う。
CRISPR/Cas9システムは、研究者が多くの種の様々な細胞のゲノムを正確に編集することを可能にする強力なゲノム工学ツールです。最近、我々を含む2つのグループは、初原ヒトB細胞9,10のex vivo拡張および標的ゲノム工学の方法の開発に成功している。白血病サンプルから初等ヒトB細胞を精製するプロセスについて説明する。その後、B細胞拡張および単離されたB細胞の活性化のための我々の更新されたプロトコルを説明する。次に、特異的B細胞受容体およびB細胞の特徴である分化19(CD19)のクラスターをノックアウトするプロセスを、活性化B細胞にCRISPR/Cas9 mRNAと共に導入するエレクトロポレーションによって説明する。
Cas9 mRNAは翻訳され、CD19 sgRNAに結合してCRISPR/Cas9-sgRNAリボヌクレオタンパク質複合体(RNP)を形成します。続いて、複合体中のsgRNAはCas9を導き、遺伝子のエキソン2上の標的配列で二本鎖破断(DSB)を作成する。細胞はヌクレオチドを導入または削除することによって「非相同端結合」によってDSBを修復し、フレームシフト突然変異を引き起こし、遺伝子をノックアウトさせる。次に、フローサイトメトリーによるCD19の損失を測定し、分解(TIDE)解析によるインデルの追跡によりインデル形成を解析します。
次に、CRISPR/Cas9を組換えAAV6ベクター(相同性特異的修復(HDR)のドナーテンプレート)と共に使用し、アデノ関連ウイルスインテグレーションサイト1(AAVS1)遺伝子で強化された緑色蛍光タンパク質(EGFP)の部位特異的挿入を仲介するプロセスについて説明する。AAVS1遺伝子は、既知の生物学的機能を持たない活性な遺伝子であり、ヒトゲノム上のAAVウイルス集積部位である。したがって、ゲノム工学の「安全な港」と考えられています。ここでは、B細胞の拡張と活性化により、培養7日間で最大44倍の拡張が可能であることを報告する(図1)。B細胞のエレクトロポレーションは、トランスフェクション後24時間で全体的な細胞健康(図2A)のわずかな減少を示した。CD19マーカーの散布図分析(図2B)は、編集されたセルの83%の減少を示した(図2C)。
クロマトグラフのTIDE分析(図3A)は、インデル%がフローサイトメトリーによる%タンパク質損失と類似していることを明らかにした(図3B)。KI実験のフローサイトメトリー分析は、AAVベクターを受けた細胞(図4)をRNPとともに、最大64%のEGFP陽性細胞(図5A)まで発現し、後に接合ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)による積分化に成功したことを示した(図5B)。細胞数は、すべてのサンプルがエンジニアリング後3日以内に迅速に回復したことを示した(図5C)。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alt-R S.p. Cas9 Nuclease V3 protein, 500 ug</td>
			<td>IDT</td>
			<td>1081059</td>
			<td>smaller size is also available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amaxa P3 primary cell 4D- Nucleofector X Kit S (32 RCT)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>V4XP-3032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium-chloride-potassium (ACK) lysing buffer</td>
			<td>Quality Biological</td>
			<td>118-156-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CleanCap chemically modified Cas9 mRNA</td>
			<td>Trilink Biotechnology</td>
			<td>L-7206-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CpG ODN 2006 (ODN 7909) 5 mg</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>TLRL-2006-5</td>
			<td>different sizes available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostor CS10, 100 mL</td>
			<td>STEMCELL Technology</td>
			<td>7930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTS Immune Cell SR</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A2596101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySep human B cells isolation kit</td>
			<td>STEMCELL Technology</td>
			<td>17954</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eBioscience fixable viability dye eFlour 780</td>
			<td>eBiosciences</td>
			<td>65-0865-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excellerate B cell media, Xeno-free</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>CCM031</td>
			<td>B-cell basal medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 14 mL Polypropylene Round-bottom Tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>S11550</td>
			<td>For thawing B cells only</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll-Paque Plus</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-1440-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneMate SnapStrip&#174; 8-Strip 0.2 mL PCR Tubes with Individual Attached Dome Caps</td>
			<td>BioExpress</td>
			<td>T-3035-1 / 490003-692</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyclone 0.0067M PBS (No Ca, No Mg) or 1x PBS</td>
			<td>GE lifesciences</td>
			<td>SH30256.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lonza 4D Nucleofector core unit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>AAF-1002B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lonza 4D Nucleofector X unit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>AAF-1002X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mega CD40 Ligand</td>
			<td>Enzo Life Sciences</td>
			<td>ALX-522-110-C010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mr. Frosty</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1562-1EA</td>
			<td>For freezing cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/Strep 100X</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>TMS-AB2-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP anti-human CD19 clone HIB19</td>
			<td>biolegend</td>
			<td>302228</td>
			<td>smaller size is also available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rAAV6 SA-GFP pakaging ( with our SA-GFP cassette see Figure 4.)</td>
			<td>Vigene Biosciences</td>
			<td>N/A</td>
			<td>large scale packaging, 1e13 GC/mL, 500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human IL-10 protein 250 ug</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>217-IL-250</td>
			<td>different sizes available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human IL-15 protein 25 ug</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>247-ILB-025</td>
			<td>different sizes available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The Big Easy EasySep Magnet</td>
			<td>STEMCELL Technology</td>
			<td>18001</td>
			<td>different sizes available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-EDTA (TE) buffer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2476100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

genome engineering of primary human b cells using crispr/cas9

B細胞は造血幹細胞由来のリンパ球であり、適応免疫系の体液性アームの重要な構成要素である。彼らは、末梢血からの隔離の容易さ、インビトロでの拡大能力、および生体内での長寿のために、細胞ベースの治療法の魅力的な候補を作ります。また、その通常の生物学的機能は、大量の抗体を産生する—感染と闘う組換え抗体や、エンジモパシーの治療のための酵素など、非常に大量の治療タンパク質を発現するために利用することができる。ここでは、末梢血単核細胞(PBMC)から初代ヒトB細胞を単離し、インビトロで単離されたB細胞を活性化/拡大するための詳細な方法を提供する。次に、B細胞内因性遺伝子の部位特異的KOにCRISPR/Cas9システムを用いたステップを実証する。この方法は、様々な遺伝子の効率的なKOを可能にし、目的の遺伝子の生物学的機能を研究するために使用することができる。次に、B細胞におけるトランスジーン発現カセットの効率的な部位特異的な統合のための組換え、アデノ関連ウイルス(rAAV)ベクターと共にCRISPR/Cas9システムを使用するためのステップを示す。このプロトコルは、遺伝子の生物学的機能を研究し、B細胞治療薬の開発のために、一次ヒトB細胞で使用できるステップバイステップのエンジニアリングプラットフォームを提供します。

更新された拡張および活性化プロトコルにより、7日間でB細胞の急速な拡張が最大44倍になりました(図1;n =3ドナー)。KO実験では、トリパンブルー染色を用いたB細胞数は、24時間のポストエレクトロポレーションでの対照およびCD19 KOサンプルの両方で細胞回収のわずかな減少を伴う80%以上の生存細胞を示した(図2A;p≥0.05、n=3ドナー)。この結果は、エ...

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Genome Engineering of Primary Human B Cells Using CRISPR/Cas9

ここでは、遺伝子ノックアウト(KO)およびノックイン(KI)のプライマリヒトB細胞のCRISPR/Cas9ベースのゲノム工学に関する詳細なステップバイステッププロトコルを提供し、B細胞における遺伝子の生物学的機能とB細胞治療薬の開発を研究します。

CRISPR/Cas9を用いた初等ヒトB細胞のゲノム工学

B cells are lymphocytes derived from hematopoietic stem cells and are a key component of the humoral arm of the adaptive immune system. They make ...

Research

JoVE Journal

Biology

Gross and Fine Dissection of Inner Ear Sensory Epithelia in Adult Zebrafish (Danio rerio)

Gross and Fine Dissection of Inner Ear Sensory Epithelia in Adult Zebrafish Danio rerio

アダルトゼブラフィッシュの内耳感覚上皮のグロスとファイン解剖（ゼブラフィッシュ）

Neurosensory epithelia in the inner ear are the crucial structures for hearing and balance functions. Therefore, it is important to understand the ...

Generation of Human CD40-activated B cells

ヒトCD40活性化B細胞の生成

CD40-activated B cells (CD40-B cells) have been identified as an alternative source of immuno-stimulatory antigen-presenting cells (APC) for cancer ...

Na&iuml;ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures

NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures

初代ヒト線維芽細胞培養からナイーブ成人幹細胞の分離

Over the last decade, several adult stem cell  populations have been identified in human skin 1-4.  The isolation of multipotent adult dermal precursors ...

Mouse Genome Engineering Using Designer Nucleases

デザイナーヌクレアーゼを用いてマウスゲノムエンジニアリング

Transgenic mice carrying site-specific genome modifications (knockout, knock-in) are of vital importance for dissecting complex biological systems as well ...

Generation of Genomic Deletions in Mammalian Cell Lines via CRISPR/Cas9

CRISPR / Cas9経由哺乳動物細胞株におけるゲノム欠失の生成

The prokaryotic clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated (Cas) 9 system may be re-purposed for site-specific ...

Whole Cell Electrophysiology of Primary Cultured Murine Enterochromaffin Cells

一次培養マウス腸クロム親和性細胞のセル全体を電気生理学

Enterochromaffin (EC) cells in the gastrointestinal (GI) epithelium constitute the largest subpopulation of enteroendocrine cells. As specialized sensory ...

In Situ Monitoring of Transiently Formed Molecular Chaperone Assemblies in Bacteria, Yeast, and Human Cells

細菌、酵母、ヒト細胞における一過性形成分子シャペロンアセンブリのモニタリング

J-domain proteins (JDPs) form the largest and the most diverse co-chaperone family in eukaryotic cells. Recent findings show that specific members of the ...

Silencing the Spark: CRISPR/Cas9 Genome Editing in Weakly Electric Fish

火花のサイレンシング:弱い電気魚のCRISPR/Cas9ゲノム編集

Electroreception and electrogenesis have changed in the evolutionary history of vertebrates. There is a striking degree of convergence in these ...

Preparing and Injecting Embryos of Culex Mosquitoes to Generate Null Mutations using CRISPR/Cas9

Preparing and Injecting Embryos of Culex Mosquitoes to Generate Null Mutations using CRISPR/Cas9

CRISPR/Cas9を使用してヌル突然変異を生成するための Culex 蚊の胚の調製と注入

Culex mosquitoes are the major vectors of several diseases that negatively impact human and animal health including West Nile virus and diseases caused by ...

Construction of Homozygous Mutants of Migratory Locust Using CRISPR/Cas9 Technology

The migratory locust, Locusta migratoria, is not only one of the worldwide plague locusts that caused huge economic losses to human beings but also an ...