Name: genome engineering of primary human b cells using crispr/cas9
Uploaded: 2020-11-03T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Genome Engineering of Primary Human B Cells Using CRISPR/Cas9 at JoVE.com

Эта работа финансировалась Детским онкологическим исследовательским фондом (CCRF) и NIH R01 AI146009 до B.S.M.

Образцы лейкафереза у здоровых доноров были получены в местном банке крови. Все эксперименты, описанные здесь, были определены как освобождаемые от исследований Институциональным советом по обзору (IRB) и были одобрены Институциональным комитетом по биобезопасности (МКБ) в Университет?...

<ol>
	<li>LeBien, T. W., Thomas, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B+lymphocytes:+how+they+develop+and+function.">B lymphocytes: how they develop and function.</a> Blood. 112 (5), 1570-1580 (2008).</li><li>Nutt, S. L., Hodgkin, P. D., Tarlinton, D. M., Corcoran, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+generation+of+antibody-secreting+plasma+cells.">The generation of antibody-secreting plasma cells.</a> Nature Reviews Immunology. 15, 160-171 (2015).</li><li>Slifka, M. K., Antia, R., Whitmire, J. K., Ahmed, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Humoral+immunity+due+to+long-lived+plasma+cells.">Humoral immunity due to long-lived plasma cells.</a> Immunity. 8 (3), 363-372 (1998).</li><li>Spriggs, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+human+CD40+ligand+stimulates+B+cell+proliferation+and+immunoglobulin+E+secretion.">Recombinant human CD40 ligand stimulates B cell proliferation and immunoglobulin E secretion.</a> Journal of Experimental Medicines. 176 (6), 1543-1550 (1992).</li><li>Fusil, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+lentiviral+vector+allowing+physiologically+regulated+membrane-anchored+and+secreted+antibody+expression+depending+on+B-cell+maturation+status.">A lentiviral vector allowing physiologically regulated membrane-anchored and secreted antibody expression depending on B-cell maturation status.</a> Molecular Therapy. 23 (11), 1734-1747 (2015).</li><li>Luo, X. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+human+hematopoietic+stem/progenitor+cells+to+produce+a+broadly+neutralizing+anti-HIV+antibody+after+in+vitro+maturation+to+human+B+lymphocytes.">Engineering human hematopoietic stem/progenitor cells to produce a broadly neutralizing anti-HIV antibody after in vitro maturation to human B lymphocytes.</a> Blood. 113 (7), 1422-1431 (2008).</li><li>Mock, U., Thiele, R., Uhde, A., Fehse, B., Horn, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+lentiviral+transduction+and+transgene+expression+in+primary+human+B+cells.">Efficient lentiviral transduction and transgene expression in primary human B cells.</a> Human Gene Therapy Methods. 23 (6), 408-415 (2012).</li><li>Heltemes-Harris, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sleeping+Beauty+transposon+screen+identifies+signaling+modules+that+cooperate+with+STAT5+activation+to+induce+B-cell+acute+lymphoblastic+leukemia.">Sleeping Beauty transposon screen identifies signaling modules that cooperate with STAT5 activation to induce B-cell acute lymphoblastic leukemia.</a> Oncogene. 35 (26), 3454-3464 (2016).</li><li>Johnson, M. J., Laoharawee, K., Lahr, W. S., Webber, B. R., Moriarity, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+of+primary+human+B+cells+with+CRISPR/Cas9+targeted+nuclease.">Engineering of primary human B cells with CRISPR/Cas9 targeted nuclease.</a> Scientific Reports. 8, 12144 (2018).</li><li>Hung, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+protein-secreting+plasma+cells+by+homology-directed+repair+in+primary+human+B+cells.">Engineering protein-secreting plasma cells by homology-directed repair in primary human B cells.</a> Molecular Therapy. 26 (2), 456-467 (2018).</li><li>Cui, Y., Xu, J., Cheng, M., Liao, X., Peng, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+of+CRISPR/Cas9+sgRNA+design+tools.">Review of CRISPR/Cas9 sgRNA design tools.</a> Interdisciplinary Sciences. 10 (2), 455-465 (2018).</li><li>Rees, H. A., Liu, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Base+editing:+precision+chemistry+on+the+genome+and+transcriptome+of+living+cells.">Base editing: precision chemistry on the genome and transcriptome of living cells.</a> Nature Reviews Genetics. 19 (12), 770-788 (2018).</li><li>Spiegel, A., Bachmann, M., Jurado Jim&#233;nez, G., Sarov, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9-based+knockout+pipeline+for+reverse+genetics+in+mammalian+cell+culture.">CRISPR/Cas9-based knockout pipeline for reverse genetics in mammalian cell culture.</a> Methods. 164-165, 49-58 (2019).</li><li>Suzuki, T., Kazuki, Y., Oshimura, M., Hara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+system+for+simultaneous+or+sequential+integration+of+multiple+gene-loading+vectors+into+a+defined+site+of+a+human+artificial+chromosome.">A novel system for simultaneous or sequential integration of multiple gene-loading vectors into a defined site of a human artificial chromosome.</a> PLoS One. 9, 110404 (2014).</li><li>Bak, R. O., Porteus, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-mediated+integration+of+large+gene+cassettes+using+AAV+donor+vectors.">CRISPR-mediated integration of large gene cassettes using AAV donor vectors.</a> Cell Reports. 20 (3), 750-756 (2017).</li><li>Shirley, J. L., de Jong, Y. P., Terhorst, C., Herzog, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+responses+to+viral+gene+therapy+vectors.">Immune responses to viral gene therapy vectors.</a> Molecular Therapy. 28 (3), 709-722 (2020).</li><li>Martino, A. T., Markusic, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+response+mechanisms+against+AAV+vectors+in+animal+models.">Immune response mechanisms against AAV vectors in animal models.</a> Molecular Therapy - Methods and Clinical Development. 17, 198-208 (2020).</li></ol>

Точная инженерия генома в первичных клетках человека B была сложной задачей донедавнего времени 9,10. Ранее мы публиковали протоколы с использованием CRISPR/Cas9 для инженера первичных клеток B человека9. Здесь мы наметим улучшенные протоколы для и...

В-клетки являются подгруппой линии лимфоцитов, полученных из гематопоэтических стволовых клеток. Они выполняют важную роль в адаптивной гуморальной иммунной системе, производя большое количество антител в ответ на иммунные проблемы1. В-клетки также являются предшественниками клеток памяти В и неизлечимо дифференцированных, долгоиговых плазменных клеток, обеспечивая тем самым прочный гуморальныйиммунитет 2. Плазменные клетки, в частности, уникальны среди иммунных клеток в их способности производить большое количество конкретных антител, выживая в течение многих лет илидесятилетий 3. Кроме того, легкость изоляции от периферической крови делает линию B-клеток отличным кандидатом для новых клеточных методовлечения 4.
Ранее методы случайной интеграции, такие как использование лентивирусных векторов или транспосона Спящей Красавицы, использовались для разработки В-клеток для доставкии выражения трансгенов 5,6,7,8. Однако неспецифический характер этих подходов затрудняет изучение биологических функций конкретного гена в клетках группы В и несет в себе риск вставки мутагенеза и переменной трансгенной экспрессии и/или замалчивания в терапевтической обстановке.
Система CRISPR/Cas9 является мощным инструментом инженерии генома, который позволяет исследователям точно редактировать геном различных клеток различных видов. В последнее время две группы, в том числе наши собственные, успешно разработали методы расширения ex vivo и целенаправленной инженерии генома первичныхклеток человека B 9,10. Мы опишем процесс очистки первичных клеток человека B из образца лейкофореза. После этого мы опишем наш обновленный протокол расширения B-клеток и активации изолированных В-клеток. Затем мы опишем процесс выбивания кластера дифференциации 19 (CD19), специфического В-клеточного рецептора и отличительной чертой В-клеток, путем электропорации для введения CRISPR/Cas9 mRNA вместе с CD19 sgRNA в активированные B-клетки.
Cas9 мРНК переводится и связывается с CD19 sgRNA, чтобы сформировать CRISPR/Cas9-sgRNA рибонуклеопротеин комплекс (RNP). Впоследствии, sgRNA в комплексе приводит Cas9 к созданию двухцепочего разрыва (DSB) в целевой последовательности на exon 2 гена. Клетки будут ремонтировать DSB путем "не-гомологичный конец присоединения" путем введения или удаления нуклеотидов, что приводит к мутации кадров и вызывая ген будет выбит. Затем мы измерим потерю CD19 по цитометрии потока и проанализируем образование индрета путем отслеживания иделей путем анализа разложения (TIDE).
Затем мы опишем процесс использования CRISPR/Cas9 вместе с рекомбинантным вектором AAV6 (rAAV6, донорским шаблоном для гомологического ремонта (HDR)) для опоставки вставки расширенного зеленого флуоресцентного белка(EGFP) на адено-ассоциированном вирусе интеграционного сайта 1 (AAVS1). Ген AAVS1 является активным локусом без известных биологических функций и местом вирусной интеграции AAV в геноме человека; поэтому он считается «безопасной гаванью» для геномной инженерии. Здесь мы сообщаем, что расширение и активация В-клеток позволили до 44-кратного расширения в 7 дней культуры(рисунок 1). Электропорация В-клеток показала небольшое снижение общего здоровья клеток(рисунок 2A) при 24 ч после трансфекции. Рассеянный анализ участка маркера CD19(рисунок 2B) показал до 83% сокращения отредактированных ячеек(рисунок 2C).
Анализ TIDE хроматографов (рисунок3A) показал, что % indels был похож на % потери белка по цитометрии потока(рисунок 3B). Цитометрия потока анализа эксперимента KI показала, что клетки, получившие вектор AAV(рисунок 4),вместе с RNP, выразили до 64% EGFP-положительных клеток(рисунок 5A),а затем показали успешную интеграцию путем соединения полимеразной цепной реакции (PCR) (Рисунок 5B). Количество ячеек показало, что все образцы быстро восстанавливаются в течение 3 дней после инженерии(рисунок 5C).

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alt-R S.p. Cas9 Nuclease V3 protein, 500 ug</td>
			<td>IDT</td>
			<td>1081059</td>
			<td>smaller size is also available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amaxa P3 primary cell 4D- Nucleofector X Kit S (32 RCT)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>V4XP-3032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium-chloride-potassium (ACK) lysing buffer</td>
			<td>Quality Biological</td>
			<td>118-156-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CleanCap chemically modified Cas9 mRNA</td>
			<td>Trilink Biotechnology</td>
			<td>L-7206-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CpG ODN 2006 (ODN 7909) 5 mg</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>TLRL-2006-5</td>
			<td>different sizes available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostor CS10, 100 mL</td>
			<td>STEMCELL Technology</td>
			<td>7930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTS Immune Cell SR</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A2596101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySep human B cells isolation kit</td>
			<td>STEMCELL Technology</td>
			<td>17954</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eBioscience fixable viability dye eFlour 780</td>
			<td>eBiosciences</td>
			<td>65-0865-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excellerate B cell media, Xeno-free</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>CCM031</td>
			<td>B-cell basal medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 14 mL Polypropylene Round-bottom Tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>S11550</td>
			<td>For thawing B cells only</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll-Paque Plus</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-1440-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneMate SnapStrip&#174; 8-Strip 0.2 mL PCR Tubes with Individual Attached Dome Caps</td>
			<td>BioExpress</td>
			<td>T-3035-1 / 490003-692</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyclone 0.0067M PBS (No Ca, No Mg) or 1x PBS</td>
			<td>GE lifesciences</td>
			<td>SH30256.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lonza 4D Nucleofector core unit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>AAF-1002B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lonza 4D Nucleofector X unit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>AAF-1002X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mega CD40 Ligand</td>
			<td>Enzo Life Sciences</td>
			<td>ALX-522-110-C010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mr. Frosty</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1562-1EA</td>
			<td>For freezing cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/Strep 100X</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>TMS-AB2-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP anti-human CD19 clone HIB19</td>
			<td>biolegend</td>
			<td>302228</td>
			<td>smaller size is also available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rAAV6 SA-GFP pakaging ( with our SA-GFP cassette see Figure 4.)</td>
			<td>Vigene Biosciences</td>
			<td>N/A</td>
			<td>large scale packaging, 1e13 GC/mL, 500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human IL-10 protein 250 ug</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>217-IL-250</td>
			<td>different sizes available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human IL-15 protein 25 ug</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>247-ILB-025</td>
			<td>different sizes available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The Big Easy EasySep Magnet</td>
			<td>STEMCELL Technology</td>
			<td>18001</td>
			<td>different sizes available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-EDTA (TE) buffer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2476100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

genome engineering of primary human b cells using crispr/cas9

В-клетки являются лимфоцитами, полученными из гематопоэтических стволовых клеток и являются ключевым компонентом гуморальной руки адаптивной иммунной системы. Они делают привлекательных кандидатов для клеточной терапии из-за их легкости изоляции от периферической крови, их способность расширяться в пробирке, и их долговечность in vivo. Кроме того, их нормальная биологическая функция – производить большое количество антител – может быть использована для выражения очень большого количества терапевтического белка, такого как рекомбинантное антитело для борьбы с инфекцией, или фермент для лечения энзимопатий. Здесь мы предоставляем подробные методы для изоляции первичных клеток человека B от периферических моноядерных клеток крови (PBMCs) и активации / расширения изолированных В-клеток in vitro. Затем мы демонстрируем шаги, связанные с использованием системы CRISPR/Cas9 для конкретного участка KO эндогенных генов в клетках группы В. Этот метод позволяет эффективно кОК различных генов, которые могут быть использованы для изучения биологических функций генов, представляющих интерес. Затем мы демонстрируем шаги по использованию системы CRISPR/Cas9 вместе с рекомбинантным, адено-ассоциированным, вирусным (rAAV) вектором для эффективной интеграции трансгенной экспресс-кассеты в B-клетках. Вместе этот протокол обеспечивает пошаговую инженерную платформу, которая может быть использована в первичных клетках В человека для изучения биологических функций генов, а также для развития В-клеточной терапии.

Обновленный протокол расширения и активации позволил быстро расширить В-клетки до 44 раз за 7 дней(рисунок 1; n No 3 доноров). В эксперименте KO, B-клеток кол с использованием Trypan синий окрашивания показали более 80% жизнеспособных клеток с небольшим снижением восстановления кл...

Watch this Scientific Journal Video about Genome Engineering of Primary Human B Cells Using CRISPR/Cas9 at JoVE.com

Genome Engineering of Primary Human B Cells Using CRISPR/Cas9

Здесь мы предоставляем подробный, шаг за шагом протокол для CRISPR / Cas9 основе генома инженерных первичных клеток человека B для гена нокаут (KO) и стук-в (KI) для изучения биологических функций генов в клетках В и развитие В-клеточной терапии.

Геномная инженерия первичных клеток человека B с использованием CRISPR/Cas9

B cells are lymphocytes derived from hematopoietic stem cells and are a key component of the humoral arm of the adaptive immune system. They make ...

Research

JoVE Journal

Biology

Gross and Fine Dissection of Inner Ear Sensory Epithelia in Adult Zebrafish (Danio rerio)

Gross and Fine Dissection of Inner Ear Sensory Epithelia in Adult Zebrafish Danio rerio

Гросс и изобразительных Препарирование Внутреннее ухо Сенсорные эпителия у взрослых данио рерио ( Danio rerio)

Neurosensory epithelia in the inner ear are the crucial structures for hearing and balance functions. Therefore, it is important to understand the ...

Generation of Human CD40-activated B cells

Поколение прав CD40 активированных В-клеток

CD40-activated B cells (CD40-B cells) have been identified as an alternative source of immuno-stimulatory antigen-presenting cells (APC) for cancer ...

Na&iuml;ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures

NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures

Наивные стволовых клеток взрослых Изоляция от первичных человеческих культурах фибробластов

Over the last decade, several adult stem cell  populations have been identified in human skin 1-4.  The isolation of multipotent adult dermal precursors ...

Mouse Genome Engineering Using Designer Nucleases

Мышь Геном Инжиниринг Использование конструктора нуклеаз

Transgenic mice carrying site-specific genome modifications (knockout, knock-in) are of vital importance for dissecting complex biological systems as well ...

Generation of Genomic Deletions in Mammalian Cell Lines via CRISPR/Cas9

Генерация геномных делеций в линии клеток млекопитающих, через CRISPR / Cas9

The prokaryotic clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated (Cas) 9 system may be re-purposed for site-specific ...

Whole Cell Electrophysiology of Primary Cultured Murine Enterochromaffin Cells

Вся ячейка электрофизиологии первичного культивировали мышиных Enterochromaffin клеток

Enterochromaffin (EC) cells in the gastrointestinal (GI) epithelium constitute the largest subpopulation of enteroendocrine cells. As specialized sensory ...

In Situ Monitoring of Transiently Formed Molecular Chaperone Assemblies in Bacteria, Yeast, and Human Cells

В Ситу Мониторинг переходно сформированных молекулярных сборок чаперона в бактериях, дрожжах и клетках человека

J-domain proteins (JDPs) form the largest and the most diverse co-chaperone family in eukaryotic cells. Recent findings show that specific members of the ...

Silencing the Spark: CRISPR/Cas9 Genome Editing in Weakly Electric Fish

Молчание Spark: CRISPR/Cas9 Редактирование генома в слабо электрической рыбы

Electroreception and electrogenesis have changed in the evolutionary history of vertebrates. There is a striking degree of convergence in these ...

Preparing and Injecting Embryos of Culex Mosquitoes to Generate Null Mutations using CRISPR/Cas9

Preparing and Injecting Embryos of Culex Mosquitoes to Generate Null Mutations using CRISPR/Cas9

Подготовка и инъекция эмбрионов комаров Culex для генерации нулевых мутаций с использованием CRISPR/Cas9

Culex mosquitoes are the major vectors of several diseases that negatively impact human and animal health including West Nile virus and diseases caused by ...

Construction of Homozygous Mutants of Migratory Locust Using CRISPR/Cas9 Technology

The migratory locust, Locusta migratoria, is not only one of the worldwide plague locusts that caused huge economic losses to human beings but also an ...