Name: genome engineering of primary human b cells using crispr/cas9
Uploaded: 2020-11-03T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Genome Engineering of Primary Human B Cells Using CRISPR/Cas9 at JoVE.com

Bu çalışma Çocuk Kanser araştırma fonu (CCRF) ve NIH R01 AI146009 tarafından B.S.M'a finanse edildi.

Sağlıklı donörlerden lökerez örnekleri yerel bir kan bankasından alındı. Burada açıklanan tüm deneyler Kurumsal İnceleme Kurulu (IRB) tarafından araştırmadan muaf olarak belirlenmiş ve Minnesota Üniversitesi Kurumsal Biyogüvenlik Komitesi (IBC) tarafından onaylanmıştır.
NOT: Tüm deneyler kan kaynaklı patojenler için evrensel önlem doğrultusunda, steril/aseptik teknikler ve uygun biyogüvenlik seviye-2 ekipmanları ile gerçek gerçekleştirildi.
<p class="jove_t...

<ol>
	<li>LeBien, T. W., Thomas, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B+lymphocytes:+how+they+develop+and+function.">B lymphocytes: how they develop and function.</a> Blood. 112 (5), 1570-1580 (2008).</li><li>Nutt, S. L., Hodgkin, P. D., Tarlinton, D. M., Corcoran, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+generation+of+antibody-secreting+plasma+cells.">The generation of antibody-secreting plasma cells.</a> Nature Reviews Immunology. 15, 160-171 (2015).</li><li>Slifka, M. K., Antia, R., Whitmire, J. K., Ahmed, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Humoral+immunity+due+to+long-lived+plasma+cells.">Humoral immunity due to long-lived plasma cells.</a> Immunity. 8 (3), 363-372 (1998).</li><li>Spriggs, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+human+CD40+ligand+stimulates+B+cell+proliferation+and+immunoglobulin+E+secretion.">Recombinant human CD40 ligand stimulates B cell proliferation and immunoglobulin E secretion.</a> Journal of Experimental Medicines. 176 (6), 1543-1550 (1992).</li><li>Fusil, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+lentiviral+vector+allowing+physiologically+regulated+membrane-anchored+and+secreted+antibody+expression+depending+on+B-cell+maturation+status.">A lentiviral vector allowing physiologically regulated membrane-anchored and secreted antibody expression depending on B-cell maturation status.</a> Molecular Therapy. 23 (11), 1734-1747 (2015).</li><li>Luo, X. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+human+hematopoietic+stem/progenitor+cells+to+produce+a+broadly+neutralizing+anti-HIV+antibody+after+in+vitro+maturation+to+human+B+lymphocytes.">Engineering human hematopoietic stem/progenitor cells to produce a broadly neutralizing anti-HIV antibody after in vitro maturation to human B lymphocytes.</a> Blood. 113 (7), 1422-1431 (2008).</li><li>Mock, U., Thiele, R., Uhde, A., Fehse, B., Horn, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+lentiviral+transduction+and+transgene+expression+in+primary+human+B+cells.">Efficient lentiviral transduction and transgene expression in primary human B cells.</a> Human Gene Therapy Methods. 23 (6), 408-415 (2012).</li><li>Heltemes-Harris, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sleeping+Beauty+transposon+screen+identifies+signaling+modules+that+cooperate+with+STAT5+activation+to+induce+B-cell+acute+lymphoblastic+leukemia.">Sleeping Beauty transposon screen identifies signaling modules that cooperate with STAT5 activation to induce B-cell acute lymphoblastic leukemia.</a> Oncogene. 35 (26), 3454-3464 (2016).</li><li>Johnson, M. J., Laoharawee, K., Lahr, W. S., Webber, B. R., Moriarity, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+of+primary+human+B+cells+with+CRISPR/Cas9+targeted+nuclease.">Engineering of primary human B cells with CRISPR/Cas9 targeted nuclease.</a> Scientific Reports. 8, 12144 (2018).</li><li>Hung, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+protein-secreting+plasma+cells+by+homology-directed+repair+in+primary+human+B+cells.">Engineering protein-secreting plasma cells by homology-directed repair in primary human B cells.</a> Molecular Therapy. 26 (2), 456-467 (2018).</li><li>Cui, Y., Xu, J., Cheng, M., Liao, X., Peng, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+of+CRISPR/Cas9+sgRNA+design+tools.">Review of CRISPR/Cas9 sgRNA design tools.</a> Interdisciplinary Sciences. 10 (2), 455-465 (2018).</li><li>Rees, H. A., Liu, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Base+editing:+precision+chemistry+on+the+genome+and+transcriptome+of+living+cells.">Base editing: precision chemistry on the genome and transcriptome of living cells.</a> Nature Reviews Genetics. 19 (12), 770-788 (2018).</li><li>Spiegel, A., Bachmann, M., Jurado Jim&#233;nez, G., Sarov, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9-based+knockout+pipeline+for+reverse+genetics+in+mammalian+cell+culture.">CRISPR/Cas9-based knockout pipeline for reverse genetics in mammalian cell culture.</a> Methods. 164-165, 49-58 (2019).</li><li>Suzuki, T., Kazuki, Y., Oshimura, M., Hara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+system+for+simultaneous+or+sequential+integration+of+multiple+gene-loading+vectors+into+a+defined+site+of+a+human+artificial+chromosome.">A novel system for simultaneous or sequential integration of multiple gene-loading vectors into a defined site of a human artificial chromosome.</a> PLoS One. 9, 110404 (2014).</li><li>Bak, R. O., Porteus, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-mediated+integration+of+large+gene+cassettes+using+AAV+donor+vectors.">CRISPR-mediated integration of large gene cassettes using AAV donor vectors.</a> Cell Reports. 20 (3), 750-756 (2017).</li><li>Shirley, J. L., de Jong, Y. P., Terhorst, C., Herzog, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+responses+to+viral+gene+therapy+vectors.">Immune responses to viral gene therapy vectors.</a> Molecular Therapy. 28 (3), 709-722 (2020).</li><li>Martino, A. T., Markusic, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+response+mechanisms+against+AAV+vectors+in+animal+models.">Immune response mechanisms against AAV vectors in animal models.</a> Molecular Therapy - Methods and Clinical Development. 17, 198-208 (2020).</li></ol>

Birincil insan B hücrelerinde hassas genom mühendisliği yakın zamana kadar zorlu olmuştur9,10. Daha önce crispr/cas9 kullanarak birincil insan B hücrelerini tasarlamak için protokoller yayınlamıştık9. Burada, CD19'un verimli KO'suna izin vermek veya EGFP'yivurmak için B hücre yalıtımı, genişletme ve mühendislik için geliştirilmiş protokolleri özetliyoruz.
Burada genişleme protoko...

B hücreleri hematopoetik kök hücrelerden elde edilen lenfosit soyunun bir alt grubudur. Bağışıklık sorunlarına yanıt olarak büyük miktarlarda antikor üreterek adaptif humoral bağışıklık sisteminde kritik bir rol oynarlar1. B hücreleri aynı zamanda bellek B hücrelerinin ve ölümcül olarak farklılaştırılmış, uzun ömürlü plazma hücrelerinin öncüleridir, böylece kalıcı humoral bağışıklıksağlar 2. Plazma hücreleri, özellikle, yıllarca veya onlarca yıl hayatta kalırken belirli bir antikorun büyük miktarlarda üretme yeteneklerinde bağışıklık hücreleri arasında benzersizdir3. Ek olarak, periferik kandan izolasyon kolaylığı, B hücre soyunun yeni hücre bazlı tedaviler için mükemmel bir aday olduğunu yapar4.
Daha önce, lentiviral vektörler veya Uyuyan Güzel transposon kullananlar gibi rastgele entegrasyon yöntemleri, transgene doğum ve ifade 5 , 6,7,8için B hücrelerini tasarlamak için kullanılmıştır. Bununla birlikte, bu yaklaşımların spesifik olmayan doğası, B hücrelerindeki belirli bir genin biyolojik fonksiyonlarının incelenmesini zorlaştırır ve terapötik ortamda eklemeli mutajensis ve değişken transgene ekspresyonu ve / veya susturma riski taşır.
CRISPR/Cas9 sistemi, araştırmacıların çok sayıda türdeki çeşitli hücrelerin genomunu hassas bir şekilde düzenlemelerini sağlayan güçlü bir genom mühendisliği aracıdır. Son zamanlarda, bizimki de dahil olmak üzere iki grup, ex vivo genişleme için yöntemler geliştirdi ve birincil insan B hücrelerinin genom mühendisliğini hedefledi9,10. Birincil insan B hücrelerini lökorezis örneğinden arındırma sürecini açıklayacağız. Bundan sonra, B hücresi genişletme ve izole B hücrelerinin aktivasyonu için güncellenmiş protokolümüzü açıklayacağız. Daha sonra CRISPR/Cas9 mRNA'yı CD19 sgRNA ile birlikte aktif B hücrelerine tanıtmak için elektroporasyon yoluyla belirli bir B hücre reseptörü ve B hücrelerinin ayırt edici bir özelliği olan 19 (CD19) farklılaşma kümesini devirmek için bir süreç açıklayacağız.
CAS9 mRNA çevrilir ve CRISPR/Cas9-sgRNA ribonucleoprotein kompleksi (RNP) oluşturmak için CD19 sgRNA'ya bağlanır. Daha sonra, kompleksteki sgRNA, Cas9'un genin ekson 2'sinde hedef sırada çift iplikçik kırılması (DSB) oluşturmasına neden olur. Hücreler, nükleotidleri tanıtarak veya silerek, frameshift mutasyona yol açarak ve genin bayıltılmasına neden olarak DSB'yi "homolog olmayan uç birleştirme" ile onaracak. Daha sonra akış sitometrisi ile CD19 kaybını ölçecek ve ayrışma (TIDE) analizi ile indellerin takibi ile indel oluşumunu analiz edeceğiz.
Daha sonra CRISPR/Cas9'u, adeno ile ilişkili virüs entegrasyon sitesi 1 (AAVS1) genine gelişmiş yeşil floresan proteinin(EGFP) raya özgü yerleştirilmesine aracılık etmek için rekombinant bir AAV6 vektörü (rAAV6, homolojiye yönelik onarım (HDR) için bir donör şablonu) ile birlikte kullanma sürecini açıklayacağız. AAVS1 geni, bilinen biyolojik işlevleri olmayan aktif bir lokus ve insan genomunda bir AAV viral entegrasyon bölgesidir; bu nedenle, genom mühendisliği için "güvenli bir liman" olarak kabul edilir. Burada, B hücrelerinin genişlemesi ve aktivasyonunun 7 günlük kültürde 44 kata kadar genişlemeye izin verdiğini bildiriyoruz (Şekil 1). B hücrelerinin elektroporasyonunun transeksiyon sonrası 24 saat genel hücre sağlığında(Şekil 2A)hafif bir azalma gösterdiği görüldü. CD19 işaretleyicisinin dağılım grafiği analizi (Şekil 2B) düzenlenen hücrelerde% 83'e kadar azalma gösterdi (Şekil 2C).
Kromatografların GELGIT analizi (Şekil 3A) % indellerin akış sitometrisi ile % protein kaybına benzer olduğunu ortaya koydu (Şekil 3B). KI deneyinin akış sitometrisi analizi, RNP ile birlikte AAV vektörü alan hücrelerin (Şekil 4), % 64'e kadar EGFP pozitif hücreleri (Şekil 5A) ifade ettiğini ve daha sonra kavşak polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ile başarılı entegrasyon gösterdiğini göstermiştir (Şekil 5B). Hücre sayımları, tüm örneklerin mühendislik sonrası 3 gün içinde hızla kurtarıldığunu göstermiştir (Şekil 5C).

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alt-R S.p. Cas9 Nuclease V3 protein, 500 ug</td>
			<td>IDT</td>
			<td>1081059</td>
			<td>smaller size is also available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amaxa P3 primary cell 4D- Nucleofector X Kit S (32 RCT)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>V4XP-3032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium-chloride-potassium (ACK) lysing buffer</td>
			<td>Quality Biological</td>
			<td>118-156-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CleanCap chemically modified Cas9 mRNA</td>
			<td>Trilink Biotechnology</td>
			<td>L-7206-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CpG ODN 2006 (ODN 7909) 5 mg</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>TLRL-2006-5</td>
			<td>different sizes available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostor CS10, 100 mL</td>
			<td>STEMCELL Technology</td>
			<td>7930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTS Immune Cell SR</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A2596101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySep human B cells isolation kit</td>
			<td>STEMCELL Technology</td>
			<td>17954</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eBioscience fixable viability dye eFlour 780</td>
			<td>eBiosciences</td>
			<td>65-0865-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excellerate B cell media, Xeno-free</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>CCM031</td>
			<td>B-cell basal medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 14 mL Polypropylene Round-bottom Tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>S11550</td>
			<td>For thawing B cells only</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll-Paque Plus</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-1440-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneMate SnapStrip&#174; 8-Strip 0.2 mL PCR Tubes with Individual Attached Dome Caps</td>
			<td>BioExpress</td>
			<td>T-3035-1 / 490003-692</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyclone 0.0067M PBS (No Ca, No Mg) or 1x PBS</td>
			<td>GE lifesciences</td>
			<td>SH30256.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lonza 4D Nucleofector core unit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>AAF-1002B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lonza 4D Nucleofector X unit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>AAF-1002X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mega CD40 Ligand</td>
			<td>Enzo Life Sciences</td>
			<td>ALX-522-110-C010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mr. Frosty</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1562-1EA</td>
			<td>For freezing cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/Strep 100X</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>TMS-AB2-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP anti-human CD19 clone HIB19</td>
			<td>biolegend</td>
			<td>302228</td>
			<td>smaller size is also available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rAAV6 SA-GFP pakaging ( with our SA-GFP cassette see Figure 4.)</td>
			<td>Vigene Biosciences</td>
			<td>N/A</td>
			<td>large scale packaging, 1e13 GC/mL, 500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human IL-10 protein 250 ug</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>217-IL-250</td>
			<td>different sizes available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human IL-15 protein 25 ug</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>247-ILB-025</td>
			<td>different sizes available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The Big Easy EasySep Magnet</td>
			<td>STEMCELL Technology</td>
			<td>18001</td>
			<td>different sizes available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-EDTA (TE) buffer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2476100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

genome engineering of primary human b cells using crispr/cas9

B hücreleri hematopoetik kök hücrelerden elde edilen lenfositlerdir ve adaptif bağışıklık sisteminin humoral kolunun önemli bir bileşenidir. Periferik kandan izolasyon kolaylığı, in vitroyu genişletme yetenekleri ve in vivo olarak uzun ömürlü olmaları nedeniyle hücre bazlı tedaviler için çekici adaylar yaparlar. Ek olarak, normal biyolojik işlevleri -büyük miktarlarda antikor üretmek için- enfeksiyonla savaşmak için rekombinant antikor veya enzimopatiklerin tedavisi için bir enzim gibi çok büyük miktarlarda terapötik proteini ifade etmek için kullanılabilir. Burada, primer insan B hücrelerini periferik kan mononükleer hücrelerinden (PBMC) izole etmek ve izole edilmiş B hücrelerini in vitro olarak etkinleştirmek / genişletmek için ayrıntılı yöntemler sunuyoruz. Daha sonra B hücrelerindeki endojen genlerin bölgeye özgü KO'su için CRISPR/Cas9 sisteminin kullanılmasıyla ilgili adımları gösteriyoruz. Bu yöntem, ilgi çekici genlerin biyolojik işlevlerini incelemek için kullanılabilecek çeşitli genlerin verimli KO'suna izin verir. Daha sonra CRISPR/Cas9 sistemini kullanma adımlarını, B hücrelerindeki transgene ifade kasetinin raya özgü verimli entegrasyonu için rekombinant, adeno ilişkili, viral (rAAV) vektör ile birlikte gösteriyoruz. Birlikte, bu protokol, birincil insan B hücrelerinde genlerin biyolojik işlevlerini incelemek ve B hücre terapötiklerinin geliştirilmesi için kullanılabilecek adım adım bir mühendislik platformu sağlar.

Güncellenmiş genişletme ve aktivasyon protokolü, B hücrelerinin 7 günde 44 kata kadar hızlı genişlemesini sağladı(Şekil 1; n =3 donörler). KO deneyinde, Trypan mavi boyama kullanan B hücre sayısı, hem kontrolde hem de CD19 KO örneklerinde 24 saat post-elektroporasyonda hücre iyileşmesinde hafif bir azalma ile% 80'den fazla uygulanabilir hücre gösterdi(Şekil 2A; p ≥ 0.05, n = 3 donör). Bu sonuç, elektroporasyonun genel B hücre sağlığ...

Watch this Scientific Journal Video about Genome Engineering of Primary Human B Cells Using CRISPR/Cas9 at JoVE.com

Genome Engineering of Primary Human B Cells Using CRISPR/Cas9

Burada, B hücrelerindeki genlerin biyolojik fonksiyonlarını ve B hücre terapötiklerinin gelişimini incelemek için gen nakavt (KO) ve knock-in (KI) için birincil insan B hücrelerinin CRISPR/ Cas9 tabanlı genom mühendisliği için ayrıntılı, adım adım bir protokol sunuyoruz.

CRISPR/Cas9 Kullanarak Birincil İnsan B Hücrelerinin Genom Mühendisliği

B cells are lymphocytes derived from hematopoietic stem cells and are a key component of the humoral arm of the adaptive immune system. They make ...

Research

JoVE Journal

Biology

Gross and Fine Dissection of Inner Ear Sensory Epithelia in Adult Zebrafish (Danio rerio)

Gross and Fine Dissection of Inner Ear Sensory Epithelia in Adult Zebrafish Danio rerio

Yetişkin Zebra balığı İç Kulak Duyu Epiteli Brüt ve Güzel Diseksiyon ( Danio rerio)

Neurosensory epithelia in the inner ear are the crucial structures for hearing and balance functions. Therefore, it is important to understand the ...

Generation of Human CD40-activated B cells

İnsan CD40 aktive B hücreleri üretilmesi

CD40-activated B cells (CD40-B cells) have been identified as an alternative source of immuno-stimulatory antigen-presenting cells (APC) for cancer ...

Na&iuml;ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures

NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures

İlköğretim İnsan fibroblast Kültürler gelen naif Erişkin Kök Hücre İzolasyon

Over the last decade, several adult stem cell  populations have been identified in human skin 1-4.  The isolation of multipotent adult dermal precursors ...

Mouse Genome Engineering Using Designer Nucleases

Tasarımcı nükleazlar kullanılması Fare Genom Mühendisliği

Transgenic mice carrying site-specific genome modifications (knockout, knock-in) are of vital importance for dissecting complex biological systems as well ...

Generation of Genomic Deletions in Mammalian Cell Lines via CRISPR/Cas9

CRISPR / Cas9 üzerinden Memeli Hücre Hatlarında Genomik Delesyonlar Üretimi

The prokaryotic clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated (Cas) 9 system may be re-purposed for site-specific ...

Whole Cell Electrophysiology of Primary Cultured Murine Enterochromaffin Cells

Tüm cep telefonu Elektrofizyoloji birincil kültürlü fare Enterochromaffin hücre

Enterochromaffin (EC) cells in the gastrointestinal (GI) epithelium constitute the largest subpopulation of enteroendocrine cells. As specialized sensory ...

In Situ Monitoring of Transiently Formed Molecular Chaperone Assemblies in Bacteria, Yeast, and Human Cells

Bakteri, Maya ve İnsan Hücrelerinde Geçici Olarak Oluşan Moleküler Şaperon Meclislerinin Yerinde İzlenmesinde

J-domain proteins (JDPs) form the largest and the most diverse co-chaperone family in eukaryotic cells. Recent findings show that specific members of the ...

Silencing the Spark: CRISPR/Cas9 Genome Editing in Weakly Electric Fish

Kıvılcım Susturma: CRISPR/Cas9 Zayıf Elektrikli Balıklarda Genom Düzenleme

Electroreception and electrogenesis have changed in the evolutionary history of vertebrates. There is a striking degree of convergence in these ...

Preparing and Injecting Embryos of Culex Mosquitoes to Generate Null Mutations using CRISPR/Cas9

Preparing and Injecting Embryos of Culex Mosquitoes to Generate Null Mutations using CRISPR/Cas9

CRISPR/Cas9 Kullanarak Boş Mutasyonlar Oluşturmak için Culex Sivrisineklerinin Embriyolarının Hazırlanması ve EnjekteSi

Culex mosquitoes are the major vectors of several diseases that negatively impact human and animal health including West Nile virus and diseases caused by ...

Construction of Homozygous Mutants of Migratory Locust Using CRISPR/Cas9 Technology

The migratory locust, Locusta migratoria, is not only one of the worldwide plague locusts that caused huge economic losses to human beings but also an ...