Een DNA/Ki67-gebaseerde flowcytometrietest voor celcyclusanalyse van antigeenspecifieke CD8 T-cellen bij gevaccineerde muizen

Ons protocol biedt een praktische benadering waarmee de milt en lymfeklieren van muizen kunnen worden gebruikt om de dynamiek van T-celrespons groter weer te geven dan het verstrekken van een steady-state fenotypische momentopname. Onze techniek detecteert gevoelig antigeenspecifieke CD8 T-cellen die bezig zijn met een voortdurende respons. Prolifererende CD8 T-cellen worden gemeten zonder de mogelijk verstorende effecten van in vivo medicamenteuze behandeling of celoverdracht.

Onze techniek kan een venster bieden op de immuundynamiek in verschillende omgevingen. Bijvoorbeeld met betrekking tot de respons op vaccinatie en infecties, auto-immuunziekten en kankerimmunotherapie. Bereid verse 1x permeabilisatie wasbuffer door 10x permeabilisatiebuffer te verdunnen met gedestilleerd water en filtreer het door een filter van 0,45 micrometer om aggregaten te elimineren.

Verdun monoklonaal antilichaam Ki67 FITC in 1x permeabilisatiewasbuffer zoals bepaald met een titratie-experiment voor een eindvolume van 100 microliter per monster. Voeg 3 milliliter van de 1x permeabilisatie wasbuffer toe aan elke buis met cellen en centrifugeer bij 400 G gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Gooi het supernatant weg.

Voeg nogmaals de 1x permeabilisatiewasbuffer toe en centrifugeer om de cellen te pelleteren. Gooi vervolgens het supernatant weg. Voeg 100 microliter verdund monoklonaal antilichaam Ki67 FITC toe aan de pellet, draai vervolgens vortex en incubeer gedurende 30 minuten in het donker.

Na de incubatie, was de cellen twee keer met 4 milliliter van 1x permeabilisatiebuffer, centrifugeer na elke wasbeurt en gooi het supernatant weg. Voeg 350 microliter PBS toe aan de celkorrel voor monsters die direct bij de flowcytometer kunnen worden verkregen en 250 microliter PBS aan de celkorrel voor monsters die met Hoechst moeten worden geïncubeerd voor DNA-kleuring. Bereid Hoechst en PBS-oplossing voor en voeg deze aan elk monster toe, zodat de uiteindelijke concentratie twee microgram per milliliter bedraagt.

Vortex en incubeer de monsters gedurende 15 minuten in het donker. Centrifugeer vervolgens de monsters gedurende vijf minuten en voeg 350 microliter PBS toe aan de celkorrel. Open de software en maak verschillende groepen die overeenkomen met de verschillende organen die moeten worden geanalyseerd door te klikken op Groep maken "in het lintgedeelte van de werkruimte.Open de software en maak verschillende groepen die overeenkomen met de verschillende organen die moeten worden geanalyseerd door te klikken op Groep maken" in het lintgedeelte van de werkruimte.

Open het gewijzigde groepsvenster door te dubbelklikken op de groepsnaam en synchroniseer de nieuw gemaakte groepen door een vinkje in te voegen op de gesynchroniseerde functie. Sleep elk FCS-bestand naar de bijbehorende groep en maak vervolgens een gatingstrategie die begint met de a-LN-groep. Open het grafiekvenster door te dubbelklikken op het volledig gekleurde monster om de ongeschonden gebeurtenissen die voor het monster zijn verkregen in een puntplot weer te geven.

Merk op dat de x- en y-as zijn gelabeld zoals in de FCS-bestanden, zoals aangegeven in tabel twee van het flowcytometerinstellingenbestand van dit manuscript. Controleer of er voldoende gebeurtenissen worden weergegeven voor de juiste visualisatie. Open indien nodig voorkeuren door op het hartpictogram in het werkruimtelint te klikken, grafieken te selecteren en vervolgens Dot Plot "als grafiektype" en controleer of het aantal punten dat in het overeenkomstige vak is getekend correct is of wijzig het.

Geef de ungated events in het grafiekvenster weer in een dot plot met DNA-A op de x-as en DNA-W op de y-as. Gebruik lineaire schaal voor beide assen. Verander indien nodig de schaal van logaritmisch naar lineair door op het vakje te klikken dat is aangegeven met een T dicht bij elke as in het grafiekvenster.

Selecteer een enkele celpopulatie door op de rechthoek in het gedeelte gating tool te klikken en dubbelklik vervolgens in het midden van de rechthoekige poort om enkele cellen weer te geven in een dot plot met FSC-A parameter op de x-as en dode cel matrijs op de y-as. Klik op de veelhoek om de levende celpopulatie te selecteren, die negatief zijn voor dode celmatrijs. Dubbelklik in het midden van de polygoonpoort om de cellen in een puntplot weer te geven met de parameter FSC-A op de x-as en de parameter SSC-A op de y-as.

Klik op de rechthoek en maak een ontspannen poort om alle afzonderlijke levende cellen in die grafiek op te nemen. Dubbelklik in het midden van de ontspannen poort om de cellen weer te geven in een dot plot met CD3 op de x-as en CD8 op de y-as. Gebruik de juiste toegangsschaal voor visualisatie in het grafiekvenster.

Wijzig indien nodig de x- en y-schaal door op het vakje te klikken, aangegeven met een T dicht bij elke as, kies Toegangsfunctie aanpassen en wijzig indien nodig extra neg-decennia met bases en positieve decennia. Selecteer de CD3+CD8+cellen door op polygoon te klikken. Dubbelklik in het midden van de CD3+CD8+gate om de cellen weer te geven in een dot plot met Tetr-gag op de x-as en Pent-gag op de y-as.

Selecteer de antigeenspecifieke CD8 T-cellen door op polygoon te klikken. Dubbelklik in het midden van de gag-specifieke poort om de cellen weer te geven in een dot plot met DNA-A op de x-as en Ki67 op de y-as. Selecteer de cellen in de verschillende celcyclusfasen door te klikken op Quad"in het gating tool-gedeelte van het grafiekvenster.

Kopieer de gatingstrategie die in één voorbeeld is gemaakt naar de overeenkomstige groep om de poorten toe te passen op alle voorbeelden van de groep. Kopieer vervolgens gatingstrategieën voor de b-milt- en CBM-groepen, zoals beschreven in het tekstmanuscript. Controleer of alle poorten geschikt zijn voor elk monster van de drie groepen.

Desynchroniseer indien nodig de groep en wijzig poorten zoals beschreven in het manuscript. Toon de BM-cellen van de ontspannen poort in een dot plot met DNA-A op de x-as en Ki67 op de y-as. Visualiseer de resultaten door te klikken op Lay-outeditor in het lintgedeelte van de werkruimte.

Sleep elke poort van de gatingstrategie in het voorbeeldvenster naar de lay-outeditor en plaats de plots volgens de volgorde van de gating. Wijzig indien nodig het grafiektype door te dubbelklikken op de bijbehorende plot in de lay-out en het juiste type te selecteren in het grafiekdefinitievenster. Klik op de groep en herhaal functies op het lay-outlint om de resultaten te visualiseren die zijn verkregen in antigeenspecifieke CD8 T-cellen van elk orgaan en verschillende monsters te vergelijken.

Visualiseer resultaten van beenmergcellen die een positieve controle vertegenwoordigen. Een typisch voorbeeld van celcyclusanalyse van beenmergcellen wordt hier getoond. Het protocol leverde een lage variatiecoëfficiënt op van G0 tot G1 en G2 tot M DNA-pieken, wat wijst op een uitstekende kwaliteit van de DNA-kleuring.

Een vijfstappenstrategie werd gebruikt om antigeenspecifieke CD8-cellen te identificeren. Twee multimeren werden gebruikt om de gevoeligheid van gag-specifieke CD8 T-celdetectie bij gevaccineerde muizen te verbeteren zonder de kleurachtergrond bij onbehandelde muizen te vergroten. Gag-specifieke CD8 T-cellen in de drainerende lymfeklieren en in de milt bevatten een hoog percentage cellen in de S-G2 / M-fasen op dag drie na de boost.

Bovendien hadden gag-specifieke CD8 T-cellen in de S-G2/M-fasen een hoge FSC-A en SSC-A wanneer ze over de totale CD8 T-cellen van hetzelfde orgaan werden gelegd. Offset histogrammen toonden aan dat cd62l-expressie door gag-specifieke CD8 T-cellen laag was, zoals verwacht voor geactiveerde T-cellen, behalve een paar cellen in G0 in de lymfeklieren. Deze methode is ontworpen voor T-cellen om een uitstekende kwaliteit van DNA-kleuring te bereiken samen met het membraan en Ki67-kleuring.

Flowcytometrie data-analyse is een belangrijk punt. Zorg ervoor dat u de juiste bediening gebruikt voor het plaatsen van poorten. Met behulp van deze methode ontdekten we T-cellen in S-G2 / M-fasen van de celcyclus in muizen en menselijk perifeer bloed.

Deze techniek was nuttig in immunomonitoringstudies bij type 1 diabetes, infectieuze mononucleosis en COVID-19.