Un ensayo de citometría de flujo basado en ADN/Ki67 para el análisis del ciclo celular de células T CD8 específicas de antígeno en ratones vacunados

Nuestro protocolo proporciona un enfoque práctico mediante el cual el bazo de ratón y los ganglios linfáticos se pueden utilizar para reflejar la dinámica de la respuesta de las células T mayor que proporcionar una instantánea fenotípica en estado estacionario. Nuestra técnica detecta sensiblemente las células T CD8 específicas del antígeno que participan en una respuesta continua. Las células T CD8 en proliferación se miden sin los posibles efectos de confusión del tratamiento farmacológico in vivo o la transferencia celular.

Nuestra técnica puede proporcionar una ventana en la dinámica inmune en varios entornos. Por ejemplo, en relación con la respuesta a la vacunación y las infecciones, las enfermedades autoinmunes y la inmunoterapia contra el cáncer. Prepare un tampón de lavado de permeabilización fresco 1x diluyendo el tampón de permeabilización 10x con agua destilada y filtre a través de un filtro de 0.45 micrómetros para eliminar agregados.

Diluir el anticuerpo monoclonal Ki67 FITC en 1 tampón de lavado de permeabilización según lo determinado con un experimento de titulación para un volumen final de 100 microlitros por muestra. Agregue 3 mililitros del tampón de lavado de permeabilización 1x a cada tubo con células y centrífuga a 400 G durante cinco minutos a temperatura ambiente. Deseche el sobrenadante.

Nuevamente, agregue el tampón de lavado de permeabilización 1x y la centrífuga para granular las células. Luego, deseche el sobrenadante. Agregue 100 microlitros de anticuerpo monoclonal diluido Ki67 FITC al pellet, luego vórtice e incube durante 30 minutos en la oscuridad.

Después de la incubación, lave las células dos veces con 4 mililitros de tampón de permeabilización 1x, centrifugando después de cada lavado y deseche el sobrenadante. Agregue 350 microlitros de PBS al pellet celular para que las muestras se adquieran directamente en el citómetro de flujo y 250 microlitros de PBS al pellet celular para que las muestras se incuben con Hoechst para la tinción de ADN. Prepare la solución de Hoechst y PBS y agréguela a cada muestra para que la concentración final sea de dos microgramos por mililitro.

Vórtice e incube las muestras durante 15 minutos en la oscuridad. Luego, centrifugue las muestras durante cinco minutos y agregue 350 microlitros de PBS al pellet celular. Abra el software y cree diferentes grupos correspondientes a los diferentes órganos que se analizarán haciendo clic en Crear grupo" en la sección de la cinta del espacio de trabajo.

Abra la ventana del grupo modificado haciendo doble clic en el nombre del grupo y sincronice los grupos recién creados insertando una marca de verificación en la función sincronizada. Arrastre cada archivo FCS a su grupo correspondiente y, a continuación, cree una estrategia de cierre que comience con el grupo a-LN. Abra la ventana del gráfico haciendo doble clic en la muestra completamente teñida para mostrar los eventos no restringidos adquiridos para la muestra en un diagrama de puntos.

Tenga en cuenta que los ejes x e y están etiquetados como en los archivos FCS, como se indica en la tabla dos del archivo de configuración del citómetro de flujo de este manuscrito. Compruebe que se muestra un número suficiente de eventos para una visualización adecuada. Si es necesario, abra las preferencias haciendo clic en el icono del corazón en la cinta del espacio de trabajo, seleccione Gráficos, luego Trazado de puntos "como tipo de gráfico" y verifique que el número de puntos dibujados en el cuadro correspondiente sea correcto o cámbielo.

Muestre los eventos no protegidos en la ventana del gráfico en un diagrama de puntos con DNA-A en el eje x y DNA-W en el eje y. Utilice la escala lineal para ambos ejes. Si es necesario, cambie la escala de logarítmica a lineal haciendo clic en el cuadro indicado con una T cerca de cada eje en la ventana del gráfico.

Seleccione una población de una sola celda haciendo clic en el rectángulo en la sección de la herramienta de cierre y luego haga doble clic en el centro de la puerta rectangular para mostrar celdas individuales en un diagrama de puntos con el parámetro FSC-A en el eje X y el troquel de celda muerta en el eje y. Haga clic en el polígono para seleccionar la población de células vivas, que son negativas para la muerte de células muertas. Haga doble clic en el centro de la puerta del polígono para mostrar las celdas en un diagrama de puntos con el parámetro FSC-A en el eje x y el parámetro SSC-A en el eje y.

Haga clic en el rectángulo y cree una puerta relajada para incluir todas las celdas vivas individuales en ese gráfico. Haga doble clic en el centro de la puerta relajada para mostrar las celdas en un diagrama de puntos con CD3 en el eje X y CD8 en el eje Y. Utilice la escala de acceso adecuada para la visualización en la ventana del gráfico.

Si es necesario, modifique la escala x e y haciendo clic en el cuadro, indicado con una T cerca de cada eje, elija Personalizar función de acceso y modifique las décadas de neg adicionales con bases y décadas positivas según sea necesario. Seleccione las celdas CD3+CD8+ haciendo clic en polígono. Haga doble clic en el centro de la puerta CD3+CD8+ para mostrar las celdas en un diagrama de puntos con Tetr-gag en el eje X y Pent-gag en el eje y.

Seleccione las células T CD8 específicas del antígeno haciendo clic en el polígono. Haga doble clic en el centro de la puerta específica de la mordaza para mostrar las células en un diagrama de puntos con ADN-A en el eje X y Ki67 en el eje y. Seleccione las celdas en las diferentes fases del ciclo celular haciendo clic en Quad" en la sección de la herramienta de cierre de la ventana del gráfico.

Copie la estrategia de cierre creada en una muestra al grupo correspondiente para aplicar las puertas a todas las muestras del grupo. A continuación, copie las estrategias de cierre para los grupos de bazo b y CBM, como se describe en el manuscrito de texto. Verifique que todas las puertas sean apropiadas para cada muestra de los tres grupos.

Si es necesario, desincronice el grupo y modifique las puertas como se describe en el manuscrito. Muestre las células BM de la puerta relajada en un diagrama de puntos con ADN-A en el eje x y Ki67 en el eje y. Visualice los resultados haciendo clic en Editor de diseño" en la sección de la cinta del espacio de trabajo.

Arrastre cada puerta de la estrategia de cierre en el panel de ejemplo al editor de diseño y coloque los gráficos de acuerdo con la secuencia del cierre. Si es necesario, cambie el tipo de gráfico haciendo doble clic en el gráfico correspondiente en el diseño y seleccionando el tipo apropiado en la ventana de definición del gráfico. Haga clic en el grupo e itere por funciones en la cinta de diseño para visualizar los resultados obtenidos en las células T CD8 específicas del antígeno de cada órgano y comparar diferentes muestras.

Visualizar resultados de células de médula ósea que representan un control positivo. Un ejemplo típico de análisis del ciclo celular de las células de la médula ósea se muestra aquí. El protocolo produjo un bajo coeficiente de variación de G0 a G1 y G2 a M picos de ADN, lo que indica una excelente calidad de la tinción de ADN.

Se empleó una estrategia de cierre de cinco pasos para identificar células CD8 específicas del antígeno. Se utilizaron dos multímeros para mejorar la sensibilidad de la detección de células T CD8 específicas de gag en ratones vacunados sin aumentar el fondo de tinción en ratones no tratados. Las células T CD8 específicas de Gag en los ganglios linfáticos drenantes y en el bazo contienen una alta proporción de células en las fases S-G2 / M en el tercer día después del impulso.

Además, las células T CD8 específicas de gag en las fases S-G2 / M tenían fsc-A y SSC-A altos cuando se superponían a las células T CD8 totales del mismo órgano. Los histogramas offset mostraron que la expresión de CD62L por las células T CD8 específicas de gag fue baja, como se esperaba para las células T activadas, a excepción de unas pocas células en G0 en los ganglios linfáticos. Este método está diseñado para que las células T logren una excelente calidad de tinción de ADN junto con la membrana y la tinción de Ki67.

El análisis de datos de citometría de flujo es un punto clave. Asegúrese de utilizar el control adecuado para el posicionamiento de la puerta. Usando este método, descubrimos células T en fases S-G2 / M del ciclo celular en sangre periférica de ratón y humano.

Esta técnica fue útil en estudios de inmunomonitorización en diabetes tipo 1, mononucleosis infecciosa y COVID-19.