Name: label-free imaging of lipid storage dynamics in caenorhabditis elegans using stimulated raman scattering microscopy
Uploaded: 2021-05-28T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Label-Free Imaging of Lipid Storage Dynamics in Caenorhabditis elegans using Stimulated Raman Scattering Microscopy at JoVE.com

Ce travail a été soutenu par les subventions R01AG045183 (M.C.W.), R01AT009050 (M.C.W.), R01AG062257 (M.C.W.), DP1DK113644 (M.C.W.), March of Dimes Foundation (M.C.W.), Welch Foundation (M.C.W.), et par le chercheur HHMI (M.C.W.). Nous remercions le Caenorhabditis Genetics Center (CGC) pour les souches de C. elegans.

1. Configuration instrumentale pour la microscopie à diffusion Raman stimulée
REMARQUE: Le système de microscopie SRS est construit sur un laser picoseconde avec oscillateur paramétrique optique intégré à la pompe et un microscope à balayage laser confocal. L’oscillateur fournit deux trains d’impulsions picosecondes, dont un faisceau de Stokes à 1 064 nm et un faisceau de pompe accordable entre 700 et 990 nm. Le chevauchement temporel et spatial des deux faisceaux est réalisé à l...

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Pour se défendre contre l’obésité et ses troubles métaboliques associés, d’importants efforts de recherche ont été mis en œuvre pour mieux comprendre les mécanismes de régulation de l’homéostasie lipidique. Pour la détection quantitative des molécules lipidiques dans les échantillons biologiques, l’imagerie sans étiquette par microscopie SRS s’est avérée être une alternative fiable aux tests biochimiques et à d’autres méthodes de coloration. Notre groupe et d’autres ont révélé de nouv...

L’obésité est devenue un problème de santé mondial menaçant un tiers de la population mondiale, et elle présente un grave problème médical, étant donné son association avec une mauvaise santé mentale1 et des maladies mortelles dont le diabète2,les maladiescardiovasculaires 3 et certains types de cancer4. L’étude du métabolisme des lipides est essentielle pour mieux comprendre les problèmes biologiques derrière l’obésité. La quantification rapide et spécifique du stockage lipidique implique la détection d’acides gras et de leurs dérivés, ainsi que de métabolites contenant des stérols, avec une sensibilité élevée et de préférence avec des informations spatiales. Les lipides sont des cibles difficiles à imager car ils manquent de fluorescence intrinsèque et ne peuvent pas être facilement marqués par fluorescence. Les étiquettes fluorescentes sont souvent plus grandes que les molécules lipidiques et, par conséquent, peuvent être chimiquement invasives et peu pratiques pour des applications in vivo. Une stratégie d’étiquetage sans étiquette ou minimale est nécessaire pour préserver la structure hydrophobe des molécules lipidiques5. Les développements récents dans les technologies d’imagerie ont créé des opportunités passionnantes pour l’imagerie sans étiquette des lipides dans les cellules, les tissus et les organismes vivants.
Les approches traditionnelles pour les analyses de stockage de lipides dans des échantillons biologiques incluent des essais biochimiques et des protocoles de coloration avec des colorants lipophiles. Les tests de quantification biochimique impliquant la spectrométrie de masse (MS) sont inégalés dans leur résolvabilité moléculaire, mais ils nécessitent de très grandes quantités d’échantillons et la préparation des échantillons prend généralement plusieurs heures, limitant leur application pour l’imagerie en temps réel des systèmes vivants5. Une autre limite majeure de ces essais est le manque d’informations spatiales. D’autre part, les colorants lipophiles tels que Oil Red O et Sudan Black fournissent une distribution tissulaire et cellulaire des organites de stockage des lipides et par rapport aux techniques de SEP, ces méthodes de coloration sont également peu coûteuses et faciles à réaliser. Cependant, ces protocoles de coloration nécessitent une fixation, ce qui peut avoir un impact sur la nature hydrophobe des gouttelettes lipidiques, générer des changements artificiels dans leur structure et entraîner des incohérences entre les expériences6. Les difficultés techniques liées aux techniques biochimiques et de coloration ont mené à la recherche de méthodes sans étiquette pour imager des molécules lipidiques et à l’augmentation rapide de l’utilisation de la microscopie cohérente de diffusion de Raman (CRS) dans l’imagerie lipidique.
L’effet Raman a d’abord été reconnu par Raman et Krishnan, où ils ont rapporté qu’en interagissant avec un photon, une molécule peut générer de la lumière diffusée sans changement de longueur d’onde (appelée diffusion de Rayleigh) ou rarement avec une longueur d’onde altérée (appelée diffusion Raman) et ce changement de longueur d’onde est caractéristique des groupes chimiques fonctionnels au sein de la molécule7. Lorsque les liaisons chimiques au sein d’une molécule sont excitées à un niveau d’énergie vibratoire plus élevé par un photon incident, appelé photon de pompe, l’énergie du photon dispersé, appelé photon de Stokes, devient plus faible. Sinon, les liaisons chimiques peuvent atteindre un niveau d’énergie vibratoire inférieur si elles sont à l’origine à un niveau supérieur, et le photon dispersé gagne de l’énergie pour être le photon anti-Stokes. La différence de fréquence entre l’incident et les photons dispersés est connue sous le nom de décalage Raman. Chaque liaison chimique au sein d’une molécule a un décalage Raman caractéristique et quantifiable. Par exemple, la liaisonCH2 présente un décalage Raman de 2 845cm-1,ce qui est abondant dans les chaînes d’acides gras8. Ce signal raman spontané est généralement très faible, ce qui a considérablement limité la vitesse d’imagerie en microscopie raman spontanée conventionnelle. Au fil des ans, diverses approches ont été développées pour augmenter la vitesse d’imagerie et la sensibilité de la microscopie Raman spontanée. La microscopie à diffusion Raman cohérente, y compris la microscopie à diffusion Raman anti-Stokes cohérente (CARS) et la microscopie à diffusion Raman stimulée (SRS), est le progrès le plus récent. Cars et SRS ont des principes de travail légèrement différents, mais les deux sont des techniques sans étiquette qui ont une capacité d’imagerie en direct, peuvent fournir des informations spatiales et temporelles sur la dynamique de stockage des lipides, et ne nécessitent qu’une petite taille d’échantillon. La microscopie CARS souffre d’un fond non résonnant, qui provient de divers processus non linéaires, et les signaux CARS ont également une relation non linéaire avec la concentration de la molécule, ce qui complique ensemble le processus de quantification9. Contrairement à la microscopie CARS, la microscopie SRS ne génère pas de signaux de fond non résonnants et offre une dépendance linéaire à la concentration de la molécule d’intérêt. Ainsi, actuellement la microscopie SRS est plus largement utilisée pour l’imagerie lipidique.
En microscopie SRS, les signaux Raman spontanés faibles peuvent être amplifiés lorsqu’ils sont excités par deux faisceaux laser synchronisés avec leur différence de fréquence correspondant à la fréquence vibratoire de liaison chimique. La molécule connaîtra une transition améliorée vers un état excité grâce à une excitation cohérente. En conséquence, le taux de génération de photons de Stokes est augmenté. Par conséquent, l’intensité du faisceau « Stokes » transmis augmente (gain Raman stimulé, SRG) et l’intensité du faisceau « pompe » transmis diminue (perte Raman stimulée, SRL). La détection de signaux SRG ou SRL sous-tend la base de l’imagerie par microscopie à diffusion raman stimulée (SRS) de molécules avec des liaisons chimiques spécifiques10. Si la différence de fréquence entre les deux faisceaux laser ne correspond pas à la fréquence vibratoire de la liaison chimique au sein d’une molécule d’intérêt, ni les signaux SRG ni SRL ne seront générés. La vitesse d’imagerie de la microscopie SRS est d’environ 2 μsec par pixel ou 1 seconde par image, ce qui est beaucoup plus rapide que la microscopie Raman spontanée11. La résolution latérale typique pour la microscopie SRS est limitée par diffraction et autour de 300 nm. En outre, les processus optiques à deux photons de la microscopie SRS permettent l’imagerie 3D volumétrique d’échantillons de tissus relativement épais et la profondeur d’imagerie pourrait atteindre 300 à 500 μm. Dans l’ensemble, la microscopie SRS présente une technique d’imagerie efficace et sans étiquette pour détecter des biomolécules spécifiques, en particulier les lipides.
Les gouttelettes lipidiques sont des organites à membrane unique, qui sont le principal site de stockage cellulaire pour les lipides neutres, y compris les triacylglycérols (TAGs) et les esters de cholestérol (CE). Les liaisonsCH2 dans les chaînes d’acides gras de ces molécules lipidiques génèrent des signaux SRS forts à 2 845cm-1 lorsqu’elles sont excitées8,permettant ainsi la détection et la quantification des taux de lipides de stockage dans des cellules intactes, des sections tissulaires et même des organismes entiers 12,13,14,15. En particulier, C. elegans sont utiles pour les études d’imagerie lipidique en raison de leur transparence. Comme les mammifères, C. elegans stocke également les lipides dans les gouttelettes lipidiques et les voies de synthèse et de dégradation des molécules lipidiques sont hautement conservées16. Dans ce protocole, nous fournirons le principe de fonctionnement de la microscopie SRS, sa configuration fondamentale et décrirons les méthodes pour son utilisation dans l’imagerie lipidique chez C. elegans.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>A/D converter</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>Analog Unit</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>GeneMate</td>
			<td>3119</td>
			<td>For making agarose pads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alignment tool - adapter</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>SM1A4</td>
			<td>For mounting the tool on scope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alignment tool - target</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>VRC2SM1</td>
			<td>For viewing IR laser</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alignment tool - tube</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>SM1L40</td>
			<td>Length can vary</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autocorrelator (Optional)</td>
			<td>APE</td>
			<td>pulseCheck</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bandpass filter</td>
			<td>minicircuits</td>
			<td>BBP-21.4+ if modulated at 20MHz or KR Electronics 2724 if modulated at 8 MHz</td>
			<td>For signal with modulation frequency filtering</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BNC cables</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ800</td>
			<td>For handling and picking worms for imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dodecane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>44010</td>
			<td>Used for calibration of the SRS signal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter</td>
			<td>Chroma Technology</td>
			<td>890/220 CARS</td>
			<td>For removing Stokes beam</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>General purpose laboratory labeling tape</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89097</td>
			<td>For making agarose pads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48393-106</td>
			<td>For covering worms for imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass microscope slide</td>
			<td>VWR</td>
			<td>16004-422</td>
			<td>For making agarose pads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser scanning microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>FV3000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lens</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>L1: AC254-050-B 
			L2: AC254-075-B</td>
			<td>For beam expander</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lock-in amplifier</td>
			<td>Zurich</td>
			<td>HF2LI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lowpass filter</td>
			<td>minicircuits</td>
			<td>BLP-1.9+</td>
			<td>For power supply noise suppression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mirrors</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>BB1-E03</td>
			<td>For relay and periscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>UPlanSAPO 20x 0.75, UPlanSAPO 60XW 1.20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photodiode</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>FDS1010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Picosecond laser source</td>
			<td>APE</td>
			<td>picoEmerald</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power supply</td>
			<td>TEKPOWER</td>
			<td>TP1342U</td>
			<td>For photodiode, reversed 50V voltage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2002</td>
			<td>For anaesthesizing the worms</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Worm picker</td>
			<td>WormStuff</td>
			<td>59-AWP</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

label-free imaging of lipid storage dynamics in caenorhabditis elegans using stimulated raman scattering microscopy

Le métabolisme des lipides est un processus physiologique fondamental nécessaire à la santé cellulaire et de l’organisme. Dysregulation du métabolisme des lipides provoque souvent l’obésité et beaucoup de maladies associées comprenant des désordres cardio-vasculaires, le diabète de type II, et le cancer. Pour faire progresser la compréhension actuelle de la régulation métabolique des lipides, les méthodes quantitatives permettant de mesurer avec précision les niveaux de stockage des lipides in vivo dans le temps et l’espace sont devenues de plus en plus importantes et utiles. Les approches traditionnelles pour analyser le stockage des lipides sont semi-quantitatives pour l’évaluation microscopique ou manquent d’informations spatio-temporelles pour la mesure biochimique. La microscopie à diffusion Raman stimulée (SRS) est une technologie d’imagerie chimique sans étiquette qui permet une détection rapide et quantitative des lipides dans les cellules vivantes avec une résolution subcellulaire. Comme le contraste est exploité à partir de vibrations moléculaires intrinsèques, la microscopie SRS permet également un suivi quadridimensionnel des lipides chez les animaux vivants. Au cours de la dernière décennie, la microscopie SRS a été largement utilisée pour l’imagerie de petites molécules dans la recherche biomédicale et a surmonté les principales limitations des méthodes conventionnelles de coloration fluorescente et d’extraction lipidique. En laboratoire, nous avons combiné la microscopie SRS avec les outils génétiques et biochimiques disponibles pour le puissant organisme modèle, Caenorhabditis elegans, pour étudier la distribution et l’hétérogénéité des gouttelettes lipidiques à travers différentes cellules et tissus et finalement pour découvrir de nouvelles voies de signalisation conservées qui modulent le métabolisme des lipides. Ici, nous présentons les principes de travail et la configuration détaillée du microscope SRS et fournissons des méthodes pour son utilisation dans la quantification du stockage des lipides à des points de temps de développement distincts de type sauvage et de signalisation de l’insuline mutant déficient C. elegans.

La signalisation de l’insuline est une voie endocrinienne importante qui affecte le développement, la reproduction, la durée de vie et le métabolisme. Chez les vers, la signalisation de l’insuline se compose d’environ 40 ligands peptidiques analogues à l’insuline, d’un orthologue de récepteur du facteur de croissance analogue à l’insuline DAF-2, d’une cascade de kinase PI3K /AKT en aval et de l’orthologue du facteur de transcription FoxO, DAF-1620. les mutants daf-2,...

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Label-Free Imaging of Lipid Storage Dynamics in Caenorhabditis elegans using Stimulated Raman Scattering Microscopy

La microscopie à diffusion Raman stimulée (SRS) permet l’imagerie sélective et sans étiquette de fractions chimiques spécifiques et elle a été utilisée efficacement pour imager des molécules lipidiques in vivo. Ici, nous fournissons une brève introduction au principe de la microscopie SRS et décrivons des méthodes pour son utilisation dans le stockage des lipides d’imagerie dans Caenorhabditis elegans.

Imagerie sans étiquette de la dynamique de stockage des lipides chez Caenorhabditis elegans à l’aide de la microscopie de diffusion Raman stimulée

Lipid metabolism is a fundamental physiological process necessary for cellular and organism health. Dysregulation of lipid metabolism often elicits ...

La microscopie à diffusion Raman stimulée est une technologie d’imagerie chimique qui permet la détection rapide et quantitative des lipides et permet le suivi des lipides chez les animaux vivants d’une manière sans étiquette. L’avantage le plus important de la microscopie SRS par rapport aux techniques traditionnelles de détection des lipides est qu’elle est sans étiquette et n’est donc pas aussi durable pour le photo blanchiment que d’autres questions de fluorescence et de coloration. L’utilisation de la microscopie SRS en conjonction avec les outils génétiques et biochimiques disponibles pour les organismes modèles, en particulier Caenorhabditis elegans fournit un cadre puissant pour l’étude des régulateurs normaux de la biologie et du métabolisme des lipides.Pour alimenter les faisceaux laser dans le microscope SRS, tout d’abord, réglez le périscope pour soulever le faisceau d’une sortie de source de lumière picoseconde vers le port d’entrée laser infrarouge sur le scanner du microscope et ouvrez le logiciel de contrôle laser pour démarrer les lasers. Abaissez la puissance laser de la pompe à 50 milliwatts et réglez le signal de la pompe à 750 nanomètres. Utilisez un expanseur de faisceau pour ajuster le diamètre du faisceau afin de l’adapter à l’ouverture arrière des objectifs du microscope.Utilisez deux miroirs relais, M1 et M2, pour guider le faisceau laser vers le périscope et régler les hochements de la main du périscope au centre de la plage d’accord. Sélectionnez la position initiale et l’angle de chaque miroir de sorte que le faisceau laser frappe approximativement le centre du miroir pour lancer le faisceau dans le microscope et utiliser un port vide sur la tourelle objective du microscope pour effectuer l’alignement de la trajectoire. Placez la sonde du capteur de puissance à l’orifice de l’objectif pour mesurer la puissance de la lumière transmise et réglez le scanner du microscope au zoom le plus élevé, 50X.Mesurez la puissance de la lumière transmise avec le point de faisceau laser focalisé et optimisez les boutons des miroirs M1 et M2 de manière itérative pour atteindre la puissance laser transmise la plus élevée. Utilisez l’outil d’alignement pour effectuer l’alignement fin de la lumière transmise afin de vous assurer que la lumière passe par le centre de l’objectif et placez le capuchon d’alignement de la cible de fluorescence sur le siège de l’objectif vide. Ajustez les boutons du premier rétroviseur de direction, M1, pour centrer le point de faisceau laser et introduisez le tube d’extension avec le capuchon d’alignement à l’autre extrémité à un siège d’objectif vide pour surveiller le point de faisceau laser.Ensuite, réglez les boutons du deuxième rétroviseur de direction, M2, pour centrer à nouveau le point de faisceau laser à l’autre extrémité du tube d’extension. Pour configurer le module de détection SRS, placez un cube séparateur de faisceau après le condenseur pour diriger le laser transmis vers le module de photo diode. Pour configurer la connexion électronique, utilisez un modulateur électro-optique intégré à 20 mégahertz à l’intérieur du laser accordable picoseconde pour moduler l’intensité du faisceau de Stokes et alimenter le signal de sortie de la photo diode dans l’amplificateur de verrouillage pour la démodulation de la perte Raman stimulée.Ensuite, alimentez la sortie de l’amplificateur verrouillé dans la boîte analogique du microscope pour convertir le signal analogique électrique en signal numérique. Pour optimiser les conditions d’imagerie, ajoutez cinq microlitres d’acide oléique à une mini chambre à lame du microscope et couvrez l’échantillon avec un glissement de couverture. Placez l’échantillon sur l’étage du microscope et utilisez le bord du tampon pour localiser et concentrer sur la gouttelette.Ajustez le condenseur pour l’éclairage Kohler et utilisez une carte de capteur infrarouge et une visionneuse infrarouge pour vérifier si le chemin du faisceau de la pompe est toujours correct. Vérifiez que l’étage de retard est réglé sur zéro femtosecondes et réglez la longueur d’onde du faisceau de la pompe à 795,8 nanomètres. Réglez la puissance du faisceau de la pompe à 50 milliwatts et réglez le faisceau Stoke à 100 milliwatts.Ouvrez l’obturateur pour les deux faisceaux, ainsi que l’obturateur principal du laser. Numérisez l’échantillon et vérifiez l’image sur l’écran de l’ordinateur. Changez le mode d’affichage à haut bas et ajustez la plage pour voir une saturation d’environ 50%.Vérifiez si la saturation est centrée dans l’image, en ajustant soigneusement les rétroviseurs de direction à l’intérieur du système laser réglable picoseconde pour un chevauchement optimisé de la pompe et des Stokes afin de maximiser l’intensité de l’image et de centrer l’intensité maximale si nécessaire. Avant chaque séance d’imagerie, ajoutez 100 microlitres d’agarose chaude à 2 % à une lame de verre propre placée entre des lames de soutien avec deux couches de ruban de laboratoire et placez rapidement une deuxième lame sur la première lame. Pressé doucement pour créer un tampon d’agarose mince et uniforme et laisser l’agarose refroidir.Pour monter les vers pour l’imagerie, placez une goutte de quatre à cinq microlitres d’agent anesthésique par 10 à 20 vers sur un glissement de couverture et utilisez un microscope de dissection pour choisir les vers à imager, en plaçant les vers sur la gouttelette de l’anesthésie au fur et à mesure qu’ils sont collectés. Lorsque tous les vers ont été collectés, couvrez-les avec la lame de verre avec le tampon d’agarose. Pour l’imagerie, montez l’échantillon de ver avec le glissement du couvercle face à la lentille de l’objectif et dirigez la source de lumière à champ lumineux vers l’oculaire pour localiser les vers.Ez les vers au point et ajustez la position du condenseur en conséquence. Ajustez les puissances laser en fixant la puissance laser de la pompe à 200 milliwatts et la puissance IR à 400 milliwatts. Réglez l’amplificateur verrouillé pour la démodulation du signal SRS du ver.Commencez à analyser le premier ver à un rythme d’analyse rapide, en ajustant la mise au point fine pour trouver la zone d’intérêt. Lorsque le signal a été optimisé, passez à un taux de balayage plus lent et à une résolution en pixels plus élevée pour obtenir l’image SRS et enregistrer l’image dans un format qui permet une haute résolution. Lorsque tous les échantillons ont été ginés, placez la source laser en veille et éteignez tout l’équipement associé.Pour analyser les images, ouvrez les fichiers dans ImageJ et sélectionnez Analyser et définir les mesures pour sélectionner les propriétés à analyser. Utilisez l’outil de sélection de polygones pour décrire la région de l’intestin du ver à quantifier, puis cliquez à nouveau sur Analyser et mesurer. Les mesures apparaîtront dans la fenêtre de résultats.Lorsque tous les vers ont été décrits, copiez et collez les mesures de chacun des vers d’un génotype donné dans une feuille de calcul. Pour la valeur de mesure d’arrière-plan, sélectionnez une zone à proximité du ver qui n’a pas de signal SRS et soustrayez la valeur grise moyenne d’arrière-plan de la mesure pour chaque ver individuel afin de calculer la moyenne et l’écart type des valeurs grises moyennes soustraites d’arrière-plan de tous les vers d’un génotype ou d’un groupe d’essai donné. Ces valeurs peuvent ensuite être normalisées à la moyenne du groupe témoin.Dans cette analyse représentative, les niveaux intestinaux de lipide dans le type âge-synchronisés les vers sauvages et les mutants daf-2 manquant du récepteur d’insuline ont été quantifiés pendant l’âge adulte. Comme prévu, une baisse des taux de lipides est observée chez les vers de type sauvage, à partir du premier jour et jusqu’au neuvième jour de l’âge adulte. Les taux de lipides chez les mutants daf-2, cependant, augmentent jusqu’à ce qu’ils aient cinq jours, moment auquel ils restent constants à environ 2,5 à trois fois plus élevés que le type sauvage.L’inactivation de Daf-16 supprime l’augmentation des taux de lipides des mutants daf-2. L’expression de l’isoforme daf-16a a ou daf-16b dans les doubles mutants daf-2, daf-16 ne restaure pas les taux de lipides. L’expression de l’isoforme de daf-16d/f/h, cependant, est suffisante pour reconstituer les niveaux de lipide dans daf-2, daf-16 doubles mutants aux niveaux observés dans les mutants simples daf-2.Ces résultats indiquent que l’isoform de daf-16d/f/h module spécifiquement le métabolisme de lipide dans les vers de mutant daf-2. Il est important d’utiliser la même puissance laser pour la pompe et les faisceaux de Stokes tout au long de la session d’imagerie et d’inclure un groupe témoin dans chaque quantification cohérente de six et quatre. En plus de quantifier le stockage des lipides, la microscopie SRS peut être couplée avec des étiquettes bioorthogonales, telles que le deutérium, et mise en œuvre pour visualiser la dynamique de l’incorporation, de la synthèse et de la dégradation des lipides.La microscopie SRS permet le multiplexage et peut être mise en œuvre pour imager plusieurs biomolécules dans différents compartiments subcellulaires. La microscopie SRS dite hyperspectrale a un grand avenir dans l’exploration de la dynamique métabolique.

Research

JoVE Journal

Biology

Label-Free Imaging of Lipid Storage Dynamics in Caenorhabditis elegans using Stimulated Raman Scattering Microscopy

Label-free in situ Imaging of Lignification in Plant Cell Walls

Label-free in situ Imaging of Lignification in Plant Cell Walls

Sans étiquette In situ</emImagerie> de lignification dans les parois des cellules végétales

Meeting growing energy demands safely and efficiently is a pressing global challenge. Therefore, research into biofuels production that seeks to find ...

Recherche

Biologie

Differential Imaging of Biological Structures with Doubly-resonant Coherent Anti-stokes Raman Scattering (CARS)

Differential Imaging of Biological Structures with Doubly-resonant Coherent Anti-stokes Raman Scattering CARS

Imagerie différentielle des structures biologiques avec doublement résonnante anti-Stokes cohérente diffusion Raman (CARS)

Coherent Raman imaging techniques have seen a dramatic increase in activity over the past decade due to their promise to enable label-free optical imaging ...

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

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Time-lapse de microscopie du début de l&#39;embryogenèse dans les Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes.  The transparency of the 
embryos, the genetic ...

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

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De base<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Méthodes: Synchronisation et d&#39;observation

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

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The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Quantification of Lipid Abundance and Evaluation of Lipid Distribution in Caenorhabditis elegans by Nile Red and Oil Red O Staining

Quantification of Lipid Abundance and Evaluation of Lipid Distribution in Caenorhabditis elegans by Nile Red and Oil Red O Staining

Quantification de l’abondance de lipides et évaluation de la Distribution des lipides du Nil rouge et huile rouge O coloration de Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans is an exceptional model organism in which to study lipid metabolism and energy homeostasis. Many of its lipid genes are conserved ...

Oligomerization Dynamics of Cell Surface Receptors in Living Cells by Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy Combined with Number and Brightness Analysis

Dynamique d'oligomerisation des récepteurs de surface cellulaire dans les cellules vivantes par microscopie de fluorescence interne totale combinée à l'analyse du nombre et de la luminosité

Despite the importance and ubiquity of receptor oligomerization, few methods are applicable for detecting clustering events and measuring the degree of ...

Using Caenorhabditis elegans to Screen for Tissue-Specific Chaperone Interactions

Using Caenorhabditis elegans to Screen for Tissue-Specific Chaperone Interactions

Utilisation de Caenorhabditis elegans pour dépister les interactions tissulaires spécifiques des chaperons

Correct folding and assembly of proteins and protein complexes are essential for cellular function. Cells employ quality control pathways that correct, ...

Rapid Antimicrobial Susceptibility Testing by Stimulated Raman Scattering Imaging of Deuterium Incorporation in a Single Bacterium

Test rapide de sensibilité aux antimicrobiens par imagerie par diffusion Raman stimulée de l’incorporation de deutérium dans une seule bactérie

To slow and prevent the spread of antimicrobial resistant infections, rapid antimicrobial susceptibility testing (AST) is in urgent need to ...

Automating Aggregate Quantification in Caenorhabditis elegans

Automating Aggregate Quantification in Caenorhabditis elegans

Automatisation de la quantification agrégée chez Caenorhabditis elegans

A rise in the prevalence of neurodegenerative protein conformational diseases (PCDs) has fostered a great interest in this subject over the years. This ...