Volwassen Drosophila melanogaster voorbereiden op whole brain imaging tijdens gedrags- en stimulireacties

Ons protocol maakt beeldvorming van het hele vliegbrein tijdens gedrag mogelijk, wat belangrijk is om te begrijpen hoe neuronen in verschillende hersengebieden interageren om gedrag vorm te geven. In tegenstelling tot andere gepubliceerde protocollen, werd dit specifiek ontwikkeld om toegang te krijgen tot de hele hersenen terwijl de vlieg zich gedraagt en voelt door een geur, smaak of visuele stimulatie. Om een hoofdsleuf te maken.

Nadat u de houder met een 3D-printer hebt afgedrukt, plaatst u een stuk plakband rechthoekig op een plat oppervlak onder een stereomicroscoop. En snijd een stuk van ongeveer vijf millimeter bij een centimeter. Gebruik twee scalpels die parallel aan elkaar zijn bevestigd om een volgende sleuf van 400 bij 400 micrometer in het midden van de langere kant van de tape te snijden en plaats de tape over de vlakkere kant van het gat aan de onderkant van de houder.

Gebruik een tang om de tape ongeveer 500 micrometer rond het gat te duwen. En gebruik zwarte nagellak om de bovenkant van de tape en de houder te bedekken. Nadat u de nagellak minstens een uur hebt laten drogen, gebruikt u een gerold weefsel om ongeveer één microliter vet aan de hoofdsleuf toe te voegen.

Om de lichaamssleuf voor te bereiden, snijdt u een stuk brede tape van ongeveer twee centimeter in twee stukken en snijdt u 1,5 millimeter brede plakjes. Knip vervolgens een 0,3 millimeter diepe schouder- en lichaamssleuf uit en zorg ervoor dat de tape in de houder past. Om een vlieg in de houder te bevestigen, plaatst u eerst een ondiepe container met ijs onder de ontleedmicroscoop en plaatst u de houder ondersteboven op een stuk laboratoriumweefsel dat over het ijs is geplaatst.

Aspireer een één tot vier dagen oude vrouwelijke fruitvlieg van zijn verachtelijke, en blaas de vlieg op ongesmolten ijs. Wanneer de vlieg stopt met bewegen, gebruikt u de Dell-tang om de vlieg aan de basis van de vleugels vast te pakken en schuift u de vlieg in de houder met de nek in de sleuf. De ogen moeten aan weerszijden van de sleuf gelijkmatig worden geplaatst.

Voeg indien nodig een microliter vet toe aan de bovenkant van het hoofd om te voorkomen dat de lijm de achterkant van het hoofd bereikt. Bedek vervolgens het lichaam met een tissue en wat ijs om ervoor te zorgen dat de vlieg niet beweegt. Om het hoofd vast te stellen, plaatst u het in een hoek van ongeveer 20 graden vanuit een volledig posterieure weergave.

En gebruik een opgerold weefsel om UV-lijm rond het hoofd aan te brengen terwijl u vermijdt het sensorische interessegebied te bevuilen. Gebruik voor smaakexperimenten een tang om de proboscis eruit te trekken en lijm toe te voegen aan de slurfbasis om beweging te voorkomen. Als er geen smaakexperiment is gepland, duwt u de proboscis in het hoofd.

Hard de lijm vijf seconden uit met UV-licht en gebruik een opgerold weefsel om de gebieden rond het hoofd zorgvuldig schoon te maken, om eventuele resterende vloeibare lijm te verwijderen die aan de poten en deuren kan blijven plakken, sensorische gebieden. Gebruik vervolgens een dunne strook tape of een tissue om de benen zo nodig naar voren te bewegen. Om het lichaam te positioneren, verwijdert u het ijsreservoir en draait u de houder om.

Verwijder het water rond de vlieg en handel snel voordat de vlieg herstelt van de anesthesie plaats de body slot tape over het gat en duw voorzichtig het lichaam van de vlieg naar beneden, zorg ervoor dat de nek niet wordt overstrekt. Bedek de resterende grote gaten met tape en voeg ongeveer één microliter vet toe aan de achterkant van het hoofd, om te voorkomen dat lijm op die plaats blijft plakken. Gebruik een opgerold weefsel om UV-lijm rond de thorax en bovenop de tape en thorax te schilderen en hard de lijm ongeveer vijf seconden uit met UV-licht.

Verwijder voorzichtig vet en niet-uitgeharde lijm met een laboratoriumweefsel en voeg ongeveer een milliliter zoutoplossing toe aan de bovenkant van het hoofd. Gebruik de tang om eventuele luchtbellen opzij te duwen en controleer op lekken door een afdekstrip over de zoutoplossing te plaatsen en de houder om te draaien om te controleren op zoutoplossing aan de voorkant. Als zoutoplossing wordt waargenomen, verwijdert u de zoutoplossing en bevestigt u het gat met meer lijm of meer vet.

Om het hoofd te ontleden selecteert u de hoogste vergroting en gebruikt u geslepen zeer fijne tangen om twee sneden te maken aan de basis van de centrale donkere nagelriemdriehoek aan elke kant van de nek. Snijd rond de donkere driehoek en verwijder dit deel van de nagelriem. Spier 16 en de slokdarm moeten zichtbaar zijn door dit gat en ritmisch bewegen.

Gebruik de zeer fijne tang om voorzichtig de bovenkant van dit gebied te knijpen om spier 16 te doorsnijden zonder de slokdarm te doorboren. Als de ritmische beweging stopt, is de spier 16 waarschijnlijk verwijderd. Wanneer de spier is verwijderd vanaf de mediale rand van het donkere driehoeksgebied, gebruik dan de tang als een schaar om de resterende nagelriem voorzichtig in kleine stukjes te knippen en te verwijderen.

Gebruik vervolgens de tang om te grijpen en langzaam en gestaag één luchtzak tegelijk weg te trekken. In deze video werd een calciumsonde uitgedrukt in alle neuronen van deze twee fruitvlieghersenen. En een rookwolk werd gepresenteerd.

In dit experiment was de expressie van calciumsensoren beperkt tot dopaminerge en serotonerge neuronen. Let op de nauwe correlatie tussen de sterke synchrone activiteit over de hersenen en het loopgedrag van de vliegen dat illustreert hoe de hele hersenen kunnen worden waargenomen tijdens een specifiek gedrag. Met behulp van principecomponentanalyse en onafhankelijke componentanalyse kunnen verschillende functionele gebieden worden geëxtraheerd die in verschillende kleuren zijn gemarkeerd.

Met de vorm en lokalisatie van de functionele regio's kunnen de regio's worden toegewezen aan anatomische sjablonen. Om hersengebieden en in sommige gevallen neurontypen te identificeren. Eenmaal uitgelijnd op de juiste anatomische sjabloon fluorescentiewaarden kunnen worden gemiddeld binnen specifieke anatomische hersengebieden voor kwantitatieve analyse.

In deze analyse kunnen we bijvoorbeeld vaststellen dat alle regio's actiever zijn tijdens het wandelen dan tijdens het verzorgen. Wees geduldig. Het leren van deze hartdissectie techniek is moeilijk.

In mijn lab hebben mensen gemiddeld drie tot vier maanden nodig voordat ze het onder de knie krijgen en hun eerste nuttige voorbereidingen krijgen. Volgens dit protocol kunnen we grootschalige hersenactiviteit registreren met behulp van een fluorescentiemicroscoop. Snelle methoden zoals lichtveldmicroscopie zijn bijzonder geïndiceerd.