Name: label-free quantitative proteomics workflow for discovery-driven host-pathogen interactions
Uploaded: 2020-10-20T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Label-Free Quantitative Proteomics Workflow for Discovery-Driven Host-Pathogen Interactions at JoVE.com

يشكر المؤلفون الدكتور جوناثان كريغر من شركة حلول المعلوماتية الحيوية لتشغيله مطياف الكتلة للتجارب التمثيلية ، وكذلك أعضاء مجموعة Geddes-McAlister لمساعدتهم في الإعداد التجريبي والتغذية المرتدة للمخطوطة. يعترف المؤلفون بالدعم التمويلي، جزئياً، من مؤسسة بانتينغ للبحوث – جائزة اكتشاف الزمالة Jarislowsky, صندوق أبحاث الحدود الجديدة – استكشاف (NFRFE-2019-00425)، والمؤسسة الكندية للابتكار (JELF 38798) لJ.G.M.، فضلا عن منحة الدراسات العليا NSERC كندا – منحة الماجستير والدراسات العليا أونتاريو لB.B., والملكة إليزابيث الثانية منحة الدراسات العليا في العلوم والتكنولوجيا ل.S.S..

تم استخدام خط خليد من الضامة المستمدة من الفئران BALB / ج للبروتوكول التالي وافق عليها جامعة غيلف استخدام الحيوان بروتوكول 4193. وتجدر الإشارة إلى أنه يمكن تطبيق سلالات أخرى من الفئران أو مصادر أخرى من الخلايا الخالدة على البروتوكول المبين مع اختبار كاف لتحسين المعلمات التفصيلية. سوف ينتقل ال...

<ol>
	<li>Bongomin, F., Gago, S., Oladele, R., Denning, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+and+Multi-National+Prevalence+of+Fungal+Diseases-Estimate+Precision.">Global and Multi-National Prevalence of Fungal Diseases-Estimate Precision.</a> Journal of Fungi. , (2017).</li><li>Tugume, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-Associated+cryptococcal+meningitis+occurring+at+relatively+higher+CD4+counts.">HIV-Associated cryptococcal meningitis occurring at relatively higher CD4 counts.</a> Journal of Infectious Diseases. 219 (6), 877-883 (2019).</li><li>Rajasingham, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+burden+of+disease+of+HIV-associated+cryptococcal+meningitis:+an+updated+analysis.">Global burden of disease of HIV-associated cryptococcal meningitis: an updated analysis.</a> The Lancet Infectious Diseases. , (2017).</li><li>Perfect, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+antifungal+pipeline:+A+reality+check.">The antifungal pipeline: A reality check.</a> Nature Reviews Drug Discovery. , (2017).</li><li>Bermas, A., Geddes-McAlister, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combatting+the+evolution+of+anti-fungal+resistance+in+Cryptococcus+neoformans.">Combatting the evolution of anti-fungal resistance in Cryptococcus neoformans.</a> Molecular Microbiology. , 1-14 (2020).</li><li>Geddes-McAlister, J., Shapiro, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+pathogens,+new+tricks:+Emerging,+drug-resistant+fungal+pathogens+and+future+prospects+for+antifungal+therapeutics.">New pathogens, new tricks: Emerging, drug-resistant fungal pathogens and future prospects for antifungal therapeutics.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. , (2018).</li><li>Ball, B., Bermas, A., Carruthers-Lay, D., Geddes-McAlister, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+Spectrometry-Based+Proteomics+of+Fungal+Pathogenesis,+Host-Fungal+Interactions,+and+Antifungal+Development.">Mass Spectrometry-Based Proteomics of Fungal Pathogenesis, Host-Fungal Interactions, and Antifungal Development.</a> Journal of Fungi. , (2019).</li><li>Sukumaran, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decoding+communication+patterns+of+the+innate+immune+system+by+quantitative+proteomics.">Decoding communication patterns of the innate immune system by quantitative proteomics.</a> J Leukocyte Biol. , (2019).</li><li>Salas, D., Stacey, R. G., Akinlaja, M., Foster, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+interactomics:+Considerations+for+the+use+of+co-elution+to+measure+protein+interaction+networks.">Next-generation interactomics: Considerations for the use of co-elution to measure protein interaction networks.</a> Molecular and Cellular Proteomics. , (2020).</li><li>Aebersold, R., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass-spectrometric+exploration+of+proteome+structure+and+function.">Mass-spectrometric exploration of proteome structure and function.</a> Nature. 537 (7620), 347-355 (2016).</li><li>Mann, M., Kulak, N. A., Nagaraj, N., Cox, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Coming+Age+of+Complete,+Accurate,+and+Ubiquitous+Proteomes.">The Coming Age of Complete, Accurate, and Ubiquitous Proteomes.</a> Molecular Cell. 49 (4), 583-590 (2013).</li><li>Cox, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+Proteome-wide+Label-free+Quantification+by+Delayed+Normalization+and+Maximal+Peptide+Ratio+Extraction,+Termed+MaxLFQ.">Accurate Proteome-wide Label-free Quantification by Delayed Normalization and Maximal Peptide Ratio Extraction, Termed MaxLFQ.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 13 (9), 2513-2526 (2014).</li><li>Ankney, J. A., Muneer, A., Chen, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relative+and+Absolute+Quantitation+in+Mass+Spectrometry-Based+Proteomics.">Relative and Absolute Quantitation in Mass Spectrometry-Based Proteomics.</a> Annual Review of Analytical Chemistry. , (2018).</li><li>Cox, J., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MaxQuant+enables+high+peptide+identification+rates,+individualized+p.p.b.-range+mass+accuracies+and+proteome-wide+protein+quantification.">MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification.</a> Nature Biotechnology. 26 (12), 1367-1372 (2008).</li><li>Tyanova, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Perseus+computational+platform+for+comprehensive+analysis+of+(prote)omics+data.">The Perseus computational platform for comprehensive analysis of (prote)omics data.</a> Nature Methods. 13 (9), 731-740 (2016).</li><li>Cox, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Andromeda:+A+peptide+search+engine+integrated+into+the+MaxQuant+environment.">Andromeda: A peptide search engine integrated into the MaxQuant environment.</a> Journal of Proteome Research. , (2011).</li><li>Zhong, Z., Pirofski, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opsonization+of+Cryptococcus+neoformans+by+human+anticryptococcal+glucuronoxylomannan+antibodies.">Opsonization of Cryptococcus neoformans by human anticryptococcal glucuronoxylomannan antibodies.</a> Infection and Immunity. , (1996).</li><li>Nicola, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+autophagy+in+immunity+to+Cryptococcus+neoformans+and+Candida+albicans.">Macrophage autophagy in immunity to Cryptococcus neoformans and Candida albicans.</a> Infection and Immunity. , (2012).</li><li>Ball, B., Geddes-McAlister, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Proteomic+Profiling+of+Cryptococcus+neoformans.">Quantitative Proteomic Profiling of Cryptococcus neoformans.</a> Current Protocols in Microbiology. , (2019).</li><li>Geddes-McAlister, J., Gadjeva, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectromerty-based+quantitative+proteomics+of+murine-derived+polymorphonuclear+neutrophils.">Mass spectromerty-based quantitative proteomics of murine-derived polymorphonuclear neutrophils.</a> Current Protocols in Immunology. , (2019).</li><li>Geddes, J. M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secretome+profiling+of+Cryptococcus+neoformans+reveals+regulation+of+a+subset+of+virulence-associated+proteins+and+potential+biomarkers+by+protein+kinase+A.">Secretome profiling of Cryptococcus neoformans reveals regulation of a subset of virulence-associated proteins and potential biomarkers by protein kinase A.</a> BMC Microbiology. , (2015).</li><li>Geddes, J. M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+protein+kinase+a-regulated+proteome+of+Cryptococcus+neoformans+identifies+a+role+for+the+ubiquitin-proteasome+pathway+in+capsule+formation.">Analysis of the protein kinase a-regulated proteome of Cryptococcus neoformans identifies a role for the ubiquitin-proteasome pathway in capsule formation.</a> mBio. 7 (1), 1-15 (2016).</li><li>Al Shweiki, M. H. D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+Label-Free+Quantification+in+Discovery+Proteomics+and+Impact+of+Technological+Factors+and+Natural+Variability+of+Protein+Abundance.">Assessment of Label-Free Quantification in Discovery Proteomics and Impact of Technological Factors and Natural Variability of Protein Abundance.</a> Journal of Proteome Research. , (2017).</li><li>Ong, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+Isotope+Labeling+by+Amino+Acids+in+Cell+Culture,+SILAC,+as+a+Simple+and+Accurate+Approach+to+Expression+Proteomics.">Stable Isotope Labeling by Amino Acids in Cell Culture, SILAC, as a Simple and Accurate Approach to Expression Proteomics.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 1 (5), 376-386 (2002).</li><li>Thompson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tandem+mass+tags:+A+novel+quantification+strategy+for+comparative+analysis+of+complex+protein+mixtures+by+MS/MS.">Tandem mass tags: A novel quantification strategy for comparative analysis of complex protein mixtures by MS/MS.</a> Analytical Chemistry. 75 (8), 1895-1904 (2003).</li><li>Borner, G. H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organellar+Maps+Through+Proteomic+Profiling+-+A+Conceptual+Guide.">Organellar Maps Through Proteomic Profiling - A Conceptual Guide.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. , (2020).</li><li>Gingras, A. C., Abe, K. T., Raught, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+to+know+the+neighborhood:+using+proximity-dependent+biotinylation+to+characterize+protein+complexes+and+map+organelles.">Getting to know the neighborhood: using proximity-dependent biotinylation to characterize protein complexes and map organelles.</a> Current Opinion in Chemical Biology. , (2019).</li><li>Kugadas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frontline+Science:+Employing+enzymatic+treatment+options+for+management+of+ocular+biofilm-based+infections.">Frontline Science: Employing enzymatic treatment options for management of ocular biofilm-based infections.</a> Journal of Leukocyte Biology. , (2019).</li><li>Yeung, J., Gadjeva, M., Geddes-McAlister, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-Free+Quantitative+Proteomics+Distinguishes+General+and+Site-Specific+Host+Responses+to+Pseudomonas+aeruginosa+Infection+at+the+Ocular+Surface.">Label-Free Quantitative Proteomics Distinguishes General and Site-Specific Host Responses to Pseudomonas aeruginosa Infection at the Ocular Surface.</a> Proteomics. , (2020).</li><li>Yeung, J., Lamb, J., Krieger, J. R., Gadjeva, M., Geddes-McAlister, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Proteomic+Profiling+ofMurine+Ocular+Tissue+and+theExtracellular+Environment.">Quantitative Proteomic Profiling ofMurine Ocular Tissue and theExtracellular Environment.</a> Current Protocols in Mouse Biology. 10 (83), (2020).</li></ol>

وتشمل الخطوات الحاسمة في البروتوكول إعداد خلايا الضامة وجمع عينات من الثقافة المشتركة لمعالجة البروتين مع الحد الأدنى من التعطيل للخلايا. من المهم تنفيذ خطوات الغسيل والتطعيم وإزالة خلايا الضامة المتمسكة بلطف وعناية لمنع تحلل الخلايا غير الضرورية قبل جمعها. إنشاء وزارة الداخلية الصحيح ...

انتشار الالتهابات الفطرية الغازية في تزايد كبير ويرتبط مع معدلات الوفيات العالية غير المقبولة، والأكثر شيوعا ذكرت في الأفراد الذين لديهم استعداد المناعي1. Cryptococcus النيوفورمات هو الممرض الفطري الانتهازية سيئة السمعة قادرة على البقاء على قيد الحياة داخل الخلايا داخل خلايا الضامة المضيفة. عدم كفاية نتائج التدخل المضاد للفطريات في نشر الفطريات ومظاهر تهدد الحياة من التهاب السحايا cryptococcal والتهاب السحايا2,3. وقد طالبت الزيادة العالمية في حالة المناعة زيادة موازية في استخدام العوامل المضادة للفطريات، التي العديد من الأنواع الفطرية، بما في ذلك C. النيوفورم، تطورت مقاومة متزايدة نحو4،5،6. ولذلك، لا بد من تنفيذ تكنولوجيات قوية وفعالة للإجابة على الأسئلة البيولوجية الحيوية المتعلقة باستجابة الدفاع المضيف والتنمّر الميكروبي.
العصر الجديد للتقدم التكنولوجي في القياس الطيفي الشامل (MS)، بما في ذلك توليد خطوط الأنابيب الحاسوبية الحيوية القوية، يوفر الأساس لرؤية تكاملية للتحليل على نطاق واسع من البحوث المضيفة المسببة للأمراض7،8. تحليل البروتيومي التقليدي الذي يحركه التسبب في التسبب في البروتيوم عادة ما يُحْسَر وجهة نظر العدوى من منظور المضيف أو الممرض، بما في ذلك منهجيات شاملة مثل التنميط الارتباط البروتيني، واللون اللوني المتقارب مع البروتيوميات،والتفاعلات 9. التحقيقات في ضراوة مسببات الأمراض الخطرة في نظام المضيف هي ذات أهمية سريرية هائلة; ومع ذلك، كان تطبيق تحليل منظور مزدوج في تجربة واحدة يعتبر سابقاً غير قابل للتحقيق. على سبيل المثال، غالباً ما تطغى على منظور الممرض نحو العدوى من قبل البروتينات المضيفة الوفيرة مما يؤدي إلى انخفاض الحساسية للكشف عن البروتينات الفطرية منخفضة وفيرة7. وعلاوة على ذلك، فإن تعقيد العينة العالية يدعو العديد من الأهداف للتحقيق في نظام تجريبي واحد وتثبت صعوبة في توضيح آليات العمل لبروتين مسبب للأمراض محددة.
البروتيوميات من أسفل إلى أعلى هو تقنية مرض التصلب العصبي المتعدد شعبية التي تمكن من إعداد العينة يمكن التحكم فيها، والتي يتم توليد الببتيدات عن طريق الهضم الأنزيمي تسلسل محددة تليها فصل الكروماتوغرافيا السائلة، وتحديد، والكمية من قبل MS10،11. هنا، نقدم طريقة توضح استراتيجية الاستحواذ المعتمدة على البيانات بهدف تحقيق تغطية غير متحيزة للبروتيوم القائم على العدوى أو "العدوى". على وجه التحديد، الكم خالية من التسمية (LFQ) يلقي الاعتماد على التسميات الكيميائية أو الأيضية لتحديد قوية ودقيقة للتغيرات مستوى البروتين عبر البروتينات المتعددة، والحد من معالجة العينات ومعالجة الخطوات12،13. هذا التطبيق العالمي يستجوب البروتينات المنتجة في لحظة معينة داخل خلية مستقلة عن أي إنتاج البروتين المتوقع؛ وهكذا، يمكن اكتشاف رؤى جديدة التي تعتبر حاسمة للعدوى.
تم تحسين سير العمل الموضح هنا لاستكشاف التغيرات في مستوى البروتين من C. neoformans خلال حالات محاكاة العدوى مع الخلايا المناعية المضيفة (الشكل 1). وبدلاً من الاعتماد على عزل وفصل أنواع الخلايا، يستخرج هذا النهج البروتيم المضيف والمسبب للمرض معاً، ويستخدم الفصل المعلوماتي الحيوي باستخدام قاعدتي بيانات خاصتين بالكائنات الحية لتمييز إنتاج البروتينات الخاصة بالأنواع. وتوفر هذه الطريقة مزايا لعدد غير محدود من العينات التي يتعين معالجتها دون اتخاذ خطوات إعداد إضافية مكلفة ضرورية في دراسات وضع العلامات القائمة على النظائر أو الكسر. وعلاوة على ذلك، يدعم هذا العمل بروتوكولات استخراج البروتين المحسنة القابلة للنقل إلى مجموعة واسعة من مسببات الأمراض الفطرية والبكتيرية القادرة على استهداف الخلايا المناعية المضيفة وتصيبها. وعموما، يحدد هذا البروتوكول الخطوات اللازمة لاستكمال استخراج البروتين غير متحيزة ومعالجة العينة ل MS عالية الدقة، تليها البيانات والتحليل الإحصائي، قادرة على توفير ثروة من المعرفة من البروتينات الفطرية الهامة للعدوى جنبا إلى جنب مع التنميط الشامل للاستجابة الدفاع المضيف.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 mM Tris-HCl, pH 8.5</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP152-1</td>
			<td>Maintain at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 x 15 mm Dish, Nunclon Delta</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>174888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well cell culture plate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>140675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile, MS grade</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>TS-51101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>1099510001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>34850-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium bicarbonate (ABC)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A643-500</td>
			<td>Prepare a stock 50 mM ABC solution, stable at room temperature for up to one month.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bel-Art&#8482; HiFlow Vacuum Aspirator Collection System</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-717-300</td>
			<td>Not essential, serological pipettes can be used to remove media.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C18 resin</td>
			<td>3M Empore</td>
			<td>3M2215</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Scrapers</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10062-906</td>
			<td>Not essential, other methods to release macrophage cells can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifugal vaccuum concentrator</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>07-748-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete Filtration Unit</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10040-436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical falcon tubes (15 mL)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-539-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess II Automated Cell Counter</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AMQAX1000</td>
			<td>Not essential, haemocytometer can be used as an alternative.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CytoTox 96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G1780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>R0861</td>
			<td>Prepare bulk stock solution of 1 M DTT, flash frozen and stored at -20 &#176;C until use. Discard after each use (do not freeze-thaw repeatedly).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10566016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12483020</td>
			<td>Heat inactivate by incubating at 60&#176;C for 30 minutes. Prepare 50 ml aliquots and flash freeze. Thaw prior to media preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Haemocytometer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>15170-208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td>Prepare 40 mM HEPES/8 M Urea in bulk stock solution, flash frozen, store at -20&#176;C until use. Discard after each use (do not freeze-thaw repeatedly).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-performance liquid chromatography system</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>LC140</td>
			<td>Gradient length is based on sample complexity, recommended 120 min gradient for infectome samples.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-resolution mass spectrometer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>726042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetamide (IAA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>I6125</td>
			<td>Prepare 0.55 M bulk stock solution, flash frozen, store at -20&#176;C until use. Discard after each use (do not freeze-thaw repeatedly).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>25030081</td>
			<td>Can be aliquot and frozen for storage. Thaw prior to media preparation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LoBind Microcentrifuge tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>13-698-794</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MaxQuant</td>
			<td>https://maxquant.org/</td>
			<td></td>
			<td>MaxQuant is a public platform that offers tutorials, such as the MaxQuant Summer School, outlining the computational analysis steps of large MS data sets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>13864457</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin : Streptomycin 10k/10k</td>
			<td>VWR</td>
			<td>CA12001-692</td>
			<td>Can be aliquot and frozen for storage. Thaw prior to media preparation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptide separation columns</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>ES803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perseus Software</td>
			<td>http://maxquant.net/perseus/</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>VWR</td>
			<td>CA12001-676</td>
			<td>Puchase not required. PBS can also be prepared but sterile filteration must be performed before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>&#160;23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette, Disposable Serological (10 mL)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-11E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette, Disposable Serological (25 mL) Basix</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14955235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Probe sonciator</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>100-132-894</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail tablet</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4693159001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>28364</td>
			<td>20% (w/v)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer (Nanodrop)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>ND-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STAGE tipping centrifuge</td>
			<td>Sonation</td>
			<td>STC-V2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal Shaker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>NO89232-908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic acid</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>85183</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin/Lys-C protease mix, MS grade</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>A40007</td>
			<td>Maintain at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic bath</td>
			<td>Bransonic</td>
			<td>A89375-450</td>
			<td>Stored in cold room (4C)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>U1250-1KG</td>
			<td>Prepare 40 mM HEPES/8 M Urea in bulk stock solution, flash frozen, store at -20 &#176;C until use. Discard after each use (do not freeze-thaw repeatedly).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast-extract peptone dextrose broth</td>
			<td>BD Difco</td>
			<td>BM20</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

label-free quantitative proteomics workflow for discovery-driven host-pathogen interactions

إن الإنجازات التكنولوجية لقياس الطيف الكتلي (MS) التي تعتمد على البروتيوم الكمي تفتح العديد من الطرق غير المكتشفة لتحليل البروتيوم العالمي للكائن الحي في ظل ظروف مختلفة. هذه الاستراتيجية القوية المطبقة على تفاعلات مسببات الأمراض الميكروبية مع المضيف المطلوب يميز بشكل شامل كلا المنظورين نحو العدوى. هنا، سير العمل يصف الكم خالية من التسمية (LFQ) من infectome من Cryptococcus الأشكال الجديدة، وهو مسبب أمراض داخل الخلايا الكلي الفطرية التي هي العامل المسبب ل cryptococcosis المرض القاتل، في وجود خلايا الضامة خلد. ويفصّل البروتوكول تقنيات إعداد البروتين المناسبة لكل من الخلايا المسببة للأمراض والثدييات في إطار تجربة واحدة، مما يؤدي إلى تقديم الببتيد المناسب لتحليل الكروماتوغرافيا السائلة (LC)-MS/MS. تسمح الطبيعة العامة العالية لـ LFQ بنطاق ديناميكي واسع من تحديد البروتين وتحديد كميته ، بالإضافة إلى قابلية النقل إلى أي إعداد للعدوى المضيفة - الممرض ، مع الحفاظ على حساسية شديدة. تم تحسين هذه الطريقة لفهرسة واسعة، غير متحيزة ملامح وفرة البروتين من الممرض داخل ظروف محاكاة العدوى. وعلى وجه التحديد، فإن الطريقة التي تم إظهارها هنا توفر معلومات أساسية عن التسبب في الأورام الجديدة، مثل إنتاج البروتين اللازم للوعاء وتحدد البروتينات المضيفة الحرجة التي تستجيب للغزو الميكروبي.

البروتوكول المبين أعلاه يتيح تحديد وكمية البروتينات المستمدة من كل من الممرض الفطري، C. neoformans،والمضيف، خلايا الضامة، في تجربة واحدة. وبعد الاستزراع المشترك، يتم جمع الخلايا ومعالجتها معًا وفصلها بيولوجيًا على أساس ملامح الببتيد الخاصة بكل نوع. هذا هو نهج قوي لتحديد التفاعل بين العل?...

Watch this Scientific Journal Video about Label-Free Quantitative Proteomics Workflow for Discovery-Driven Host-Pathogen Interactions at JoVE.com

Label-Free Quantitative Proteomics Workflow for Discovery-Driven Host-Pathogen Interactions

هنا، نقدم بروتوكولاً لتقديم لمحة عن التفاعل بين المضيف والممرض أثناء الإصابة بالبروتيوميات المستندة إلى الطيف الكتلي. يستخدم هذا البروتوكول تحديد كمي خال من التسمية لقياس التغيرات في وفرة البروتين لكل من المضيف (على سبيل المثال، الضامة) والعوامل الممرضة (مثل Cryptococcus neoformans)في تجربة واحدة.

خالية من التسمية تدفق عمل البروتوميات الكمية للتفاعلات المُضيفة-الممرضة مدفوعة بالإكتشاف

The technological achievements of mass spectrometry (MS)-based quantitative proteomics opens many undiscovered avenues for analyzing an organism&#8217;s ...

Our protocol investigates fungal infection from both the host and pathogen perspectives to identify interactions between the biological systems that are critical for a disease. We can detect both fungal and host proteins in a single experiment and identify fungal proteins only produced during infection, representing novel infection-associated proteins. Although we focus on treating fungal infections by uncovering novel anti-virulent strategies for treatment, our proteomics and bioinformatics pipeline is universal and could be applied to many biological systems.Our approach lays the foundation for studies of different pathogens and numerous immune responses and can be used to provide new insights into the relationship between cryptococcus and the innate immune system. The macrophage response to pathogens and detecting enough fungal proteins are important. Therefore testing and optimizing MOIs and time points for each species are recommended.As macrophage and fungal cell culture can be challenging, knowing what to expect after coculture is important. Visualization provides the researcher with confidence in implementing the procedure. To prepare fungal cells for a macrophage infection, collect and centrifuge C neoformans cells from a mid long phase culture, followed by three gentle washes with one milliliter of room temperature PBS under the same centrifuge conditions.After the last wash, resuspend the fungal cells at a 1.2 times 10 to the eighth cells per milliliter of antibiotic free cell culture, medium concentration and add one milliliter of fungal cell suspension to each of four wells of a 70%to 80%confluent six well macrophage culture plate. Then, place the plate in the cell culture incubator for three hours. Carefully tilt the plate to allow each well to be gently washed three times with one milliliter of PBS per well per wash.To measure the infection proficiency after the last wash, add one milliliter of antibiotic free medium to each well of the six well plate, and place the plate in the cell culture incubator. At the appropriate experimental time points, collect the supernatant from each well and measure the amount of LDH in each well according to standard protocols. At the same time points, lyse the uninfected macrophage cells to determine the value for maximum cytotoxicity.The cytotoxicity can then be calculated using the formula as indicated. For uninfected macrophage collection and co-culture, add one milliliter of cold PBS to each well of uninfected macrophages. After one minute, gently tap the plate to detach the cells from the bottoms of the wells and pool the cell suspensions into a single 15 milliliter tube.Collect the cells by centrifugation and completely remove the supernatant to allow immediate flash freezing of the pellet in liquid nitrogen for minus 80 degree storage. Principal component analysis of the process to datasets reveals that, as expected, the largest component of separation among the data is infected versus non-infected samples. The second distinguishing feature of the samples is their biological variability.Combining a Pearson correlation with hierarchical clustering by Euclidean distance shows a distinct clustering of infected versus non-infected samples with a replicate reproducibility ranging from 95%to 96%Students'T test corrected for multiple hypothesis testing using a Benjamini-Hochberg False Discovery Rate can be performed to identify proteins with significant differences in abundance during infection compared to non-infected controls. In this analysis, 117 host proteins demonstrating a significant change in expression upon infection were identified. Notably, significant increases in the abundance of fungal proteins, as expected during infection, were also observed.It is important to handle the macrophages gently during coculturing, washing, and sample collection. By defining how the pathogen adapts to the host and how the host defends itself from infection, new insights are acquired into the fields of microbiology and immunology.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Use of an Optical Trap for Study of Host-Pathogen Interactions for Dynamic Live Cell Imaging

استخدام اعتراض البصرية لدراسة التفاعلات المرضي المضيف الحيوي للخلية الحية التصوير

Dynamic live cell imaging allows direct visualization of real-time interactions between cells of the immune system1, 2; however, the lack of spatial and ...

Use of the EpiAirway Model for Characterizing Long-term Host-pathogen Interactions

استخدام نموذج لوصف EpiAirway طويل الأجل المضيف الممرض التفاعلات

Nontypeable Haemophilus influenzae  (NTHi) are human-adapted Gram-negative bacteria that can cause recurrent and chronic infections of the respiratory ...

A Comparative Approach to Characterize the Landscape of Host-Pathogen Protein-Protein Interactions

A المنهج المقارن لتوصيف المشهد من المضيف الممرض البروتين البروتين التفاعلات

Significant efforts were gathered to generate  large-scale comprehensive protein-protein interaction network maps. This is  instrumental to understand the ...

Detection of Human Leukocyte Antigen Biomarkers in Breast Cancer Utilizing Label-free Biosensor Technology

الكشف عن خلايا الدم البيضاء الإنسان مستضد المؤشرات الحيوية في سرطان الثدي الاستفادة تسمية خالية جهاز الاستشعار البيولوجي تقنية

According to the American Cancer Society, more than 200,000 women will be diagnosed with invasive breast cancer each year and approximately 40,000 will ...

Electroporation of Functional Bacterial Effectors into Mammalian Cells

Electroporation للمن المستجيبات البكتيرية وظيفية في خلايا الثدييات

The study of protein interactions in the context of living cells can generate critical information about localization, dynamics, and interacting partners. ...

Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy

تقييم فعالية وسمية الرنا استهداف HIV-1 الإنتاج للاستخدام في الجينات أو العلاج بالعقاقير

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential ...

A New Method for Qualitative Multi-scale Analysis of Bacterial Biofilms on Filamentous Fungal Colonies Using Confocal and Electron Microscopy

طريقة جديدة لتحليل نوعي متعدد حجم البكتيرية الأغشية الحيوية على شعيري الفطرية المستعمرات عن طريق متحد البؤر والمجهر الإلكتروني

Bacterial biofilms frequently form on fungal surfaces and can be involved in numerous bacterial-fungal interaction processes, such as metabolic ...

Ex Vivo Infection of Human Lymphoid Tissue and Female Genital Mucosa with Human Immunodeficiency Virus 1 and Histoculture

Ex Vivo Infection of Human Lymphoid Tissue and Female Genital Mucosa with Human Immunodeficiency Virus 1 and Histoculture

السابقين فيفو التهاب الغشاء المخاطي للأعضاء التناسلية أنثى والأنسجة اللمفاوية البشرية مع فيروس نقص المناعة البشرية 1 وهيستوكولتوري

Histocultures allow studying intercellular interactions within human tissues, and they can be employed to model host-pathogen interactions under ...

Label-free Neutrophil Enrichment from Patient-derived Airway Secretion Using Closed-loop Inertial Microfluidics

تخصيب خالية من تسمية العَدلات من إفراز مجرى الهواء المستمدة من المريض استخدام حلقة مغلقة ميكروفلويديكس القصور الذاتي

Airway secretions contain a large number of immune-related cells, e.g., neutrophils, macrophages, and lymphocytes, which can be used as a major resource ...

Label-Free Identification of Lymphocyte Subtypes Using Three-Dimensional Quantitative Phase Imaging and Machine Learning

تحديد أنواع فرعية اللمفاويات باستخدام التصوير ثلاثي الأبعاد الكمية المرحلة خالية من التسمية وآله التعلم

We describe here a protocol for the label-free identification of lymphocyte subtypes using quantitative phase imaging and machine learning. Identification ...