Name: label-free quantitative proteomics workflow for discovery-driven host-pathogen interactions
Uploaded: 2020-10-20T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Label-Free Quantitative Proteomics Workflow for Discovery-Driven Host-Pathogen Interactions at JoVE.com

Авторы благодарят д-ра Джонатана Кригера (Jonathan Krieger) из Bioinformatics Solutions Inc. за эксплуатацию масс-спектрометра для репрезентативных экспериментов, а также членов группы Геддес-Макалистер за помощь в экспериментальной настройке и обратной связи с рукописями. Авторы признают поддержку финансирования, в частности, от Banting Research Foundation - Jarislowsky стипендий Discovery Award, Научно-исследовательский фонд «Новые границы» (NFRFE-2019-00425) и Канадский фонд инноваций (JELF 38798) для J.G.M., а также стипендия выпускников NSERC Canada – магистры и стипендии для выпускников Онтарио для B.B., а также стипендия королевы Елизаветы II в области науки и техники для A.S.

Увековеченная линия макрофагов, полученных из мышей BALB/c, была использована для следующего протокола, утвержденного Протоколом об использовании животных Университета Гвельфа 4193. Примечательно, что другие штаммы мышей или другие источники увековеченных клеток могут быть применены к и?...

<ol>
	<li>Bongomin, F., Gago, S., Oladele, R., Denning, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+and+Multi-National+Prevalence+of+Fungal+Diseases-Estimate+Precision.">Global and Multi-National Prevalence of Fungal Diseases-Estimate Precision.</a> Journal of Fungi. , (2017).</li><li>Tugume, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-Associated+cryptococcal+meningitis+occurring+at+relatively+higher+CD4+counts.">HIV-Associated cryptococcal meningitis occurring at relatively higher CD4 counts.</a> Journal of Infectious Diseases. 219 (6), 877-883 (2019).</li><li>Rajasingham, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+burden+of+disease+of+HIV-associated+cryptococcal+meningitis:+an+updated+analysis.">Global burden of disease of HIV-associated cryptococcal meningitis: an updated analysis.</a> The Lancet Infectious Diseases. , (2017).</li><li>Perfect, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+antifungal+pipeline:+A+reality+check.">The antifungal pipeline: A reality check.</a> Nature Reviews Drug Discovery. , (2017).</li><li>Bermas, A., Geddes-McAlister, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combatting+the+evolution+of+anti-fungal+resistance+in+Cryptococcus+neoformans.">Combatting the evolution of anti-fungal resistance in Cryptococcus neoformans.</a> Molecular Microbiology. , 1-14 (2020).</li><li>Geddes-McAlister, J., Shapiro, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+pathogens,+new+tricks:+Emerging,+drug-resistant+fungal+pathogens+and+future+prospects+for+antifungal+therapeutics.">New pathogens, new tricks: Emerging, drug-resistant fungal pathogens and future prospects for antifungal therapeutics.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. , (2018).</li><li>Ball, B., Bermas, A., Carruthers-Lay, D., Geddes-McAlister, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+Spectrometry-Based+Proteomics+of+Fungal+Pathogenesis,+Host-Fungal+Interactions,+and+Antifungal+Development.">Mass Spectrometry-Based Proteomics of Fungal Pathogenesis, Host-Fungal Interactions, and Antifungal Development.</a> Journal of Fungi. , (2019).</li><li>Sukumaran, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decoding+communication+patterns+of+the+innate+immune+system+by+quantitative+proteomics.">Decoding communication patterns of the innate immune system by quantitative proteomics.</a> J Leukocyte Biol. , (2019).</li><li>Salas, D., Stacey, R. G., Akinlaja, M., Foster, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+interactomics:+Considerations+for+the+use+of+co-elution+to+measure+protein+interaction+networks.">Next-generation interactomics: Considerations for the use of co-elution to measure protein interaction networks.</a> Molecular and Cellular Proteomics. , (2020).</li><li>Aebersold, R., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass-spectrometric+exploration+of+proteome+structure+and+function.">Mass-spectrometric exploration of proteome structure and function.</a> Nature. 537 (7620), 347-355 (2016).</li><li>Mann, M., Kulak, N. A., Nagaraj, N., Cox, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Coming+Age+of+Complete,+Accurate,+and+Ubiquitous+Proteomes.">The Coming Age of Complete, Accurate, and Ubiquitous Proteomes.</a> Molecular Cell. 49 (4), 583-590 (2013).</li><li>Cox, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+Proteome-wide+Label-free+Quantification+by+Delayed+Normalization+and+Maximal+Peptide+Ratio+Extraction,+Termed+MaxLFQ.">Accurate Proteome-wide Label-free Quantification by Delayed Normalization and Maximal Peptide Ratio Extraction, Termed MaxLFQ.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 13 (9), 2513-2526 (2014).</li><li>Ankney, J. A., Muneer, A., Chen, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relative+and+Absolute+Quantitation+in+Mass+Spectrometry-Based+Proteomics.">Relative and Absolute Quantitation in Mass Spectrometry-Based Proteomics.</a> Annual Review of Analytical Chemistry. , (2018).</li><li>Cox, J., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MaxQuant+enables+high+peptide+identification+rates,+individualized+p.p.b.-range+mass+accuracies+and+proteome-wide+protein+quantification.">MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification.</a> Nature Biotechnology. 26 (12), 1367-1372 (2008).</li><li>Tyanova, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Perseus+computational+platform+for+comprehensive+analysis+of+(prote)omics+data.">The Perseus computational platform for comprehensive analysis of (prote)omics data.</a> Nature Methods. 13 (9), 731-740 (2016).</li><li>Cox, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Andromeda:+A+peptide+search+engine+integrated+into+the+MaxQuant+environment.">Andromeda: A peptide search engine integrated into the MaxQuant environment.</a> Journal of Proteome Research. , (2011).</li><li>Zhong, Z., Pirofski, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opsonization+of+Cryptococcus+neoformans+by+human+anticryptococcal+glucuronoxylomannan+antibodies.">Opsonization of Cryptococcus neoformans by human anticryptococcal glucuronoxylomannan antibodies.</a> Infection and Immunity. , (1996).</li><li>Nicola, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+autophagy+in+immunity+to+Cryptococcus+neoformans+and+Candida+albicans.">Macrophage autophagy in immunity to Cryptococcus neoformans and Candida albicans.</a> Infection and Immunity. , (2012).</li><li>Ball, B., Geddes-McAlister, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Proteomic+Profiling+of+Cryptococcus+neoformans.">Quantitative Proteomic Profiling of Cryptococcus neoformans.</a> Current Protocols in Microbiology. , (2019).</li><li>Geddes-McAlister, J., Gadjeva, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectromerty-based+quantitative+proteomics+of+murine-derived+polymorphonuclear+neutrophils.">Mass spectromerty-based quantitative proteomics of murine-derived polymorphonuclear neutrophils.</a> Current Protocols in Immunology. , (2019).</li><li>Geddes, J. M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secretome+profiling+of+Cryptococcus+neoformans+reveals+regulation+of+a+subset+of+virulence-associated+proteins+and+potential+biomarkers+by+protein+kinase+A.">Secretome profiling of Cryptococcus neoformans reveals regulation of a subset of virulence-associated proteins and potential biomarkers by protein kinase A.</a> BMC Microbiology. , (2015).</li><li>Geddes, J. M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+protein+kinase+a-regulated+proteome+of+Cryptococcus+neoformans+identifies+a+role+for+the+ubiquitin-proteasome+pathway+in+capsule+formation.">Analysis of the protein kinase a-regulated proteome of Cryptococcus neoformans identifies a role for the ubiquitin-proteasome pathway in capsule formation.</a> mBio. 7 (1), 1-15 (2016).</li><li>Al Shweiki, M. H. D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+Label-Free+Quantification+in+Discovery+Proteomics+and+Impact+of+Technological+Factors+and+Natural+Variability+of+Protein+Abundance.">Assessment of Label-Free Quantification in Discovery Proteomics and Impact of Technological Factors and Natural Variability of Protein Abundance.</a> Journal of Proteome Research. , (2017).</li><li>Ong, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+Isotope+Labeling+by+Amino+Acids+in+Cell+Culture,+SILAC,+as+a+Simple+and+Accurate+Approach+to+Expression+Proteomics.">Stable Isotope Labeling by Amino Acids in Cell Culture, SILAC, as a Simple and Accurate Approach to Expression Proteomics.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 1 (5), 376-386 (2002).</li><li>Thompson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tandem+mass+tags:+A+novel+quantification+strategy+for+comparative+analysis+of+complex+protein+mixtures+by+MS/MS.">Tandem mass tags: A novel quantification strategy for comparative analysis of complex protein mixtures by MS/MS.</a> Analytical Chemistry. 75 (8), 1895-1904 (2003).</li><li>Borner, G. H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organellar+Maps+Through+Proteomic+Profiling+-+A+Conceptual+Guide.">Organellar Maps Through Proteomic Profiling - A Conceptual Guide.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. , (2020).</li><li>Gingras, A. C., Abe, K. T., Raught, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+to+know+the+neighborhood:+using+proximity-dependent+biotinylation+to+characterize+protein+complexes+and+map+organelles.">Getting to know the neighborhood: using proximity-dependent biotinylation to characterize protein complexes and map organelles.</a> Current Opinion in Chemical Biology. , (2019).</li><li>Kugadas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frontline+Science:+Employing+enzymatic+treatment+options+for+management+of+ocular+biofilm-based+infections.">Frontline Science: Employing enzymatic treatment options for management of ocular biofilm-based infections.</a> Journal of Leukocyte Biology. , (2019).</li><li>Yeung, J., Gadjeva, M., Geddes-McAlister, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-Free+Quantitative+Proteomics+Distinguishes+General+and+Site-Specific+Host+Responses+to+Pseudomonas+aeruginosa+Infection+at+the+Ocular+Surface.">Label-Free Quantitative Proteomics Distinguishes General and Site-Specific Host Responses to Pseudomonas aeruginosa Infection at the Ocular Surface.</a> Proteomics. , (2020).</li><li>Yeung, J., Lamb, J., Krieger, J. R., Gadjeva, M., Geddes-McAlister, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Proteomic+Profiling+ofMurine+Ocular+Tissue+and+theExtracellular+Environment.">Quantitative Proteomic Profiling ofMurine Ocular Tissue and theExtracellular Environment.</a> Current Protocols in Mouse Biology. 10 (83), (2020).</li></ol>

Критические шаги в протоколе включают подготовку клеток макрофагов и сбор образцов совместной культуры для обработки белка с минимальным нарушением клеток. Важно выполнять шаги мытья, инокулации и удаления клеток макрофагов адепта мягко и тщательно, чтобы предотвратить ненужныйлиз ?...

Распространенность инвазивных грибковых инфекций значительно возрастает и коррелирует с неприемлемо высокими показателями смертности, чаще всего сообщается у людей с иммунодефицитной предрасположенностью1. Криптококковые неоформаны – это пресловутый оппортунистический грибковый патоген, способный к внутриклеточному выживанию в клетках макрофага хозяина. Неадекватное противогрибковое вмешательство приводит к грибковому распространению и опасным для жизни проявлениям криптококкового менингита и менингоэнцефалита2,3. Глобальное повышение иммунокомпромиссного статуса потребовало параллельного увеличения использования противогрибковых препаратов, при котором многие грибковые виды, в том числе C. neoformans, все больше развивалисьсопротивление к 4,5,6. Поэтому крайне важно внедрить надежные и эффективные технологии для ответа на жизненно важные биологические вопросы, касающиеся ответных мер принимающей стороны на оборону и микробного патогенеза.
Новая эра технологического прогресса в масс-спектрометрии (МС), включая генерацию мощных вычислительных и биоинформатических трубопроводов, обеспечивает основу для интегративного видения для масштабного анализа исследованийхост-патогенов 7,8. Обычный патогенез-управляемый протеомный анализ обычно профилирует мнение инфекции с точки зрения хозяина или патогена, включая комплексные методологии, такие как профилирование корреляции белка, хроматография сродства в сочетании с протеомикой, и interactomics9. Исследования вирулентности опасных патогенов в принимающей системе имеют огромное клиническое значение; однако применение двойного перспективного анализа в одном эксперименте ранее считалось недостижимым. Например, точка зрения патогена к инфекции часто перегружены весьма обильные белки хозяина в результате снижения чувствительности для обнаружения низкоо изобилия грибковыхбелков 7. Кроме того, высокая сложность выборки предлагает многим целям исследовать в одной экспериментальной системе и оказывается сложной задачей для выяснения механизмов действия для конкретного патогенного белка.
Протеомика снизу вверх является популярным методом MS, который позволяет управляемой подготовки образца, в котором пептиды генерируются последовательности конкретных энзиматических пищеварения следуют жидкие хроматографии разделения, идентификации и количественной оценки MS10,11. Здесь мы представляем метод, демонстрирующий стратегию приобретения, зависящая от данных, направленную на достижение беспристрастного охвата протеома на основе инфекции или «инфекции». В частности, без этикетки количественной оценки (LF) проливает зависимость от химических или метаболических этикеток для надежной и точной идентификации изменений уровня белка через несколько протеомов, снижение обработки образцови обработки шаги 12,13. Это универсальное применение допрашивает произведенные белки в данный момент в клетке, независимой от ожидаемого производства белка; таким образом, новые идеи могут быть обнаружены, которые имеют решающее значение для инфекции.
Рабочий процесс, описанный в настоящем, оптимизирован для изучения изменений уровня белка C. неоформанов во время инфекционно-мимикряющих состояний с иммунными клетками хозяина(рисунок 1). Вместо того, чтобы полагаться на изоляцию и разделение типов клеток, этот подход извлекает хозяина и патогена протеом вместе, и использует биоинформатическое разделение с использованием двух конкретных организмов баз данных для различения видового производства белка. Этот метод дает преимущества для неограниченного числа образцов, которые будут обработаны без дополнительных дорогостоящих подготовительных шагов, необходимых в изотопных исследованиях маркировки или фракциоции. Кроме того, этот рабочий процесс поддерживает оптимизированные протоколы извлечения белка, переносяные в широкий спектр грибковых и бактериальных патогенов, способных нацеливаться и заражать иммунные клетки хозяина. В целом, в этом протоколе излагаются шаги для завершения беспристрастной извлечения белка и обработки образцов для MS с высоким разрешением, а затем данные и статистический анализ, способный обеспечить богатые знания грибковых белков, важных для инфекции в сочетании с всеобъемлющим профилированием ответной меры защиты хозяина.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 mM Tris-HCl, pH 8.5</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP152-1</td>
			<td>Maintain at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 x 15 mm Dish, Nunclon Delta</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>174888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well cell culture plate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>140675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile, MS grade</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>TS-51101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>1099510001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>34850-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium bicarbonate (ABC)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A643-500</td>
			<td>Prepare a stock 50 mM ABC solution, stable at room temperature for up to one month.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bel-Art&#8482; HiFlow Vacuum Aspirator Collection System</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-717-300</td>
			<td>Not essential, serological pipettes can be used to remove media.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C18 resin</td>
			<td>3M Empore</td>
			<td>3M2215</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Scrapers</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10062-906</td>
			<td>Not essential, other methods to release macrophage cells can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifugal vaccuum concentrator</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>07-748-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete Filtration Unit</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10040-436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical falcon tubes (15 mL)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-539-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess II Automated Cell Counter</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AMQAX1000</td>
			<td>Not essential, haemocytometer can be used as an alternative.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CytoTox 96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G1780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>R0861</td>
			<td>Prepare bulk stock solution of 1 M DTT, flash frozen and stored at -20 &#176;C until use. Discard after each use (do not freeze-thaw repeatedly).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10566016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12483020</td>
			<td>Heat inactivate by incubating at 60&#176;C for 30 minutes. Prepare 50 ml aliquots and flash freeze. Thaw prior to media preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Haemocytometer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>15170-208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td>Prepare 40 mM HEPES/8 M Urea in bulk stock solution, flash frozen, store at -20&#176;C until use. Discard after each use (do not freeze-thaw repeatedly).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-performance liquid chromatography system</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>LC140</td>
			<td>Gradient length is based on sample complexity, recommended 120 min gradient for infectome samples.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-resolution mass spectrometer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>726042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetamide (IAA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>I6125</td>
			<td>Prepare 0.55 M bulk stock solution, flash frozen, store at -20&#176;C until use. Discard after each use (do not freeze-thaw repeatedly).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>25030081</td>
			<td>Can be aliquot and frozen for storage. Thaw prior to media preparation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LoBind Microcentrifuge tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>13-698-794</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MaxQuant</td>
			<td>https://maxquant.org/</td>
			<td></td>
			<td>MaxQuant is a public platform that offers tutorials, such as the MaxQuant Summer School, outlining the computational analysis steps of large MS data sets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>13864457</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin : Streptomycin 10k/10k</td>
			<td>VWR</td>
			<td>CA12001-692</td>
			<td>Can be aliquot and frozen for storage. Thaw prior to media preparation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptide separation columns</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>ES803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perseus Software</td>
			<td>http://maxquant.net/perseus/</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>VWR</td>
			<td>CA12001-676</td>
			<td>Puchase not required. PBS can also be prepared but sterile filteration must be performed before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>&#160;23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette, Disposable Serological (10 mL)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-11E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette, Disposable Serological (25 mL) Basix</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14955235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Probe sonciator</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>100-132-894</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail tablet</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4693159001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>28364</td>
			<td>20% (w/v)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer (Nanodrop)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>ND-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STAGE tipping centrifuge</td>
			<td>Sonation</td>
			<td>STC-V2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal Shaker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>NO89232-908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic acid</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>85183</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin/Lys-C protease mix, MS grade</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>A40007</td>
			<td>Maintain at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic bath</td>
			<td>Bransonic</td>
			<td>A89375-450</td>
			<td>Stored in cold room (4C)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>U1250-1KG</td>
			<td>Prepare 40 mM HEPES/8 M Urea in bulk stock solution, flash frozen, store at -20 &#176;C until use. Discard after each use (do not freeze-thaw repeatedly).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast-extract peptone dextrose broth</td>
			<td>BD Difco</td>
			<td>BM20</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

label-free quantitative proteomics workflow for discovery-driven host-pathogen interactions

Технологические достижения массовой спектрометрии (МС) на основе количественной протеомии открывает много неоткрытых путей для анализа глобального протеома организма в различных условиях. Эта мощная стратегия, применяемая к взаимодействию микробных патогенов с желаемым хозяином, всесторонне характеризует обе точки зрения на инфекцию. В этом документе описывается безымянная количественная оценка (ЛФЗ) инфекции криптококковых неоформанов, грибкового преподавательского внутриклеточного патогена, который является возбудителем смертельной болезни криптококкоза, в присутствии увековеченных клеток макрофага. В протоколе подробно изготовительная методика приготовления белка как для патогенных, так и для клеток млекопитающих в рамках одного эксперимента, что приводит к соответствующему представлению пептида для анализа жидко-хроматографии (LC)-MS/MS. Высокая пропускная способность общего характера ЛФЗ позволяет широкий динамический диапазон идентификации белка и количественной оценки, а также передачи в любой принимающей патогенной инфекции настройки, сохраняя крайнюю чувствительность. Метод оптимизирован для каталогизации обширных, объективных профилей изобилия белка патогена в инфекционно-имитирующих условиях. В частности, метод, продемонстрированные здесь, предоставляет важную информацию о патогенезах C. neoformans, таких как производство белка, необходимого для вирулентности, и определяет критически важные белки-хозяина, реагирующие на микробное вторжение.

Протокол, изложенный выше, позволяет определить и количественно определить белки, полученные как из грибкового патогена, C. неоформанов, и хозяина, макрофаг клеток, в одном эксперименте. После совместной культуры клетки собираются и обрабатываются вместе и биоинформатически разде...

Watch this Scientific Journal Video about Label-Free Quantitative Proteomics Workflow for Discovery-Driven Host-Pathogen Interactions at JoVE.com

Label-Free Quantitative Proteomics Workflow for Discovery-Driven Host-Pathogen Interactions

Здесь мы представляем протокол для профиля взаимодействия между хозяином и патогеном во время инфекции масс-спектрометрии на основе протеомии. В этом протоколе используется количественная оценка без меток для измерения изменений в изобилии белка как хозяина (например, макрофагов), так и патогена (например, неоформанов Cryptococcus)в одном эксперименте.

Без этикетки Количественные Протеомика Рабочий процесс для Discovery-Driven Хост-патоген взаимодействия

The technological achievements of mass spectrometry (MS)-based quantitative proteomics opens many undiscovered avenues for analyzing an organism&#8217;s ...

Our protocol investigates fungal infection from both the host and pathogen perspectives to identify interactions between the biological systems that are critical for a disease. We can detect both fungal and host proteins in a single experiment and identify fungal proteins only produced during infection, representing novel infection-associated proteins. Although we focus on treating fungal infections by uncovering novel anti-virulent strategies for treatment, our proteomics and bioinformatics pipeline is universal and could be applied to many biological systems.Our approach lays the foundation for studies of different pathogens and numerous immune responses and can be used to provide new insights into the relationship between cryptococcus and the innate immune system. The macrophage response to pathogens and detecting enough fungal proteins are important. Therefore testing and optimizing MOIs and time points for each species are recommended.As macrophage and fungal cell culture can be challenging, knowing what to expect after coculture is important. Visualization provides the researcher with confidence in implementing the procedure. To prepare fungal cells for a macrophage infection, collect and centrifuge C neoformans cells from a mid long phase culture, followed by three gentle washes with one milliliter of room temperature PBS under the same centrifuge conditions.After the last wash, resuspend the fungal cells at a 1.2 times 10 to the eighth cells per milliliter of antibiotic free cell culture, medium concentration and add one milliliter of fungal cell suspension to each of four wells of a 70%to 80%confluent six well macrophage culture plate. Then, place the plate in the cell culture incubator for three hours. Carefully tilt the plate to allow each well to be gently washed three times with one milliliter of PBS per well per wash.To measure the infection proficiency after the last wash, add one milliliter of antibiotic free medium to each well of the six well plate, and place the plate in the cell culture incubator. At the appropriate experimental time points, collect the supernatant from each well and measure the amount of LDH in each well according to standard protocols. At the same time points, lyse the uninfected macrophage cells to determine the value for maximum cytotoxicity.The cytotoxicity can then be calculated using the formula as indicated. For uninfected macrophage collection and co-culture, add one milliliter of cold PBS to each well of uninfected macrophages. After one minute, gently tap the plate to detach the cells from the bottoms of the wells and pool the cell suspensions into a single 15 milliliter tube.Collect the cells by centrifugation and completely remove the supernatant to allow immediate flash freezing of the pellet in liquid nitrogen for minus 80 degree storage. Principal component analysis of the process to datasets reveals that, as expected, the largest component of separation among the data is infected versus non-infected samples. The second distinguishing feature of the samples is their biological variability.Combining a Pearson correlation with hierarchical clustering by Euclidean distance shows a distinct clustering of infected versus non-infected samples with a replicate reproducibility ranging from 95%to 96%Students'T test corrected for multiple hypothesis testing using a Benjamini-Hochberg False Discovery Rate can be performed to identify proteins with significant differences in abundance during infection compared to non-infected controls. In this analysis, 117 host proteins demonstrating a significant change in expression upon infection were identified. Notably, significant increases in the abundance of fungal proteins, as expected during infection, were also observed.It is important to handle the macrophages gently during coculturing, washing, and sample collection. By defining how the pathogen adapts to the host and how the host defends itself from infection, new insights are acquired into the fields of microbiology and immunology.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Use of an Optical Trap for Study of Host-Pathogen Interactions for Dynamic Live Cell Imaging

Использование оптической ловушки для изучения хост-Возбудитель Взаимодействие для динамических изображений Живая сотовый

Dynamic live cell imaging allows direct visualization of real-time interactions between cells of the immune system1, 2; however, the lack of spatial and ...

Use of the EpiAirway Model for Characterizing Long-term Host-pathogen Interactions

Использование EpiAirway модель Характеризуя Долгосрочные хост-возбудителя Взаимодействия

Nontypeable Haemophilus influenzae  (NTHi) are human-adapted Gram-negative bacteria that can cause recurrent and chronic infections of the respiratory ...

A Comparative Approach to Characterize the Landscape of Host-Pathogen Protein-Protein Interactions

Сравнительный подход к характеризации Пейзаж хозяин-патоген белок-белковых взаимодействий

Significant efforts were gathered to generate  large-scale comprehensive protein-protein interaction network maps. This is  instrumental to understand the ...

Detection of Human Leukocyte Antigen Biomarkers in Breast Cancer Utilizing Label-free Biosensor Technology

Обнаружение человека антиген лейкоцитов биомаркеров при раке молочной железы Используя без наклеек технологии биосенсоров

According to the American Cancer Society, more than 200,000 women will be diagnosed with invasive breast cancer each year and approximately 40,000 will ...

Electroporation of Functional Bacterial Effectors into Mammalian Cells

Электропорация функциональных бактериальных эффекторов в клетках млекопитающих

The study of protein interactions in the context of living cells can generate critical information about localization, dynamics, and interacting partners. ...

Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy

Оценка эффективности и токсичности РНК Ориентация ВИЧ-1 Производство для использования в генной или терапии наркотиками

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential ...

A New Method for Qualitative Multi-scale Analysis of Bacterial Biofilms on Filamentous Fungal Colonies Using Confocal and Electron Microscopy

Новый метод для качественного многомасштабном анализа Бактериальный биопленок на нитчатых конидий с помощью конфокальной и электронной микроскопии

Bacterial biofilms frequently form on fungal surfaces and can be involved in numerous bacterial-fungal interaction processes, such as metabolic ...

Ex Vivo Infection of Human Lymphoid Tissue and Female Genital Mucosa with Human Immunodeficiency Virus 1 and Histoculture

Ex Vivo Infection of Human Lymphoid Tissue and Female Genital Mucosa with Human Immunodeficiency Virus 1 and Histoculture

Ex Vivo Инфекции половых слизистой лимфоидной ткани человека и женщин с вирусом иммунодефицита человека 1 и Histoculture

Histocultures allow studying intercellular interactions within human tissues, and they can be employed to model host-pathogen interactions under ...

Label-free Neutrophil Enrichment from Patient-derived Airway Secretion Using Closed-loop Inertial Microfluidics

Этикетка бесплатно нейтрофилов обогащения от секрецию дыхательные пути пациента, полученных с помощью замкнутых инерционного микрофлюидика

Airway secretions contain a large number of immune-related cells, e.g., neutrophils, macrophages, and lymphocytes, which can be used as a major resource ...

Label-Free Identification of Lymphocyte Subtypes Using Three-Dimensional Quantitative Phase Imaging and Machine Learning

Этикетка свободной идентификации лимфоцитов подтипы, с использованием трехмерных количественных этап визуализации и машинного обучения

We describe here a protocol for the label-free identification of lymphocyte subtypes using quantitative phase imaging and machine learning. Identification ...