Name: isolation of viable adipocytes and stromal vascular fraction from human visceral adipose tissue suitable for rna analysis and macrophage phenotyping
Uploaded: 2020-10-27T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Viable Adipocytes and Stromal Vascular Fraction from Human Visceral Adipose Tissue Suitable for RNA Analysis and Macrophage Phenotyping at JoVE.c

تم دعم هذه الدراسة من المعهد الوطني للطب البيريناتولوجي (أرقام المنح: 3300-11402-01-575-17 و 212250-3210-21002-06-15) و CONACyT ، الصندوق القطاعي للتحقيق في الصحة والأمن الاجتماعي (FOSISS) (رقم المنحة 2015-3-2-61661).

تمت الموافقة على هذا البروتوكول من قبل IRB التابع للمعهد الوطني للمحيطات (212250-3210-21002-06-15). وكانت المشاركة طوعية، ووقعت جميع النساء المسجلات على استمارة الموافقة المستنيرة.
1. جمع الأنسجة الدهنية الحشوية
<ol><li>الحصول على خزعات ضريبة القيمة المضافة من خلال استئصال الثرب الجزئي أ...

تلعب ضريبة القيمة المضافة دورا مهما في تنظيم التمثيل الغذائي والالتهابات. أدى الاهتمام المتزايد بدور الخلايا الشحمية والخلايا المناعية في الالتهاب المزمن المرتبط بالسمنة إلى تطوير تقنيات مختلفة لفصل SVF والخلايا الدهنية الموجودة في AT. ومع ذلك ، فإن معظم التقنيات لا تسمح بالحصول على هاتين...

لا تتكون الأنسجة الدهنية البيضاء من الخلايا الدهنية أو الخلايا الشحمية فحسب ، بل تتكون أيضا من جزء من الخلايا غير الدهنية يعرف باسم جزء الأوعية الدموية اللحمية (SVF) ، والذي يحتوي على مجموعة خلايا غير متجانسة تتكون من الضامة ، والخلايا المناعية الأخرى كخلايا تائية تنظيمية (Tregs) ، وحمضات ، وخلايا preadipocytes ، وخلايا ليفية ، محاطة بأنسجة وعائية وضامة 1,2. تعتبر الأنسجة الدهنية (AT) الآن عضوا ينظم العمليات الفسيولوجية المتعلقة بالتمثيل الغذائي والالتهاب من خلال الأديبوكينات والسيتوكينات والحمض النووي الريبي الدقيق الذي تنتجه وتطلقه خلايا مختلفة في الأنسجة ، مع تأثيرات autocrine و paracrine والغدد الصماء 3,4. في البشر ، تشتمل الأنسجة الدهنية البيضاء على الأنسجة الدهنية تحت الجلد (SAT) والأنسجة الدهنية الحشوية (VAT) ، مع اختلافات تشريحية وجزيئية وخلوية وفسيولوجية مهمة بينهما 2,5. يمثل SAT ما يصل إلى 80٪ من ATالبشري ، بينما تقع ضريبة القيمة المضافة داخل تجويف البطن ، بشكل رئيسي في المساريق والثرب ، كونها أكثر نشاطا من الناحية الأيضية6. علاوة على ذلك ، فإن ضريبة القيمة المضافة هي عضو في الغدد الصماء يفرز وسطاء لهم تأثير كبير على وزن الجسم وحساسية الأنسولين واستقلاب الدهون والالتهابات. وبالتالي ، يؤدي تراكم ضريبة القيمة المضافة إلى السمنة في منطقة البطن والأمراض المرتبطة بالسمنة مثل مرض السكري من النوع 2 ، ومتلازمة التمثيل الغذائي ، وارتفاع ضغط الدم ، ومخاطر الإصابة بأمراض القلب والأوعية الدموية ، مما يمثل مؤشرا أفضل للوفيات المرتبطة بالسمنة6،7،8،9.
في ظروف الاستتباب ، تتعاون الخلايا الشحمية والبلاعم والخلايا المناعية الأخرى للحفاظ على استقلاب ضريبة القيمة المضافة من خلال إفراز وسطاء مضادين للالتهابات10. ومع ذلك ، فإن التوسع المفرط في ضريبة القيمة المضافة يعزز تجنيد الخلايا التائية المنشطة والخلايا القاتلة الطبيعية والبلاعم. في الواقع ، في ضريبة القيمة المضافة الخالية من الدهون ، تبلغ نسبة البلاعم 5٪ ، بينما ترتفع هذه النسبة إلى 50٪ في السمنة ، مع استقطاب البلاعم من النمط الظاهري المضاد للالتهابات إلى النمط الظاهري المؤيد للالتهابات ، مما يولد بيئة التهابية مزمنة10,11.
نتيجة لوباء السمنة ، نشأ عدد مذهل من التقارير التي تتناول مواضيع بحثية مختلفة لضريبة القيمة المضافة ، بما في ذلك بيولوجيا الخلايا الدهنية ، وعلم التخلق ، والالتهابات ، وخصائص الغدد الصماء ، والمناطق الناشئة مثل الحويصلات خارج الخلية ، من بين أمور أخرى8،10،12،13. ومع ذلك ، على الرغم من أن بيئة ضريبة القيمة المضافة يتم تعريفها من خلال الحديث المتبادل بين الخلايا الشحمية والبلاعم المقيمة أو القادمة ، فقد ركزت معظم الدراسات على مجموعة خلايا واحدة فقط ، وهناك معلومات نادرة حول تفاعل هذه الخلايا في ضريبة القيمة المضافة وعواقبها الفسيولوجية المرضية11,14. علاوة على ذلك ، تم إجراء دراسات قيمة تتناول تفاعل الخلايا الشحمية والبلاعم في AT باستخدام خطوط الخلايا ، وتفتقر إلى ظروف التحضير في الجسم الحي 11،14،15. تتطلب الإستراتيجية المناسبة لتشريح التفاعل أو المساهمة الخاصة لهذه الخلايا في ضريبة القيمة المضافة عزل كلا النوعين من الخلايا عن نفس خزعة الدهون لإجراء فحوصات في المختبر تعكس قدر الإمكان الخصائص في الجسم الحي التي تنظم عملية التمثيل الغذائي لضريبة القيمة المضافة.
على الرغم من أن طرق التفكك غير الأنزيمية القائمة على القوى الميكانيكية لكسر AT تضمن الحد الأدنى من التلاعب ، إلا أنه لا يمكن استخدام هذه الطرق إذا كان الهدف هو دراسة خلايا SVF ، حيث تتمتع بكفاءة أقل في استعادة الخلايا وقابلية بقاء منخفضة للخلايا مقارنة بالطرق الأنزيمية ، وهناك حاجة إلى حجم أكبر من الأنسجة 16,17. الهضم الأنزيمي باستخدام كولاجيناز هو طريقة لطيفة تسمح بالهضم الكافي للكولاجين وبروتينات المصفوفة خارج الخلية للأنسجة الليفية مثل WAT18 وكثيرا ما يستخدم عندما يكون التربسين غير فعال أو ضار19. يوفر البروتوكول إرشادات أساسية لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها للعزل الفعال للخلايا الشحمية الناضجة القابلة للحياة وخلايا SVF من خزعات ضريبة القيمة المضافة البشرية في عملية واحدة ، باستخدام تقنية الهضم الأنزيمي كولاجيناز ، مما يعطي معلومات لضمان غلة عالية (الكمية والنقاء والسلامة) من إجمالي الحمض النووي الريبي من الخلايا الشحمية الناضجة ، بما في ذلك microRNAs ، لتطبيقات التعبير النهائية. في الوقت نفسه ، تم تحسين البروتوكول لتحديد مجموعات فرعية من البلاعم من خلايا SVF من خلال تلطيخ علامات متعددة مرتبطة بالغشاء لمزيد من التحليل بواسطة قياس التدفقالخلوي 20.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 mL PCR tubes</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>PCR-02-C</td>
			<td>RNase, DNase free and nonpyrogenic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-150-C</td>
			<td>RNase, DNase free and nonpyrogenic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL serological pipettes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS4101-50EA</td>
			<td>Individually plastic wrapped</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#181;L universal pipet tip</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>T-300-L-R</td>
			<td>RNase, DNase free and nonpyrogenic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#181;L universal pipet tip</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>T-300-R-S</td>
			<td>RNase, DNase free and nonpyrogenic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 &#181;L universal pipet tip</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>T-1000-B-R</td>
			<td>RNase, DNase free and nonpyrogenic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.0 mL microcentrifuge tube</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-200-C</td>
			<td>RNase, DNase free and nonpyrogenic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#181;L universal pipet tip</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>T-200-Y-R</td>
			<td>RNase, DNase free and nonpyrogenic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2100 Bioanalyzer Instrument</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2939BA</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2101 Bioanalyzer PC</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2953CA</td>
			<td>2100 Expert Software pre-installed in PC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml Round Bottom Polystyrene Test Tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352003&#160;</td>
			<td>Snap cap, sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS430828-100EA</td>
			<td>Polipropilene, conical bottom and sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acid-guanidinium-phenol based reagent</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>R2050-1-200</td>
			<td>TRI Reagent or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent RNA 6000 Nano Kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-1511</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent Small RNA Kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-1548</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC/Cy7 anti-human CD14 Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>325620</td>
			<td>0.4 mg/106 cells, present on monocytes/macrophages, clone HCD14</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Baker</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>250 ml, non sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3912-100G</td>
			<td>Heat shock fraction, pH 5.2, &#8805;96%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chip priming station</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5065-9951</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase type II</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17101-015</td>
			<td>Powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270-100G</td>
			<td>Powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Direct-zol RNA Miniprep</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>R2051</td>
			<td>Supplied with 50 mL TRI reagen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting forceps</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Steel, serrated jaws and round ends</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection tray</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Stainless steel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl alcohol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E7023-500ML</td>
			<td>200&#160;proof, for molecular biology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS Flow Sheath Fluid</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>342003</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS Lysing Solution</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>349202</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSAria III Flow Cytometer/Cell Sorter</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>648282</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FASCDiva Software</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>642868</td>
			<td>Software v6.0 pre-installed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z359629-1EA</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manual cell counter</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mayo dissecting scisors</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Stainless steel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Adjustable temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ND2000LAPTOP</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Adjustable temperature and speed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P10&#160;variable volume&#160;micropipette&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific-Finnpipette</td>
			<td>4642040</td>
			<td>1 to 10 &#956;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P1000&#160;variable volume&#160;micropipette&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific-Finnpipette</td>
			<td>4642090</td>
			<td>100 to 1000 &#956;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P2&#160;variable volume&#160;micropipette&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific-Finnpipette</td>
			<td>4642010</td>
			<td>0.2 to 2 &#956;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P200&#160;variable volume&#160;micropipette&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific-Finnpipette</td>
			<td>4642080</td>
			<td>20 to 200 &#956;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR tube storage rack</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>R96PCRFSP</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE/Cy5 anti-human HLA-DR Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>307608</td>
			<td>0.0625 mg/106 cells, present on macrophages, clone L243</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE/Cy7 anti-human CD45 Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>304016</td>
			<td>0.1 mg/106 cells, present on leukocytes, clone H130</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3813-10PAK</td>
			<td>Powder, pH 7.4, for preparing 1 L solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette controller</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red Blood Cells Lysis Buffer</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11 814 389 001</td>
			<td>For preferential lysis of red blood cells from human whole blood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated centrifuge</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Whit adapter for 50 mL conical tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Specimen container</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipette</td>
			<td>Thermo Scientific-Samco</td>
			<td>204-1S</td>
			<td>Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250-061</td>
			<td>0.4% Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube racks</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>For different tube sizes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex Mini Shaker</td>
			<td>Cientifica SENNA</td>
			<td>BV101</td>
			<td>-</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of viable adipocytes and stromal vascular fraction from human visceral adipose tissue suitable for rna analysis and macrophage phenotyping

الأنسجة الدهنية الحشوية (VAT) هي عضو استقلابي نشط يتكون أساسا من الخلايا الشحمية الناضجة وخلايا الجزء الوعائي اللحمي (SVF) ، والتي تطلق جزيئات نشطة بيولوجيا مختلفة تتحكم في العمليات الأيضية والهرمونية والمناعية. حاليا ، من غير الواضح كيف يتم تنظيم هذه العمليات داخل الأنسجة الدهنية. لذلك ، فإن تطوير طرق تقييم مساهمة كل مجموعة خلايا في الفيزيولوجيا المرضية للأنسجة الدهنية أمر بالغ الأهمية. يصف هذا البروتوكول خطوات العزل ويوفر إرشادات استكشاف الأخطاء وإصلاحها اللازمة للعزل الفعال للخلايا الشحمية الناضجة القابلة للحياة و SVF من خزعات ضريبة القيمة المضافة البشرية في عملية واحدة ، باستخدام تقنية الهضم الأنزيمي كولاجيناز. علاوة على ذلك ، تم تحسين البروتوكول أيضا لتحديد مجموعات فرعية من البلاعم وإجراء عزل الحمض النووي الريبي للخلايا الشحمية الناضجة لدراسات التعبير الجيني ، مما يسمح بإجراء دراسات تشريح التفاعل بين مجموعات الخلايا هذه. باختصار ، يتم غسل خزعات ضريبة القيمة المضافة ، وفرمها ميكانيكيا ، وهضمها لتوليد تعليق أحادي الخلية. بعد الطرد المركزي ، يتم عزل الخلايا الشحمية الناضجة عن طريق التعويم من حبيبات SVF. يضمن بروتوكول استخراج الحمض النووي الريبي إنتاجية عالية من إجمالي الحمض النووي الريبي (بما في ذلك miRNAs) من الخلايا الشحمية لمقايسات التعبير النهائية. في الوقت نفسه ، يتم استخدام خلايا SVF لتوصيف مجموعات فرعية من البلاعم (النمط الظاهري المؤيد والمضاد للالتهابات) من خلال تحليل قياس التدفق الخلوي.

يصف هذا البروتوكول طريقة إنزيمية باستخدام هضم الكولاجيناز متبوعا بالطرد المركزي التفاضلي لعزل الخلايا الشحمية الناضجة القابلة للحياة وخلايا SVF من خزعات ضريبة القيمة المضافة التي تم الحصول عليها من النساء الحوامل الأصحاء بعد استئصال الثرب الجزئي في عملية واحدة. في هذه الحالة ، نستخدم ال?...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Viable Adipocytes and Stromal Vascular Fraction from Human Visceral Adipose Tissue Suitable for RNA Analysis and Macrophage Phenotyping at JoVE.c

Isolation of Viable Adipocytes and Stromal Vascular Fraction from Human Visceral Adipose Tissue Suitable for RNA Analysis and Macrophage Phenotyping

يوفر هذا البروتوكول طريقة فعالة لهضم الكولاجين لعزل الخلايا الشحمية القابلة للحياة وخلايا جزء الأوعية الدموية اللحمية من الدهون الحشوية البشرية في عملية واحدة ، بما في ذلك منهجية الحصول على الحمض النووي الريبي عالي الجودة من الخلايا الشحمية والتنميط الظاهري لبلاعم SVF من خلال تلطيخ علامات متعددة مرتبطة بالغشاء لتحليلها عن طريق قياس التدفق الخلوي.

عزل الخلايا الشحمية القابلة للحياة وجزء الأوعية الدموية اللحمية من الأنسجة الدهنية الحشوية البشرية المناسبة لتحليل الحمض النووي الريبي والتنميط الظاهري للبلاعم

Visceral adipose tissue (VAT) is an active metabolic organ composed mainly of mature adipocytes and stromal vascular fraction (SVF) cells, which release ...

This protocol allows for isolation and study of viable adipocytes and stromal vascular fraction SVF cells from human visceral fat. Enzymatic digestion using collagenase ensures high yields of total RNA from mature adipocytes, including microRNAs suitable for expression analysis. Simultaneously, the method is optimized to identify macrophages by flow cytometry.This protocol provides fundamental troubleshooting guidelines for easy and efficient isolation of viable mature adipocytes and SVF cells from human VAT biopsies in a single process. After the uterine closure and hemostasis, identify greater omentum and extend it on a wet compress. Identify an avascular zone and use Kelly forceps to drill the outer side of visceral adipose tissue, or VAT.Use Ochsner forceps to clamp the proximal and distal side in the zone where VAT was drilled, and used Metzenbaum scissors to cut the tissue. Tie the greater omentum with black silk number one, then remove the Ochsner forceps and evaluate the hemostasis. To perform enzymatic digestion, cut four grams of VAT and use scissors to mince the tissue into small pieces in a dissection tray.Transfer the pieces to a new sterile 50-milliliter centrifuge tube and add 25 milliliters of digestion solution. Incubate the tube at 37 degrees Celsius for 60 minutes in an orbital shaker at 125 RPM. Then filter the digested tissue through three layers of gauze into a new sterile 50-milliliter centrifuge tube.Centrifuge the tube at 200 G for five minutes at four degrees Celsius. After centrifugation, two phases should be visible. The upper phase corresponds to mature adipocytes while SVF cells remain in the pellet.Transfer the mature adipocytes to a tube. Lyse cells by adding 1000 microliters of acid-guanidinium-phenol-based reagent and mix thoroughly with a P1000 micropipette to homogenize. Incubate the mixture for five minutes at room temperature to boost dissociation of nucleo-protein complexes.Centrifuge the cell lysate for five minutes at 12, 000 G to obtain three phases, an upper yellow phase corresponding to adipocyte lipids, a middle pink phase corresponding to nucleic acids, and a pellet with cellular debris. Carefully remove the lipid layer with a P200 micro pipette. Then transfer the middle phase into a new two-milliliter tube, taking care not to disturb the other phases.After purifying the RNA and measuring the concentration with a UV visible spectrophotometer, use an RNA integrity kit to determine the RNA integrity number. Then use the small RNA kit to determine the concentration and percent of microRNAs. Place the clip into a bioanalyzer.Dilute 10 microliters of SVF cell suspension into 90 microliters of 0.4%trypan blue solution, and apply 10 microliters to a standard hemocytometer. Count the viable cells carefully, excluding the dead cells, in four squares at the corner of the counting chamber. Transfer a total of 1 million SVF cells per milliliter to a five-milliliter round-bottom polypropylene test tube for flow cytometry and pellet the cells by centrifugation at 800 G for five minutes at four degrees Celsius.Vortex carefully to loosen the pellet and resuspend the cells in 100 microliters of PBS. Add the pre-titrated optimal concentration of each fluorochrome-conjugated monoclonal antibody specific for a cell surface antigen and mix gently, then incubate the cells for 15 minutes in the dark. Add an excess of cold PBS.And centrifuge the SVF at 400 G for five minutes at four degrees Celsius. Decant the supernatant, taking care to not disturb the pellet. Resuspend the pellet in five milliliters of sheath fluid.Then filter the cells through three layers of gauze into a new five-milliliter round-bottom polypropylene test tube. Vortex each tube briefly before analysis and count a minimum of 10, 000 events for flow analysis. This RNA extraction protocol was used to obtain adequate purity and high integrity RNA and microRNAs from mature adipocytes.The RNA integrity was assessed by an RNA quality control analyzer. Approximately 2.8 times 10 to the six nucleated cells were present per gram of visceral adipose tissue. The stromal vascular fraction cells were labeled with fluorophore-conjugated primary antibodies to identify and characterize 18 macrophages by fluorescence-activated cell-sorting analysis.Cell aggregates were eliminated from analysis by plotting the forward scatter area versus forward scatter height. Then cellular debris was excluded by gating the cells, based on the correct size and complexity, using forward scatter area and the side scatter area. To analyze macrophages, the monocyte and macrophage lineage cells were selected using CD45 and CD14 markers.Subsequently, the CD45-CD14 double positive cells were separated based on macrophage marker HLA-DR expression. Two subsets of macrophages were identified. In addition to identifying new cell phenotypes, this protocol makes it possible to use purified cell populations for future analyses, such as DNA methylation, post-translational modifications, and signaling pathways.

Research

JoVE Journal

Medicine

Isolation of Human Islets from Partially Pancreatectomized Patients

عزلة الإنسان الفشوت من المرضى مستأصل البنكرياس جزئيا

Investigations into the pathogenesis of type 2 diabetes and islets of Langerhans malfunction 1 have been hampered by the limited availability of type 2 ...

Experimental Generation of Carcinoma-Associated Fibroblasts (CAFs) from Human Mammary Fibroblasts

Experimental Generation of Carcinoma-Associated Fibroblasts CAFs from Human Mammary Fibroblasts

الجيل التجريبية للسرطان ، المرتبطين بها الخلايا الليفية (مقاهي) من الخلايا الليفية الثديية البشرية

Carcinomas are complex tissues comprised of neoplastic cells and a non-cancerous compartment referred to as the 'stroma'. The stroma consists of ...

Encapsulation Thermogenic Preadipocytes for Transplantation into Adipose Tissue Depots

التغليف حرارة Preadipocytes للزراعة إلى الدهنية مستودعات الأنسجة

Cell encapsulation was developed to entrap viable cells within semi-permeable membranes. The engrafted encapsulated cells can exchange low molecular ...

Isolation and Cellular Phenotyping of Mesenchymal Stem Cells Derived from Synovial Fluid and Bone Marrow of Minipigs

العزلة والخلوية Phenotyping من الخلايا الجذعية الوسيطة المشتقة من نخاع الزلالية السائل والعظام من Minipigs

Mesenchymal stem cells (MSCs) have been established after isolation from various tissue sources, including bone marrow and synovial fluid. Recently, ...

Stromal Vascular Fraction-enriched Fat Grafting for the Treatment of Symptomatic End-neuromata

Stromal الأوعية الدموية الغنية بكسر الدهون تطعيم لعلاج أعراض نهاية-نيوروماتا

The purpose of this study was to methodically illustrate and highlight the crucial steps of stromal vascular fraction (SVF)-enriched fat grafting as a ...

Assessment of Human Adipose Tissue Microvascular Function Using Videomicroscopy

تقييم الدالة Microvascular الأنسجة الدهنية البشرية باستخدام فيديوميكروسكوبي

While obesity is closely linked to the development of metabolic and cardiovascular disease, little is known about mechanisms that govern these processes. ...

Clinical Protocol of Producing Adipose Tissue-Derived Stromal Vascular Fraction for Potential Cartilage Regeneration

بروتوكول السريرية لإنتاج كسر الأوعية الدموية Stromal المستمدة من الأنسجة الدهنية لتجديد الغضاريف المحتملة

Osteoarthritis (OA) is one of the most common debilitating disorders.&#160;Recently, numerous attempts have been made to improve the functions of the ...

Isolation of Adipose Derived Regenerative Cells for the Treatment of Erectile Dysfunction Following Radical Prostatectomy

عزل الخلايا التجديدية المشتقة من الدهون لعلاج ضعف الانتصاب بعد استئصال البروستاتا الجذري

Stem cells are used in many research areas within regenerative medicine in part because these treatments can be curative rather than symptomatic. Stem ...

Technique for Obtaining Mesenchymal Stem Cell from Adipose Tissue and Stromal Vascular Fraction Characterization in Long-Term Cryopreservation

تقنية الحصول على الخلايا الجذعية الوسيطة من الأنسجة الدهنية وتوصيف الكسر الوعائي اللحمية في الحفظ بالتبريد على المدى الطويل

Human mesenchymal stem cells derived from adipose tissue have become increasingly attractive as they show appropriate features and are an accessible ...

Isolation and Culture of Human Adipose-Derived Stem Cells With an Innovative Xenogeneic-Free Method for Human Therapy

عزل وزراعة الخلايا الجذعية البشرية المشتقة من الدهون بطريقة مبتكرة خالية من الجينات الخارجية للعلاج البشري

Considering the increasing impact of stem cell therapy, biosafety concerns have been raised regarding potential contamination or infection transmission ...