Name: isolation of viable adipocytes and stromal vascular fraction from human visceral adipose tissue suitable for rna analysis and macrophage phenotyping
Uploaded: 2020-10-27T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Viable Adipocytes and Stromal Vascular Fraction from Human Visceral Adipose Tissue Suitable for RNA Analysis and Macrophage Phenotyping at JoVE.c

Deze studie werd ondersteund door het Instituto Nacional de Perinatologia (subsidienummers: 3300-11402-01-575-17 en 212250-3210-21002-06-15) en CONACyT, Fondo Sectorial de Investigación en Salud y Seguridad Social (FOSISS) (subsidienummer 2015-3-2-61661).

Dit protocol is goedgekeurd door de IRB van het Instituto Nacional de Perinatologia (212250-3210-21002-06-15). Deelname was vrijwillig en alle ingeschreven vrouwen ondertekenden het formulier voor geïnformeerde toestemming.
1. Verzameling van visceraal vetweefsel
<ol><li>Verkrijg btw-biopsieën door middel van gedeeltelijke omentectomie tijdens een keizersnede van gezonde volwassen vrouwen met eenlingzwangerschappen op termijn zonder arbeid.</li>
	<li>Ga na de sluiting van de baarmoeder en ...

BTW speelt een cruciale rol bij metabole regulatie en ontstekingen. Toenemende belangstelling voor de rol van adipocyten en immuuncellen bij de chronische ontsteking die gepaard gaat met obesitas heeft geleid tot de ontwikkeling van verschillende technieken om de SVF en vetcellen die aanwezig zijn in AT te scheiden. De meeste technieken maken het echter niet mogelijk om deze twee verschillende sets cellen die levensvatbaar zijn voor stroomafwaartse toepassingen uit dezelfde btw-biopsie in één enkele procedure te verkri...

Wit vetweefsel bestaat niet alleen uit vetcellen of adipocyten, maar ook uit een niet-vette celfractie die bekend staat als stromale vasculaire fractie (SVF), die een heterogene celpopulatie bevat die bestaat uit macrofagen, andere immuuncellen als regulerende T-cellen (Tregs) en eosinofielen, preadipocyten en fibroblasten, omgeven door vasculair en bindweefsel 1,2. Vetweefsel (AT) wordt nu beschouwd als een orgaan dat fysiologische processen reguleert die verband houden met metabolisme en ontsteking door middel van adipokines, cytokines en microRNA's die door verschillende cellen worden geproduceerd en in het weefsel worden afgegeven, met autocriene, paracriene en endocriene effecten 3,4. Bij mensen omvat wit vetweefsel het onderhuidse vetweefsel (SAT) en het viscerale vetweefsel (VAT), met belangrijke anatomische, moleculaire, cellulaire en fysiologische verschillen tussen hen 2,5. SAT vertegenwoordigt tot 80% van de menselijke AT, terwijl VAT zich in de buikholte bevindt, voornamelijk in het mesenterium en het omentum, en metabolisch actiever is6. Bovendien is VAT een endocrien orgaan dat mediatoren afscheidt met een substantiële invloed op het lichaamsgewicht, de insulinegevoeligheid, het lipidenmetabolisme en ontstekingen. Bijgevolg leidt btw-accumulatie tot abdominale obesitas en aan obesitas gerelateerde ziekten zoals diabetes type 2, metabool syndroom, hypertensie en het risico op hart- en vaatziekten, wat een betere voorspeller is van obesitas-gerelateerde mortaliteit 6,7,8,9.
In homeostatische omstandigheden werken adipocyten, macrofagen en de andere immuuncellen samen om het VAT-metabolisme in stand te houden door de afscheiding van ontstekingsremmende mediatoren10. Buitensporige btw-verhoging bevordert echter de rekrutering van geactiveerde T-cellen, NK-cellen en macrofagen. In feite is de verhouding van de macrofagen bij magere btw 5%, terwijl deze verhouding oploopt tot 50% bij obesitas, waarbij macrofaagpolarisatie van ontstekingsremmend naar pro-inflammatoir fenotype ontstaat, waardoor een chronische ontstekingsomgeving ontstaat10,11.
Als gevolg van de obesitaspandemie is er een verbazingwekkend aantal rapporten verschenen over verschillende btw-onderzoeksonderwerpen, waaronder adipocytenbiologie, epigenetica, ontsteking, endocriene eigenschappen en opkomende gebieden zoals extracellulaire blaasjes, onder andere 8,10,12,13. Hoewel de btw-omgeving wordt bepaald door overspraak tussen adipocyten en de residente of aankomende macrofagen, hebben de meeste onderzoeken zich gericht op slechts één celpopulatie en is er weinig informatie over de interactie van deze cellen in btw en hun pathofysiologische gevolgen11,14. Bovendien werden waardevolle studies naar het adipocyt-macrofaag-samenspel in AT uitgevoerd met behulp van cellijnen, zonder de in vivo priming-omstandigheden 11,14,15. Een geschikte strategie om de interactie of de specifieke bijdrage van deze cellen in VAT te ontleden, vereist de isolatie van beide celtypen uit dezelfde vetbiopsie om in vitro assays uit te voeren die de in vivo eigenschappen die het VAT-metabolisme reguleren zo veel mogelijk weerspiegelen.
Hoewel de niet-enzymatische dissociatiemethoden op basis van mechanische krachten om de AT te breken minimale manipulatie garanderen, kunnen deze methoden niet worden gebruikt als het doel is om SVF-cellen te bestuderen, omdat ze een lagere efficiëntie hebben bij celherstel en een lage cellevensvatbaarheid in vergelijking met enzymatische methoden, en er een groter weefselvolume nodig is16,17. Enzymatische vertering met behulp van collagenase is een zachte methode die een adequate vertering van collageen en extracellulaire matrixeiwitten van vezelachtige weefsels zoals WAT18 mogelijk maakt en wordt vaak gebruikt wanneer trypsine niet effectief of schadelijk is19. Het protocol biedt fundamentele richtlijnen voor het oplossen van problemen voor efficiënte isolatie van levensvatbare rijpe adipocyten en SVF-cellen uit menselijke VAT-biopsieën in een enkel proces, met behulp van een collagenase-enzymatische verteringstechniek, en geeft informatie om hoge opbrengsten (hoeveelheid, zuiverheid en integriteit) van totaal RNA uit rijpe adipocyten, inclusief microRNA's, te garanderen voor stroomafwaartse expressietoepassingen. Tegelijkertijd is het protocol geoptimaliseerd om macrofaagsubsets van SVF-cellen te identificeren door middel van de kleuring van meerdere membraangebonden markers voor verdere analyse door middel van flowcytometrie20.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 mL PCR tubes</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>PCR-02-C</td>
			<td>RNase, DNase free and nonpyrogenic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-150-C</td>
			<td>RNase, DNase free and nonpyrogenic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL serological pipettes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS4101-50EA</td>
			<td>Individually plastic wrapped</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#181;L universal pipet tip</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>T-300-L-R</td>
			<td>RNase, DNase free and nonpyrogenic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#181;L universal pipet tip</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>T-300-R-S</td>
			<td>RNase, DNase free and nonpyrogenic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 &#181;L universal pipet tip</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>T-1000-B-R</td>
			<td>RNase, DNase free and nonpyrogenic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.0 mL microcentrifuge tube</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-200-C</td>
			<td>RNase, DNase free and nonpyrogenic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#181;L universal pipet tip</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>T-200-Y-R</td>
			<td>RNase, DNase free and nonpyrogenic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2100 Bioanalyzer Instrument</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2939BA</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2101 Bioanalyzer PC</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2953CA</td>
			<td>2100 Expert Software pre-installed in PC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml Round Bottom Polystyrene Test Tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352003&#160;</td>
			<td>Snap cap, sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS430828-100EA</td>
			<td>Polipropilene, conical bottom and sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acid-guanidinium-phenol based reagent</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>R2050-1-200</td>
			<td>TRI Reagent or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent RNA 6000 Nano Kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-1511</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent Small RNA Kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-1548</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC/Cy7 anti-human CD14 Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>325620</td>
			<td>0.4 mg/106 cells, present on monocytes/macrophages, clone HCD14</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Baker</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>250 ml, non sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3912-100G</td>
			<td>Heat shock fraction, pH 5.2, &#8805;96%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chip priming station</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5065-9951</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase type II</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17101-015</td>
			<td>Powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270-100G</td>
			<td>Powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Direct-zol RNA Miniprep</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>R2051</td>
			<td>Supplied with 50 mL TRI reagen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting forceps</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Steel, serrated jaws and round ends</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection tray</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Stainless steel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl alcohol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E7023-500ML</td>
			<td>200&#160;proof, for molecular biology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS Flow Sheath Fluid</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>342003</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS Lysing Solution</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>349202</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSAria III Flow Cytometer/Cell Sorter</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>648282</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FASCDiva Software</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>642868</td>
			<td>Software v6.0 pre-installed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z359629-1EA</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manual cell counter</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mayo dissecting scisors</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Stainless steel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Adjustable temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ND2000LAPTOP</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Adjustable temperature and speed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P10&#160;variable volume&#160;micropipette&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific-Finnpipette</td>
			<td>4642040</td>
			<td>1 to 10 &#956;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P1000&#160;variable volume&#160;micropipette&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific-Finnpipette</td>
			<td>4642090</td>
			<td>100 to 1000 &#956;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P2&#160;variable volume&#160;micropipette&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific-Finnpipette</td>
			<td>4642010</td>
			<td>0.2 to 2 &#956;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P200&#160;variable volume&#160;micropipette&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific-Finnpipette</td>
			<td>4642080</td>
			<td>20 to 200 &#956;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR tube storage rack</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>R96PCRFSP</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE/Cy5 anti-human HLA-DR Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>307608</td>
			<td>0.0625 mg/106 cells, present on macrophages, clone L243</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE/Cy7 anti-human CD45 Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>304016</td>
			<td>0.1 mg/106 cells, present on leukocytes, clone H130</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3813-10PAK</td>
			<td>Powder, pH 7.4, for preparing 1 L solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette controller</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red Blood Cells Lysis Buffer</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11 814 389 001</td>
			<td>For preferential lysis of red blood cells from human whole blood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated centrifuge</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Whit adapter for 50 mL conical tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Specimen container</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipette</td>
			<td>Thermo Scientific-Samco</td>
			<td>204-1S</td>
			<td>Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250-061</td>
			<td>0.4% Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube racks</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>For different tube sizes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex Mini Shaker</td>
			<td>Cientifica SENNA</td>
			<td>BV101</td>
			<td>-</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of viable adipocytes and stromal vascular fraction from human visceral adipose tissue suitable for rna analysis and macrophage phenotyping

Visceraal vetweefsel (VAT) is een actief metabolisch orgaan dat voornamelijk bestaat uit rijpe adipocyten en stromale vasculaire fractie (SVF)-cellen, die verschillende bioactieve moleculen afgeven die metabole, hormonale en immuunprocessen regelen; Momenteel is het onduidelijk hoe deze processen in het vetweefsel worden gereguleerd. Daarom is de ontwikkeling van methoden die de bijdrage van elke celpopulatie aan de pathofysiologie van vetweefsel evalueren, cruciaal. Dit protocol beschrijft de isolatiestappen en biedt de nodige richtlijnen voor het oplossen van problemen voor een efficiënte isolatie van levensvatbare rijpe adipocyten en SVF uit menselijke VAT-biopsieën in één enkel proces, met behulp van een collagenase enzymatische verteringstechniek. Bovendien is het protocol ook geoptimaliseerd om macrofaagsubsets te identificeren en volwassen adipocyten-RNA-isolatie uit te voeren voor genexpressiestudies, waardoor studies kunnen worden uitgevoerd om de interactie tussen deze celpopulaties te ontleden. In het kort worden btw-biopsieën gewassen, mechanisch gehakt en verteerd om een eencellige suspensie te genereren. Na centrifugatie worden rijpe adipocyten geïsoleerd door flotatie uit de SVF-pellet. Het RNA-extractieprotocol zorgt voor een hoge opbrengst van totaal RNA (inclusief miRNA's) uit adipocyten voor stroomafwaartse expressietests. Tegelijkertijd worden SVF-cellen gebruikt om macrofaagsubsets (pro- en anti-inflammatoir fenotype) te karakteriseren door middel van flowcytometrie-analyse.

Dit protocol beschrijft een enzymatische methode waarbij gebruik wordt gemaakt van collagenase-digestie gevolgd door differentiële centrifugatie om in één enkel proces levensvatbare rijpe adipocyten en SVF-cellen te isoleren uit VAT-biopsieën verkregen van gezonde zwangere vrouwen na gedeeltelijke omentectomie. In dit geval gebruiken we de adipocyten voor RNA-extractie en de SVF voor macrofaagfenotypering.
Het RNA-extractieprotocol maakte het mogelijk om RNA te verkrijgen met een voldoende...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Viable Adipocytes and Stromal Vascular Fraction from Human Visceral Adipose Tissue Suitable for RNA Analysis and Macrophage Phenotyping at JoVE.c

Isolation of Viable Adipocytes and Stromal Vascular Fraction from Human Visceral Adipose Tissue Suitable for RNA Analysis and Macrophage Phenotyping

Dit protocol biedt een efficiënte collagenase-verteringsmethode voor isolatie van levensvatbare adipocyten en stromale vasculaire fractie-SVF-cellen uit menselijk visceraal vet in één enkel proces, inclusief methodologie om hoogwaardig RNA uit adipocyten te verkrijgen en fenotypificatie van SVF-macrofagen door kleuring van meerdere membraangebonden markers voor analyse door middel van flowcytometrie.

Isolatie van levensvatbare vetcellen en stromale vasculaire fractie uit menselijk visceraal vetweefsel geschikt voor RNA-analyse en macrofaagfenotypering

Visceral adipose tissue (VAT) is an active metabolic organ composed mainly of mature adipocytes and stromal vascular fraction (SVF) cells, which release ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Isolation of Human Islets from Partially Pancreatectomized Patients

Isolatie van de Mens Eilandjes van Gedeeltelijk Pancreatectomized Patiënten

Investigations into the pathogenesis of type 2 diabetes and islets of Langerhans malfunction 1 have been hampered by the limited availability of type 2 ...

Experimental Generation of Carcinoma-Associated Fibroblasts (CAFs) from Human Mammary Fibroblasts

Experimental Generation of Carcinoma-Associated Fibroblasts CAFs from Human Mammary Fibroblasts

Experimentele Generatie van Carcinoom-geassocieerde fibroblasten (cafe&#39;s) van Human Borst fibroblasten

Carcinomas are complex tissues comprised of neoplastic cells and a non-cancerous compartment referred to as the 'stroma'. The stroma consists of ...

Isolation of Cardiomyocyte Nuclei from Post-mortem Tissue

Isolatie van cardiomyocyten Kernen van Post-mortem weefsel

Identification of cardiomyocyte nuclei has been challenging in tissue sections as most strategies rely only on cytoplasmic marker proteins1. Rare events ...

Encapsulation Thermogenic Preadipocytes for Transplantation into Adipose Tissue Depots

Inkapseling Thermogenic preadipocyten voor transplantatie in VetWeefsel Depots

Cell encapsulation was developed to entrap viable cells within semi-permeable membranes. The engrafted encapsulated cells can exchange low molecular ...

Isolation and Cellular Phenotyping of Mesenchymal Stem Cells Derived from Synovial Fluid and Bone Marrow of Minipigs

Isolatie en Cellulaire fenotypering van mesenchymale stamcellen afkomstig van de gewrichtsvloeistof en beenmerg van minivarkens

Mesenchymal stem cells (MSCs) have been established after isolation from various tissue sources, including bone marrow and synovial fluid. Recently, ...

Stromal Vascular Fraction-enriched Fat Grafting for the Treatment of Symptomatic End-neuromata

Stromale vasculaire breuk-verrijkt vet enten voor de behandeling van symptomatische einde-neuromata

The purpose of this study was to methodically illustrate and highlight the crucial steps of stromal vascular fraction (SVF)-enriched fat grafting as a ...

Assessment of Human Adipose Tissue Microvascular Function Using Videomicroscopy

Beoordeling van menselijk vetweefsel microvasculaire functie met behulp van Videomicroscopy

While obesity is closely linked to the development of metabolic and cardiovascular disease, little is known about mechanisms that govern these processes. ...

Isolation of Atrial Cardiomyocytes from a Rat Model of Metabolic Syndrome-related Heart Failure with Preserved Ejection Fraction

Isolatie van atriale Cardiomyocytes van een Rat Model van metabole syndroom-gerelateerde hartfalen met bewaarde ejectie Fractie

In this article, we describe an optimized, Langendorff-based procedure for the isolation of single-cell atrial cardiomyocytes (ACMs) from a rat model of ...

Clinical Protocol of Producing Adipose Tissue-Derived Stromal Vascular Fraction for Potential Cartilage Regeneration

Protocol voor klinische adipeus weefsel afkomstige stromale vasculaire breuk oplevert potentiële regeneratie van het kraakbeen

Osteoarthritis (OA) is one of the most common debilitating disorders.&#160;Recently, numerous attempts have been made to improve the functions of the ...

Isolation of Adipose Derived Regenerative Cells for the Treatment of Erectile Dysfunction Following Radical Prostatectomy

Isolatie van van vetweefsel afgeleide regeneratieve cellen voor de behandeling van erectiestoornissen na radicale prostatectomie

Stem cells are used in many research areas within regenerative medicine in part because these treatments can be curative rather than symptomatic. Stem ...