Name: isolation of viable adipocytes and stromal vascular fraction from human visceral adipose tissue suitable for rna analysis and macrophage phenotyping
Uploaded: 2020-10-27T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Viable Adipocytes and Stromal Vascular Fraction from Human Visceral Adipose Tissue Suitable for RNA Analysis and Macrophage Phenotyping at JoVE.c

Cette étude a été financée par l’Instituto Nacional de Perinatologia (numéros de subvention : 3300-11402-01-575-17 et 212250-3210-21002-06-15) et le CONACyT, Fondo Sectorial de Investigación en Salud y Seguridad Social (FOSISS) (numéro de subvention 2015-3-2-61661).

Ce protocole a été approuvé par l’IRB de l’Instituto Nacional de Perinatologia (212250-3210-21002-06-15). La participation était volontaire et toutes les femmes inscrites ont signé le formulaire de consentement éclairé.
1. Prélèvement de tissu adipeux viscéral
<ol><li>Obtenez des biopsies de TVA par omentectomie partielle pendant la césarienne de femmes adultes en bonne santé ayant une grossesse unique à terme sans travail.</li>
	<li>Après la fermeture utérine et l’hémo...

La TVA joue un rôle crucial dans la régulation métabolique et l’inflammation. L’intérêt croissant pour le rôle des adipocytes et des cellules immunitaires dans l’inflammation chronique associée à l’obésité a conduit au développement de différentes techniques pour séparer les SVF et les cellules graisseuses présentes dans l’AT. Cependant, la plupart des techniques ne permettent pas d’obtenir ces deux ensembles différents de cellules viables pour des applications en aval à partir d’une même b...

Le tissu adipeux blanc est composé non seulement de cellules adipeuses ou adipocytes, mais aussi d’une fraction de cellules non graisseuses connue sous le nom de fraction vasculaire stromale (SVF), qui contient une population cellulaire hétérogène composée de macrophages, d’autres cellules immunitaires comme les lymphocytes T régulateurs (Tregs) et d’éosinophiles, de préadipocytes et de fibroblastes, entourés de tissu vasculaire et conjonctif 1,2. Le tissu adipeux (TA) est maintenant considéré comme un organe qui régule les processus physiologiques liés au métabolisme et à l’inflammation par le biais d’adipokines, de cytokines et de microARN produits et libérés par différentes cellules dans le tissu, avec des effets autocrines, paracrines et endocriniens 3,4. Chez l’homme, le tissu adipeux blanc comprend le tissu adipeux sous-cutané (SAT) et le tissu adipeux viscéral (VAT), avec d’importantes différences anatomiques, moléculaires, cellulaires et physiologiques entre eux 2,5. Le SAT représente jusqu’à 80 % de l’AT humain, tandis que le VAT est situé dans la cavité abdominale, principalement dans le mésentère et l’épiploon, étant métaboliquement plus actif6. De plus, le VAT est un organe endocrinien qui sécrète des médiateurs ayant un impact substantiel sur le poids corporel, la sensibilité à l’insuline, le métabolisme des lipides et l’inflammation. Par conséquent, l’accumulation de TVA entraîne une obésité abdominale et des maladies liées à l’obésité telles que le diabète de type 2, le syndrome métabolique, l’hypertension et le risque de maladies cardiovasculaires, ce qui représente un meilleur prédicteur de la mortalité associée à l’obésité 6,7,8,9.
Dans des conditions homéostatiques, les adipocytes, les macrophages et les autres cellules immunitaires coopèrent pour maintenir le métabolisme de la TVA par la sécrétion de médiateurs anti-inflammatoires10. Cependant, une expansion excessive de la TVA favorise le recrutement de lymphocytes T, de cellules NK et de macrophages activés. En fait, dans la TVA pauvre, le rapport des macrophages est de 5%, tandis que ce rapport monte jusqu’à 50% dans l’obésité, avec une polarisation des macrophages du phénotype anti-inflammatoire au phénotype pro-inflammatoire, générant un environnement inflammatoire chronique10,11.
En raison de la pandémie d’obésité, un nombre étonnant de rapports ont été publiés sur différents sujets de recherche sur la TVA, notamment la biologie des adipocytes, l’épigénétique, l’inflammation, les propriétés endocriniennes et les domaines émergents comme les vésicules extracellulaires, entre autres 8,10,12,13. Cependant, bien que l’environnement de la TVA soit défini par la diaphonie entre les adipocytes et les macrophages résidents ou entrants, la plupart des études se sont concentrées sur une seule population cellulaire, et il existe peu d’informations sur l’interaction de ces cellules dans la TVA et leurs conséquences physiopathologiques11,14. De plus, des études intéressantes portant sur l’interaction adipocyte-macrophage dans l’AT ont été réalisées à l’aide de lignées cellulaires, sans les conditions d’amorçage in vivo 11,14,15. Une stratégie appropriée pour disséquer l’interaction ou la contribution particulière de ces cellules dans la TVA nécessite l’isolement des deux types de cellules à partir d’une même biopsie graisseuse pour réaliser des tests in vitro qui reflètent aussi similaires que possible les propriétés in vivo qui régulent le métabolisme de la TVA.
Bien que les méthodes de dissociation non enzymatique basées sur les forces mécaniques pour briser l’AT garantissent une manipulation minimale, ces méthodes ne peuvent pas être utilisées si l’objectif est d’étudier les cellules SVF, car elles ont une efficacité moindre dans la récupération cellulaire et une faible viabilité cellulaire par rapport aux méthodes enzymatiques, et un plus grand volume de tissu est nécessaire16,17. La digestion enzymatique à l’aide de la collagénase est une méthode douce qui permet une digestion adéquate du collagène et des protéines de la matrice extracellulaire des tissus fibreux tels que WAT18 et est fréquemment utilisée lorsque la trypsine est inefficace ou dommageable19. Le protocole fournit des directives de dépannage fondamentales pour isoler efficacement des adipocytes matures viables et des cellules SVF à partir de biopsies de VAT humaines en un seul processus, en utilisant une technique de digestion enzymatique de la collagénase, fournissant des informations pour assurer des rendements élevés (quantité, pureté et intégrité) d’ARN total à partir d’adipocytes matures, y compris des microARN, pour les applications d’expression en aval. Simultanément, le protocole est optimisé pour identifier les sous-ensembles de macrophages des cellules SVF grâce à la coloration de plusieurs marqueurs membranaires pour une analyse plus approfondie par cytométrie en flux20.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 mL PCR tubes</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>PCR-02-C</td>
			<td>RNase, DNase free and nonpyrogenic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-150-C</td>
			<td>RNase, DNase free and nonpyrogenic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL serological pipettes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS4101-50EA</td>
			<td>Individually plastic wrapped</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#181;L universal pipet tip</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>T-300-L-R</td>
			<td>RNase, DNase free and nonpyrogenic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#181;L universal pipet tip</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>T-300-R-S</td>
			<td>RNase, DNase free and nonpyrogenic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 &#181;L universal pipet tip</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>T-1000-B-R</td>
			<td>RNase, DNase free and nonpyrogenic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.0 mL microcentrifuge tube</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-200-C</td>
			<td>RNase, DNase free and nonpyrogenic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#181;L universal pipet tip</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>T-200-Y-R</td>
			<td>RNase, DNase free and nonpyrogenic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2100 Bioanalyzer Instrument</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2939BA</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2101 Bioanalyzer PC</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2953CA</td>
			<td>2100 Expert Software pre-installed in PC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml Round Bottom Polystyrene Test Tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352003&#160;</td>
			<td>Snap cap, sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS430828-100EA</td>
			<td>Polipropilene, conical bottom and sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acid-guanidinium-phenol based reagent</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>R2050-1-200</td>
			<td>TRI Reagent or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent RNA 6000 Nano Kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-1511</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent Small RNA Kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-1548</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC/Cy7 anti-human CD14 Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>325620</td>
			<td>0.4 mg/106 cells, present on monocytes/macrophages, clone HCD14</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Baker</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>250 ml, non sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3912-100G</td>
			<td>Heat shock fraction, pH 5.2, &#8805;96%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chip priming station</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5065-9951</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase type II</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17101-015</td>
			<td>Powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270-100G</td>
			<td>Powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Direct-zol RNA Miniprep</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>R2051</td>
			<td>Supplied with 50 mL TRI reagen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting forceps</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Steel, serrated jaws and round ends</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection tray</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Stainless steel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl alcohol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E7023-500ML</td>
			<td>200&#160;proof, for molecular biology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS Flow Sheath Fluid</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>342003</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS Lysing Solution</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>349202</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSAria III Flow Cytometer/Cell Sorter</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>648282</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FASCDiva Software</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>642868</td>
			<td>Software v6.0 pre-installed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z359629-1EA</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manual cell counter</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mayo dissecting scisors</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Stainless steel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Adjustable temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ND2000LAPTOP</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Adjustable temperature and speed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P10&#160;variable volume&#160;micropipette&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific-Finnpipette</td>
			<td>4642040</td>
			<td>1 to 10 &#956;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P1000&#160;variable volume&#160;micropipette&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific-Finnpipette</td>
			<td>4642090</td>
			<td>100 to 1000 &#956;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P2&#160;variable volume&#160;micropipette&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific-Finnpipette</td>
			<td>4642010</td>
			<td>0.2 to 2 &#956;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P200&#160;variable volume&#160;micropipette&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific-Finnpipette</td>
			<td>4642080</td>
			<td>20 to 200 &#956;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR tube storage rack</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>R96PCRFSP</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE/Cy5 anti-human HLA-DR Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>307608</td>
			<td>0.0625 mg/106 cells, present on macrophages, clone L243</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE/Cy7 anti-human CD45 Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>304016</td>
			<td>0.1 mg/106 cells, present on leukocytes, clone H130</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3813-10PAK</td>
			<td>Powder, pH 7.4, for preparing 1 L solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette controller</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red Blood Cells Lysis Buffer</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11 814 389 001</td>
			<td>For preferential lysis of red blood cells from human whole blood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated centrifuge</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Whit adapter for 50 mL conical tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Specimen container</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipette</td>
			<td>Thermo Scientific-Samco</td>
			<td>204-1S</td>
			<td>Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250-061</td>
			<td>0.4% Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube racks</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>For different tube sizes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex Mini Shaker</td>
			<td>Cientifica SENNA</td>
			<td>BV101</td>
			<td>-</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of viable adipocytes and stromal vascular fraction from human visceral adipose tissue suitable for rna analysis and macrophage phenotyping

Le tissu adipeux viscéral (VAT) est un organe métabolique actif composé principalement d’adipocytes matures et de cellules de fraction vasculaire stromale (SVF), qui libèrent différentes molécules bioactives qui contrôlent les processus métaboliques, hormonaux et immunitaires ; Actuellement, on ne sait pas comment ces processus sont régulés dans le tissu adipeux. Par conséquent, le développement de méthodes évaluant la contribution de chaque population cellulaire à la physiopathologie du tissu adipeux est crucial. Ce protocole décrit les étapes d’isolement et fournit les directives de dépannage nécessaires pour isoler efficacement les adipocytes matures viables et la SVF des biopsies de TVA humaine en un seul processus, en utilisant une technique de digestion enzymatique de la collagénase. De plus, le protocole est également optimisé pour identifier les sous-ensembles de macrophages et effectuer l’isolement d’ARN adipocytaires matures pour les études d’expression génique, ce qui permet de réaliser des études disséquant l’interaction entre ces populations cellulaires. En bref, les biopsies de VAT sont lavées, hachées mécaniquement et digérées pour générer une suspension unicellulaire. Après centrifugation, les adipocytes matures sont isolés par flottation à partir de la pastille SVF. Le protocole d’extraction d’ARN garantit un rendement élevé d’ARN total (y compris les miARN) des adipocytes pour les tests d’expression en aval. Simultanément, les cellules SVF sont utilisées pour caractériser les sous-ensembles de macrophages (phénotype pro- et anti-inflammatoire) par analyse par cytométrie en flux.

Ce protocole décrit une méthode enzymatique utilisant la digestion de la collagénase suivie d’une centrifugation différentielle pour isoler, en un seul processus, des adipocytes matures viables et des cellules SVF à partir de biopsies de TVA obtenues sur des femmes enceintes en bonne santé après une omentectomie partielle. Dans ce cas, nous utilisons les adipocytes pour l’extraction de l’ARN et le SVF pour le phénotypage des macrophages.
Le protocole d’extraction de l’ARN a p...

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Isolation of Viable Adipocytes and Stromal Vascular Fraction from Human Visceral Adipose Tissue Suitable for RNA Analysis and Macrophage Phenotyping

Ce protocole fournit une méthode efficace de digestion de la collagénase pour isoler des adipocytes viables et des cellules stromales de fraction vasculaire-SVF de la graisse viscérale humaine en un seul processus, y compris une méthodologie pour obtenir un ARN de haute qualité à partir d’adipocytes et la phénotypification des macrophages SVF par coloration de plusieurs marqueurs membranaires pour analyse par cytométrie en flux.

Isolement d’adipocytes viables et d’une fraction vasculaire stromale à partir de tissu adipeux viscéral humain adapté à l’analyse de l’ARN et au phénotypage des macrophages

Visceral adipose tissue (VAT) is an active metabolic organ composed mainly of mature adipocytes and stromal vascular fraction (SVF) cells, which release ...

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