Name: isolation of viable adipocytes and stromal vascular fraction from human visceral adipose tissue suitable for rna analysis and macrophage phenotyping
Uploaded: 2020-10-27T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Viable Adipocytes and Stromal Vascular Fraction from Human Visceral Adipose Tissue Suitable for RNA Analysis and Macrophage Phenotyping at JoVE.c

Diese Studie wurde vom Instituto Nacional de Perinatologia (Fördernummer: 3300-11402-01-575-17 und 212250-3210-21002-06-15) und CONACyT, Fondo Sectorial de Investigación en Salud y Seguridad Social (FOSISS) (Fördernummer 2015-3-2-61661) unterstützt.

Dieses Protokoll wurde vom IRB des Instituto Nacional de Perinatologia genehmigt (212250-3210-21002-06-15). Die Teilnahme war freiwillig, und alle eingeschriebenen Frauen unterschrieben die Einwilligungserklärung.
1. Entnahme von viszeralem Fettgewebe
<ol><li>Erhalten Sie VAT-Biopsien durch partielle Omentektomie während eines Kaiserschnitts von gesunden erwachsenen Frauen mit Einlingsschwangerschaften ohne Wehen.</li>
	<li>Identifizieren Sie nach dem Uterusverschluss und der Blutstillung ...

VAT spielt eine entscheidende Rolle bei der Stoffwechselregulation und Entzündung. Das zunehmende Interesse an der Rolle von Adipozyten und Immunzellen bei der chronischen Entzündung im Zusammenhang mit Fettleibigkeit hat zur Entwicklung verschiedener Techniken zur Trennung der in AT vorhandenen SVF- und Fettzellen geführt. Die meisten Techniken erlauben es jedoch nicht, diese beiden unterschiedlichen Zellgruppen, die für Downstream-Anwendungen geeignet sind, aus derselben VAT-Biopsie in einem einzigen Verfahren zu e...

Weißes Fettgewebe besteht nicht nur aus Fettzellen oder Adipozyten, sondern auch aus einer fettfreien Zellfraktion, die als stromale vaskuläre Fraktion (SVF) bekannt ist und eine heterogene Zellpopulation enthält, die aus Makrophagen, anderen Immunzellen als regulatorische T-Zellen (Tregs) und Eosinophilen, Präadipozyten und Fibroblasten besteht, die von Gefäß- und Bindegewebe umgeben sind 1,2. Fettgewebe (AT) gilt heute als Organ, das physiologische Prozesse im Zusammenhang mit Stoffwechsel und Entzündung durch Adipokine, Zytokine und microRNAs reguliert, die von verschiedenen Zellen produziert und in das Gewebe freigesetzt werden, mit autokrinen, parakrinen und endokrinen Effekten 3,4. Beim Menschen umfasst weißes Fettgewebe das subkutane Fettgewebe (SAT) und das viszerale Fettgewebe (VAT) mit wichtigen anatomischen, molekularen, zellulären und physiologischen Unterschieden zwischen ihnen 2,5. SAT macht bis zu 80 % der menschlichen AT aus, während sich VAT in der Bauchhöhle befindet, hauptsächlich im Mesenterium und Omentum, und metabolisch aktiver ist6. Darüber hinaus ist VAT ein endokrines Organ, das Mediatoren absondert, die einen erheblichen Einfluss auf das Körpergewicht, die Insulinsensitivität, den Fettstoffwechsel und Entzündungen haben. Folglich führt die MwSt.-Akkumulation zu abdominaler Adipositas und Adipositas-bedingten Krankheiten wie Typ-2-Diabetes, metabolischem Syndrom, Bluthochdruck und kardiovaskulärem Erkrankungsrisiko, was einen besseren Prädiktor für die Adipositas-assoziierte Mortalität darstellt 6,7,8,9.
Unter homöostatischen Bedingungen arbeiten Adipozyten, Makrophagen und die anderen Immunzellen zusammen, um den VAT-Stoffwechsel durch die Sekretion entzündungshemmender Mediatoren aufrechtzuerhalten10. Eine übermäßige VAT-Expansion fördert jedoch die Rekrutierung von aktivierten T-Zellen, NK-Zellen und Makrophagen. Tatsächlich beträgt das Verhältnis der Makrophagen bei magerer Mehrwertsteuer 5 %, während dieses Verhältnis bei Fettleibigkeit auf bis zu 50 % ansteigt, wobei die Makrophagenpolarisation vom entzündungshemmenden zum entzündungsfördernden Phänotyp erfolgt und ein chronisch entzündliches Umfeld erzeugt10,11.
Als Folge der Adipositas-Pandemie ist eine erstaunliche Anzahl von Berichten entstanden, die sich mit verschiedenen VAT-Forschungsthemen befassen, darunter Adipozytenbiologie, Epigenetik, Entzündungen, endokrine Eigenschaften und neu entstehende Bereiche wie extrazelluläre Vesikel, unter anderem 8,10,12,13. Obwohl die VAT-Umgebung durch Crosstalk zwischen Adipozyten und den ansässigen oder ankommenden Makrophagen definiert wird, haben sich die meisten Studien nur auf eine Zellpopulation konzentriert, und es gibt nur wenige Informationen über die Interaktion dieser Zellen in VAT und ihre pathophysiologischen Konsequenzen11,14. Darüber hinaus wurden wertvolle Studien zum Adipozyten-Makrophagen-Zusammenspiel bei AT mit Zelllinien durchgeführt, denen die In-vivo-Priming-Bedingungen fehlten 11,14,15. Eine geeignete Strategie, um die Interaktion oder den besonderen Beitrag dieser Zellen bei VAT zu analysieren, erfordert die Isolierung beider Zelltypen aus derselben Fettbiopsie, um In-vitro-Assays durchzuführen, die die In-vivo-Eigenschaften, die den VAT-Stoffwechsel regulieren, so ähnlich wie möglich widerspiegeln.
Obwohl die nicht-enzymatischen Dissoziationsmethoden, die auf mechanischen Kräften zum Brechen des AT basieren, eine minimale Manipulation gewährleisten, können diese Methoden nicht verwendet werden, wenn das Ziel darin besteht, SVF-Zellen zu untersuchen, da sie im Vergleich zu enzymatischen Methoden eine geringere Effizienz bei der Zellrückgewinnung und eine geringe Zellviabilität aufweisen und ein größeres Gewebevolumen benötigt wird16,17. Der enzymatische Verdau mit Kollagenase ist eine schonende Methode, die einen adäquaten Verdau von Kollagen und extrazellulären Matrixproteinen von Fasergeweben wie WAT18 ermöglicht und häufig angewendet wird, wenn Trypsin unwirksam oder schädlich ist19. Das Protokoll enthält grundlegende Richtlinien zur Fehlerbehebung für die effiziente Isolierung lebensfähiger reifer Adipozyten und SVF-Zellen aus humanen VAT-Biopsien in einem einzigen Prozess unter Verwendung einer enzymatischen Kollagenase-Verdautechnik, die Informationen liefert, um eine hohe Ausbeute (Menge, Reinheit und Integrität) der Gesamt-RNA aus reifen Adipozyten, einschließlich microRNAs, für nachgelagerte Expressionsanwendungen zu gewährleisten. Gleichzeitig wird das Protokoll optimiert, um Makrophagen-Untergruppen aus SVF-Zellen durch die Färbung mehrerer membrangebundener Marker für die weitere Analyse durch Durchflusszytometrie20 zu identifizieren.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 mL PCR tubes</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>PCR-02-C</td>
			<td>RNase, DNase free and nonpyrogenic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-150-C</td>
			<td>RNase, DNase free and nonpyrogenic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL serological pipettes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS4101-50EA</td>
			<td>Individually plastic wrapped</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#181;L universal pipet tip</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>T-300-L-R</td>
			<td>RNase, DNase free and nonpyrogenic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#181;L universal pipet tip</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>T-300-R-S</td>
			<td>RNase, DNase free and nonpyrogenic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 &#181;L universal pipet tip</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>T-1000-B-R</td>
			<td>RNase, DNase free and nonpyrogenic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.0 mL microcentrifuge tube</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-200-C</td>
			<td>RNase, DNase free and nonpyrogenic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#181;L universal pipet tip</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>T-200-Y-R</td>
			<td>RNase, DNase free and nonpyrogenic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2100 Bioanalyzer Instrument</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2939BA</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2101 Bioanalyzer PC</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2953CA</td>
			<td>2100 Expert Software pre-installed in PC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml Round Bottom Polystyrene Test Tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352003&#160;</td>
			<td>Snap cap, sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS430828-100EA</td>
			<td>Polipropilene, conical bottom and sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acid-guanidinium-phenol based reagent</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>R2050-1-200</td>
			<td>TRI Reagent or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent RNA 6000 Nano Kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-1511</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent Small RNA Kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-1548</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC/Cy7 anti-human CD14 Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>325620</td>
			<td>0.4 mg/106 cells, present on monocytes/macrophages, clone HCD14</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Baker</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>250 ml, non sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3912-100G</td>
			<td>Heat shock fraction, pH 5.2, &#8805;96%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chip priming station</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5065-9951</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase type II</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17101-015</td>
			<td>Powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270-100G</td>
			<td>Powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Direct-zol RNA Miniprep</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>R2051</td>
			<td>Supplied with 50 mL TRI reagen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting forceps</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Steel, serrated jaws and round ends</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection tray</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Stainless steel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl alcohol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E7023-500ML</td>
			<td>200&#160;proof, for molecular biology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS Flow Sheath Fluid</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>342003</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS Lysing Solution</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>349202</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSAria III Flow Cytometer/Cell Sorter</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>648282</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FASCDiva Software</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>642868</td>
			<td>Software v6.0 pre-installed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z359629-1EA</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manual cell counter</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mayo dissecting scisors</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Stainless steel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Adjustable temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ND2000LAPTOP</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Adjustable temperature and speed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P10&#160;variable volume&#160;micropipette&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific-Finnpipette</td>
			<td>4642040</td>
			<td>1 to 10 &#956;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P1000&#160;variable volume&#160;micropipette&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific-Finnpipette</td>
			<td>4642090</td>
			<td>100 to 1000 &#956;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P2&#160;variable volume&#160;micropipette&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific-Finnpipette</td>
			<td>4642010</td>
			<td>0.2 to 2 &#956;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P200&#160;variable volume&#160;micropipette&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific-Finnpipette</td>
			<td>4642080</td>
			<td>20 to 200 &#956;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR tube storage rack</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>R96PCRFSP</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE/Cy5 anti-human HLA-DR Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>307608</td>
			<td>0.0625 mg/106 cells, present on macrophages, clone L243</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE/Cy7 anti-human CD45 Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>304016</td>
			<td>0.1 mg/106 cells, present on leukocytes, clone H130</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3813-10PAK</td>
			<td>Powder, pH 7.4, for preparing 1 L solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette controller</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red Blood Cells Lysis Buffer</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11 814 389 001</td>
			<td>For preferential lysis of red blood cells from human whole blood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated centrifuge</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Whit adapter for 50 mL conical tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Specimen container</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipette</td>
			<td>Thermo Scientific-Samco</td>
			<td>204-1S</td>
			<td>Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250-061</td>
			<td>0.4% Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube racks</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>For different tube sizes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex Mini Shaker</td>
			<td>Cientifica SENNA</td>
			<td>BV101</td>
			<td>-</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of viable adipocytes and stromal vascular fraction from human visceral adipose tissue suitable for rna analysis and macrophage phenotyping

Viszerales Fettgewebe (VAT) ist ein aktives Stoffwechselorgan, das hauptsächlich aus reifen Adipozyten und stromalen Gefäßfraktionszellen (SVF) besteht, die verschiedene bioaktive Moleküle freisetzen, die Stoffwechsel-, Hormon- und Immunprozesse steuern. Derzeit ist unklar, wie diese Prozesse im Fettgewebe reguliert werden. Daher ist die Entwicklung von Methoden zur Bewertung des Beitrags jeder Zellpopulation zur Pathophysiologie des Fettgewebes von entscheidender Bedeutung. Dieses Protokoll beschreibt die Isolierungsschritte und enthält die notwendigen Richtlinien zur Fehlerbehebung für die effiziente Isolierung lebensfähiger reifer Adipozyten und SVF aus humanen VAT-Biopsien in einem einzigen Prozess unter Verwendung einer enzymatischen Kollagenase-Verdautechnik. Darüber hinaus ist das Protokoll auch für die Identifizierung von Makrophagen-Untergruppen und die Isolierung reifer Adipozyten-RNA für Genexpressionsstudien optimiert, was die Durchführung von Studien zur Analyse der Interaktion zwischen diesen Zellpopulationen ermöglicht. Kurz gesagt, VAT-Biopsien werden gewaschen, mechanisch zerkleinert und verdaut, um eine Einzelzellsuspension zu erzeugen. Nach der Zentrifugation werden reife Adipozyten durch Flotation aus dem SVF-Pellet isoliert. Das RNA-Extraktionsprotokoll gewährleistet eine hohe Ausbeute an Gesamt-RNA (einschließlich miRNAs) aus Adipozyten für nachgeschaltete Expressionsassays. Gleichzeitig werden SVF-Zellen verwendet, um Makrophagen-Untergruppen (pro- und antiinflammatorischer Phänotyp) durch Durchflusszytometrie-Analyse zu charakterisieren.

Dieses Protokoll beschreibt eine enzymatische Methode, bei der Kollagenase-Verdau gefolgt von einer differentiellen Zentrifugation verwendet wird, um in einem einzigen Prozess lebensfähige reife Adipozyten und SVF-Zellen aus VAT-Biopsien zu isolieren, die von gesunden schwangeren Frauen nach partieller Omentektomie gewonnen wurden. In diesem Fall verwenden wir die Adipozyten für die RNA-Extraktion und die SVF für die Makrophagen-Phänotypisierung.
Das RNA-Extraktionsprotokoll ermöglichte e...

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Isolation of Viable Adipocytes and Stromal Vascular Fraction from Human Visceral Adipose Tissue Suitable for RNA Analysis and Macrophage Phenotyping

Dieses Protokoll bietet eine effiziente Kollagenase-Verdauungsmethode für die Isolierung lebensfähiger Adipozyten und stromaler vaskulärer Fraktions-SVF-Zellen aus menschlichem viszeralem Fett in einem einzigen Prozess, einschließlich einer Methodik zur Gewinnung hochwertiger RNA aus Adipozyten und einer Phänotypisierung von SVF-Makrophagen durch Färbung mehrerer membrangebundener Marker für die Analyse durch Durchflusszytometrie.

Isolierung lebensfähiger Adipozyten und stromaler vaskulärer Fraktion aus menschlichem viszeralem Fettgewebe, geeignet für RNA-Analyse und Makrophagen-Phänotypisierung

Visceral adipose tissue (VAT) is an active metabolic organ composed mainly of mature adipocytes and stromal vascular fraction (SVF) cells, which release ...

Research

JoVE Journal

Medicine

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