Name: isolation of viable adipocytes and stromal vascular fraction from human visceral adipose tissue suitable for rna analysis and macrophage phenotyping
Uploaded: 2020-10-27T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Viable Adipocytes and Stromal Vascular Fraction from Human Visceral Adipose Tissue Suitable for RNA Analysis and Macrophage Phenotyping at JoVE.c

מחקר זה נתמך על ידי המכון הלאומי לפרינטולוגיה (מספרי מענקים: 3300-11402-01-575-17 ו- 212250-3210-21002-06-15) ו- CONACyT, Fondo Sectorial de Investigacion en Salud y Seguridad Social (FOSISS) (מספר מענק 2015-3-2-61661).

פרוטוקול זה אושר על ידי IRB של המכון הלאומי לפרינטולוגיה (212250-3210-21002-06-15). ההשתתפות הייתה מרצון, וכל הנשים שנרשמו חתמו על טופס הסכמה מדעת.
1. איסוף רקמות שומן בטני
<ol><li>קבלת ביופסיות מע"מ באמצעות כריתה חלקית במהלך ניתוח קיסרי מנשים בוגרות בריאות עם הריונות סינגלטון במועד ללא ליד...

מע"מ משחק תפקיד מכריע בוויסות מטבולי ודלקת. העניין הגובר בתפקידם של אדיפוציטים ותאי מערכת החיסון בדלקת הכרונית הקשורה להשמנת יתר הוביל לפיתוח טכניקות שונות להפרדת תאי SVF ושומן הנמצאים ב- AT. עם זאת, רוב הטכניקות אינן מאפשרות להשיג את שתי קבוצות התאים השונות הללו הניתנות ליישום במורד הזרם מא...

רקמת השומן הלבן מורכבת לא רק מתאי שומן או אדיפוציטים, אלא גם ממקטע תאי שאינו שומן המכונה מקטע כלי דם סטרומה (SVF), המכיל אוכלוסיית תאים הטרוגנית המורכבת ממקרופאגים, תאי חיסון אחרים כתאי T רגולטוריים (Tregs), ואאוזינופילים, פרדיפוציטים ופיברובלסטים, המוקפים ברקמת כלי דם וחיבור 1,2. רקמת השומן (AT) נחשבת כיום לאיבר המווסת תהליכים פיזיולוגיים הקשורים לחילוף חומרים ודלקת באמצעות אדיפוקינים, ציטוקינים ומיקרו-רנ"א המיוצרים ומשוחררים על ידי תאים שונים לתוך הרקמה, עם השפעות אוטוקריניות, פרקריניות ואנדוקריניות 3,4. בבני אדם, רקמת השומן הלבן כוללת את רקמת השומן התת עורית (SAT) ואת רקמת השומן הקרבית (VAT), עם הבדלים אנטומיים, מולקולריים, תאיים ופיזיולוגיים חשובים ביניהן 2,5. SAT מייצג עד 80% של AT, בעוד מע"מ ממוקם בתוך חלל הבטן, בעיקר mesentery ו omentum, להיות פעיל יותר מטבולית6. יתר על כן, מע"מ הוא איבר אנדוקריני המפריש מתווכים בעלי השפעה משמעותית על משקל הגוף, רגישות לאינסולין, חילוף חומרים של שומנים ודלקות. כתוצאה מכך, הצטברות מע"מ מובילה להשמנה בטנית ולמחלות הקשורות להשמנת יתר כגון סוכרת מסוג 2, תסמונת מטבולית, יתר לחץ דם וסיכון למחלות לב וכלי דם, המייצגים מנבא טוב יותר לתמותה הקשורה להשמנת יתר 6,7,8,9.
בתנאים הומיאוסטטיים אדיפוציטים, מקרופאגים ותאי חיסון אחרים משתפים פעולה כדי לשמור על חילוף החומרים של מע"מ באמצעות הפרשת מתווכים אנטי דלקתיים10. עם זאת, הרחבת מע"מ מוגזמת מקדמת גיוס של תאי T פעילים, תאי NK ומקרופאגים. למעשה, במע"מ רזה, היחס בין המקרופאגים הוא 5%, בעוד שיחס זה עולה עד 50% בהשמנת יתר, כאשר קיטוב המקרופאגים מפנוטיפ אנטי דלקתי לפנוטיפ פרו-דלקתי, יוצר סביבה דלקתית כרונית10,11.
כתוצאה ממגפת ההשמנה, מספר מדהים של דיווחים עלו המתייחסים לנושאי מחקר שונים של מע"מ, כולל ביולוגיה של אדיפוציטים, אפיגנטיקה, דלקת, תכונות אנדוקריניות ואזורים מתפתחים כמו שלפוחיות חוץ-תאיות, בין היתר 8,10,12,13. עם זאת, למרות שסביבת המע"מ מוגדרת על ידי הצלבה בין אדיפוציטים לבין המקרופאגים המתגוררים או המגיעים, רוב המחקרים התמקדו באוכלוסיית תאים אחת בלבד, ויש מידע מועט על האינטראקציה של תאים אלה במע"מ והשלכותיהם הפתופיזיולוגיות11,14. יתר על כן, מחקרים יקרי ערך העוסקים ביחסי הגומלין בין אדיפוציט-מקרופאגים ב-AT בוצעו באמצעות קווי תאים, ללא תנאי הפריימינג in vivo 11,14,15. אסטרטגיה מתאימה לנתח את האינטראקציה או את התרומה המסוימת של תאים אלה במע"מ דורשת בידוד של שני סוגי התאים מאותה ביופסיית שומן כדי לבצע בדיקות במבחנה המשקפות דומות ככל האפשר את תכונות in vivo המווסתות את חילוף החומרים במע"מ.
למרות ששיטות הדיסוציאציה הלא-אנזימטיות המבוססות על כוחות מכניים לשבירת ה-AT מבטיחות מניפולציה מינימלית, לא ניתן להשתמש בשיטות אלה אם המטרה היא לחקור תאי SVF, מכיוון שיש להם יעילות נמוכה יותר בשחזור תאים ויכולת קיום נמוכה של תאים בהשוואה לשיטות אנזימטיות, ויש צורך בנפח רקמה גדול יותר16,17. עיכול אנזימטי באמצעות collagenase היא שיטה עדינה המאפשרת עיכול נאות של קולגן וחלבוני מטריצה חוץ תאיים של רקמות סיביות כגון WAT18 והוא משמש לעתים קרובות כאשר טריפסין אינו יעיל או מזיק19. הפרוטוקול מספק הנחיות בסיסיות לפתרון בעיות לבידוד יעיל של אדיפוציטים בוגרים ותאי SVF ברי קיימא מביופסיות מע"מ אנושיות בתהליך יחיד, תוך שימוש בטכניקת עיכול אנזימטי של קולגן-אז, ומספק מידע כדי להבטיח תפוקות גבוהות (כמות, טוהר ושלמות) של סך כל הרנ"א מאדיפוציטים בוגרים, כולל מיקרו-רנ"א, עבור יישומי ביטוי במורד הזרם. במקביל, הפרוטוקול מותאם לזיהוי תת-קבוצות מקרופאגים מתאי SVF באמצעות צביעה של סמנים מרובים הקשורים לקרום לצורך ניתוח נוסף על ידי ציטומטריית זרימה20.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 mL PCR tubes</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>PCR-02-C</td>
			<td>RNase, DNase free and nonpyrogenic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-150-C</td>
			<td>RNase, DNase free and nonpyrogenic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL serological pipettes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS4101-50EA</td>
			<td>Individually plastic wrapped</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#181;L universal pipet tip</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>T-300-L-R</td>
			<td>RNase, DNase free and nonpyrogenic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#181;L universal pipet tip</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>T-300-R-S</td>
			<td>RNase, DNase free and nonpyrogenic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 &#181;L universal pipet tip</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>T-1000-B-R</td>
			<td>RNase, DNase free and nonpyrogenic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.0 mL microcentrifuge tube</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-200-C</td>
			<td>RNase, DNase free and nonpyrogenic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#181;L universal pipet tip</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>T-200-Y-R</td>
			<td>RNase, DNase free and nonpyrogenic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2100 Bioanalyzer Instrument</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2939BA</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2101 Bioanalyzer PC</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2953CA</td>
			<td>2100 Expert Software pre-installed in PC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml Round Bottom Polystyrene Test Tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352003&#160;</td>
			<td>Snap cap, sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS430828-100EA</td>
			<td>Polipropilene, conical bottom and sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acid-guanidinium-phenol based reagent</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>R2050-1-200</td>
			<td>TRI Reagent or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent RNA 6000 Nano Kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-1511</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent Small RNA Kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-1548</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC/Cy7 anti-human CD14 Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>325620</td>
			<td>0.4 mg/106 cells, present on monocytes/macrophages, clone HCD14</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Baker</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>250 ml, non sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3912-100G</td>
			<td>Heat shock fraction, pH 5.2, &#8805;96%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chip priming station</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5065-9951</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase type II</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17101-015</td>
			<td>Powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270-100G</td>
			<td>Powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Direct-zol RNA Miniprep</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>R2051</td>
			<td>Supplied with 50 mL TRI reagen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting forceps</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Steel, serrated jaws and round ends</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection tray</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Stainless steel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl alcohol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E7023-500ML</td>
			<td>200&#160;proof, for molecular biology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS Flow Sheath Fluid</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>342003</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS Lysing Solution</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>349202</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSAria III Flow Cytometer/Cell Sorter</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>648282</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FASCDiva Software</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>642868</td>
			<td>Software v6.0 pre-installed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z359629-1EA</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manual cell counter</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mayo dissecting scisors</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Stainless steel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Adjustable temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ND2000LAPTOP</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Adjustable temperature and speed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P10&#160;variable volume&#160;micropipette&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific-Finnpipette</td>
			<td>4642040</td>
			<td>1 to 10 &#956;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P1000&#160;variable volume&#160;micropipette&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific-Finnpipette</td>
			<td>4642090</td>
			<td>100 to 1000 &#956;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P2&#160;variable volume&#160;micropipette&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific-Finnpipette</td>
			<td>4642010</td>
			<td>0.2 to 2 &#956;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P200&#160;variable volume&#160;micropipette&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific-Finnpipette</td>
			<td>4642080</td>
			<td>20 to 200 &#956;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR tube storage rack</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>R96PCRFSP</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE/Cy5 anti-human HLA-DR Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>307608</td>
			<td>0.0625 mg/106 cells, present on macrophages, clone L243</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE/Cy7 anti-human CD45 Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>304016</td>
			<td>0.1 mg/106 cells, present on leukocytes, clone H130</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3813-10PAK</td>
			<td>Powder, pH 7.4, for preparing 1 L solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette controller</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red Blood Cells Lysis Buffer</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11 814 389 001</td>
			<td>For preferential lysis of red blood cells from human whole blood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated centrifuge</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Whit adapter for 50 mL conical tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Specimen container</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipette</td>
			<td>Thermo Scientific-Samco</td>
			<td>204-1S</td>
			<td>Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250-061</td>
			<td>0.4% Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube racks</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>For different tube sizes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex Mini Shaker</td>
			<td>Cientifica SENNA</td>
			<td>BV101</td>
			<td>-</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of viable adipocytes and stromal vascular fraction from human visceral adipose tissue suitable for rna analysis and macrophage phenotyping

רקמת השומן הקרבי (VAT) היא איבר מטבולי פעיל המורכב בעיקר מאדיפוציטים בוגרים ותאי מקטע כלי דם סטרומליים (SVF), המשחררים מולקולות ביו-אקטיביות שונות השולטות בתהליכים מטבוליים, הורמונליים וחיסוניים; נכון לעכשיו, לא ברור כיצד תהליכים אלה מוסדרים בתוך רקמת השומן. לכן, פיתוח שיטות להערכת תרומתה של כל אוכלוסיית תאים לפתופיזיולוגיה של רקמת השומן הוא קריטי. פרוטוקול זה מתאר את שלבי הבידוד ומספק את הנחיות פתרון הבעיות הדרושות לבידוד יעיל של אדיפוציטים בוגרים ברי קיימא ו- SVF מביופסיות מע"מ אנושיות בתהליך יחיד, תוך שימוש בטכניקת עיכול אנזימטית של collagenase. יתר על כן, הפרוטוקול מותאם גם לזיהוי תת-קבוצות מקרופאגים ולביצוע בידוד RNA אדיפוציט בוגר למחקרי ביטוי גנים, המאפשר ביצוע מחקרים המנתחים את האינטראקציה בין אוכלוסיות תאים אלה. בקצרה, ביופסיות מע"מ נשטפות, טחונות באופן מכני ומתעכלות כדי ליצור תרחיף חד-תאי. לאחר הצנטריפוגה, אדיפוציטים בוגרים מבודדים על ידי הנפקה מכדורית SVF. פרוטוקול מיצוי ה-RNA מבטיח תפוקה גבוהה של סך ה-RNA (כולל miRNAs) מהאדיפוציטים לצורך בדיקות ביטוי במורד הזרם. במקביל, תאי SVF משמשים לאפיון תת-קבוצות מקרופאגים (פנוטיפ פרו ואנטי דלקתי) באמצעות ניתוח ציטומטריית זרימה.

פרוטוקול זה מתאר שיטה אנזימטית המשתמשת בעיכול collagenase ואחריו צנטריפוגה דיפרנציאלית כדי לבודד, בתהליך יחיד, אדיפוציטים בוגרים קיימא ותאי SVF מביופסיות מע"מ המתקבלות מנשים הרות בריאות לאחר כריתה חלקית. במקרה זה, אנו משתמשים באדיפוציטים עבור מיצוי RNA וב- SVF עבור פנוטיפ מקרופאגים.
<p class="jove_content"...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Viable Adipocytes and Stromal Vascular Fraction from Human Visceral Adipose Tissue Suitable for RNA Analysis and Macrophage Phenotyping at JoVE.c

Isolation of Viable Adipocytes and Stromal Vascular Fraction from Human Visceral Adipose Tissue Suitable for RNA Analysis and Macrophage Phenotyping

פרוטוקול זה מספק שיטת עיכול יעילה של collagenase לבידוד של אדיפוציטים בני קיימא ותאי SVF של מקטע כלי דם סטרומה משומן בטני אנושי בתהליך יחיד, כולל מתודולוגיה להשגת RNA באיכות גבוהה מאדיפוציטים ופנוטיפפיקציה של SVF-מקרופאגים באמצעות צביעה של סמנים מרובים הקשורים לממברנה לניתוח על ידי ציטומטריית זרימה.

בידוד אדיפוציטים בני קיימא ומקטע כלי דם סטרומלי מרקמת השומן הקרבית האנושית המתאימה לניתוח RNA ופנוטיפ מקרופאגים

Visceral adipose tissue (VAT) is an active metabolic organ composed mainly of mature adipocytes and stromal vascular fraction (SVF) cells, which release ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Isolation of Human Islets from Partially Pancreatectomized Patients

הבידוד של איי האדם מן המטופלים Pancreatectomized חלקית

Investigations into the pathogenesis of type 2 diabetes and islets of Langerhans malfunction 1 have been hampered by the limited availability of type 2 ...

Experimental Generation of Carcinoma-Associated Fibroblasts (CAFs) from Human Mammary Fibroblasts

Experimental Generation of Carcinoma-Associated Fibroblasts CAFs from Human Mammary Fibroblasts

הדור ניסויית של קרצינומה-Associated Fibroblasts (CAFs) מ Fibroblasts החלב אנוש

Carcinomas are complex tissues comprised of neoplastic cells and a non-cancerous compartment referred to as the 'stroma'. The stroma consists of ...

Isolation of Cardiomyocyte Nuclei from Post-mortem Tissue

הבידוד של גרעיני Cardiomyocyte מרקמות שלאחר המוות

Identification of cardiomyocyte nuclei has been challenging in tissue sections as most strategies rely only on cytoplasmic marker proteins1. Rare events ...

Encapsulation Thermogenic Preadipocytes for Transplantation into Adipose Tissue Depots

Encapsulation תרמוגנית Preadipocytes להשתלה לבסיס מיון רקמת שומן

Cell encapsulation was developed to entrap viable cells within semi-permeable membranes. The engrafted encapsulated cells can exchange low molecular ...

Isolation and Cellular Phenotyping of Mesenchymal Stem Cells Derived from Synovial Fluid and Bone Marrow of Minipigs

בידוד נייד phenotyping של בתאי גזע mesenchymal נגזר הסינוביאלי נוזל מח עצם של Minipigs

Mesenchymal stem cells (MSCs) have been established after isolation from various tissue sources, including bone marrow and synovial fluid. Recently, ...

Stromal Vascular Fraction-enriched Fat Grafting for the Treatment of Symptomatic End-neuromata

סטרומה כלי דם מועשר שבר השמן הרכבה לטיפול סימפטומטי סוף-neuromata

The purpose of this study was to methodically illustrate and highlight the crucial steps of stromal vascular fraction (SVF)-enriched fat grafting as a ...

Assessment of Human Adipose Tissue Microvascular Function Using Videomicroscopy

הערכה של רקמת שומן אנושי הפונקציה Microvascular באמצעות Videomicroscopy

While obesity is closely linked to the development of metabolic and cardiovascular disease, little is known about mechanisms that govern these processes. ...

Isolation of Atrial Cardiomyocytes from a Rat Model of Metabolic Syndrome-related Heart Failure with Preserved Ejection Fraction

בידוד של פרפור Cardiomyocytes ממודל עכברוש מטבוליות הקשורות תסמונת באי ספיקת לב עם שבריר פליטה משומר

In this article, we describe an optimized, Langendorff-based procedure for the isolation of single-cell atrial cardiomyocytes (ACMs) from a rat model of ...

Clinical Protocol of Producing Adipose Tissue-Derived Stromal Vascular Fraction for Potential Cartilage Regeneration

פרוטוקול קליני של ייצור רקמת שומן-Derived השבר בכלי הדם סטרומה עבור פוטנציאל התחדשות הסחוס

Osteoarthritis (OA) is one of the most common debilitating disorders.&#160;Recently, numerous attempts have been made to improve the functions of the ...

Isolation of Adipose Derived Regenerative Cells for the Treatment of Erectile Dysfunction Following Radical Prostatectomy

בידוד של תאים רגנרטיביים שמקורם בשומן לטיפול בבעיות זיקפה בעקבות כריתת ערמונית רדיקלית

Stem cells are used in many research areas within regenerative medicine in part because these treatments can be curative rather than symptomatic. Stem ...