Name: isolation of viable adipocytes and stromal vascular fraction from human visceral adipose tissue suitable for rna analysis and macrophage phenotyping
Uploaded: 2020-10-27T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Viable Adipocytes and Stromal Vascular Fraction from Human Visceral Adipose Tissue Suitable for RNA Analysis and Macrophage Phenotyping at JoVE.c

Questo studio è stato sostenuto dall'Instituto Nacional de Perinatologia (numeri di sovvenzione: 3300-11402-01-575-17 e 212250-3210-21002-06-15) e dal CONACyT, Fondo Sectorial de Investigación en Salud y Seguridad Social (FOSISS) (numero di sovvenzione 2015-3-2-61661).

Questo protocollo è stato approvato dall'IRB dell'Instituto Nacional de Perinatologia (212250-3210-21002-06-15). La partecipazione era volontaria e tutte le donne iscritte hanno firmato il modulo di consenso informato.
1. Prelievo di tessuto adiposo viscerale
<ol><li>Ottenere biopsie IVA attraverso omentectomia parziale durante il taglio cesareo da donne adulte sane con gravidanze singole a termine senza travaglio.</li>
	<li>Dopo la chiusura uterina e l'emostasi, procedere all'individuazion...

L'IVA svolge un ruolo cruciale nella regolazione metabolica e nell'infiammazione. Il crescente interesse per il ruolo degli adipociti e delle cellule immunitarie nell'infiammazione cronica associata all'obesità ha portato allo sviluppo di diverse tecniche per separare la SVF e le cellule adipose presenti nell'AT. Tuttavia, la maggior parte delle tecniche non consente di ottenere questi due diversi set di cellule utilizzabili per applicazioni a valle dalla stessa biopsia VAT in un'unica procedura, il che potrebbe essere ...

Il tessuto adiposo bianco è composto non solo da cellule adipose o adipociti, ma anche da una frazione di cellule non adipose nota come frazione vascolare stromale (SVF), che contiene una popolazione cellulare eterogenea costituita da macrofagi, altre cellule immunitarie come cellule T regolatorie (Treg) ed eosinofili, preadipociti e fibroblasti, circondati da tessuto vascolare e connettivo 1,2. Il tessuto adiposo (AT) è oggi considerato un organo che regola i processi fisiologici legati al metabolismo e all'infiammazione attraverso adipochine, citochine e microRNA prodotti e rilasciati da diverse cellule nel tessuto, con effetti autocrini, paracrini ed endocrini 3,4. Nell'uomo, il tessuto adiposo bianco comprende il tessuto adiposo sottocutaneo (SAT) e il tessuto adiposo viscerale (VAT), con importanti differenze anatomiche, molecolari, cellulari e fisiologiche tra loro 2,5. Il SAT rappresenta fino all'80% dell'AT umano, mentre il VAT si trova all'interno della cavità addominale, principalmente nel mesentere e nell'omento, essendo metabolicamente più attivo6. Inoltre, il VAT è un organo endocrino che secerne mediatori con un impatto sostanziale sul peso corporeo, sulla sensibilità all'insulina, sul metabolismo lipidico e sull'infiammazione. Di conseguenza, l'accumulo di IVA porta all'obesità addominale e alle malattie correlate all'obesità come il diabete di tipo 2, la sindrome metabolica, l'ipertensione e il rischio di malattie cardiovascolari, rappresentando un migliore predittore della mortalità associata all'obesità 6,7,8,9.
In condizioni omeostatiche, gli adipociti, i macrofagi e le altre cellule immunitarie cooperano per mantenere il metabolismo dell'IVA attraverso la secrezione di mediatori antinfiammatori10. Tuttavia, l'eccessiva espansione dell'IVA promuove il reclutamento di cellule T attivate, cellule NK e macrofagi. Infatti, nel VAT magra, il rapporto dei macrofagi è del 5%, mentre questo rapporto sale fino al 50% nell'obesità, con polarizzazione dei macrofagi dal fenotipo antinfiammatorio a quello pro-infiammatorio, generando un ambiente infiammatorio cronico10,11.
Come conseguenza della pandemia di obesità, è sorto un numero sorprendente di rapporti che affrontano diversi argomenti di ricerca IVA, tra cui la biologia degli adipociti, l'epigenetica, l'infiammazione, le proprietà endocrine e le aree emergenti come le vescicole extracellulari, tra gli altri 8,10,12,13. Tuttavia, sebbene l'ambiente VAT sia definito dal crosstalk tra gli adipociti e i macrofagi residenti o in arrivo, la maggior parte degli studi si è concentrata su una sola popolazione cellulare e ci sono scarse informazioni sull'interazione di queste cellule in VAT e sulle loro conseguenze fisiopatologiche11,14. Inoltre, sono stati condotti preziosi studi sull'interazione adipocita-macrofagi nell'AT utilizzando linee cellulari, prive delle condizioni di priming in vivo 11,14,15. Una strategia adeguata per sezionare l'interazione o il particolare contributo di queste cellule in VAT richiede l'isolamento di entrambi i tipi di cellule dalla stessa biopsia adiposa per eseguire saggi in vitro che rispecchino il più possibile le proprietà in vivo che regolano il metabolismo del VAT.
Sebbene i metodi di dissociazione non enzimatica basati su forze meccaniche per rompere l'AT garantiscano una manipolazione minima, questi metodi non possono essere utilizzati se l'obiettivo è quello di studiare le cellule SVF, poiché hanno una minore efficienza nel recupero cellulare e una bassa vitalità cellulare rispetto ai metodi enzimatici, ed è necessario un volume maggiore di tessuto16,17. La digestione enzimatica con collagenasi è un metodo delicato che consente un'adeguata digestione del collagene e delle proteine della matrice extracellulare dei tessuti fibrosi come il WAT18 ed è spesso utilizzato quando la tripsina è inefficace o dannosa19. Il protocollo fornisce linee guida fondamentali per la risoluzione dei problemi per l'isolamento efficiente di adipociti maturi vitali e cellule SVF da biopsie umane VAT in un unico processo, utilizzando una tecnica di digestione enzimatica della collagenasi, fornendo informazioni per garantire rese elevate (quantità, purezza e integrità) di RNA totale da adipociti maturi, compresi i microRNA, per applicazioni di espressione a valle. Allo stesso tempo, il protocollo è ottimizzato per identificare sottogruppi di macrofagi da cellule SVF attraverso la colorazione di più marcatori legati alla membrana per ulteriori analisi mediante citometria a flusso20.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 mL PCR tubes</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>PCR-02-C</td>
			<td>RNase, DNase free and nonpyrogenic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-150-C</td>
			<td>RNase, DNase free and nonpyrogenic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL serological pipettes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS4101-50EA</td>
			<td>Individually plastic wrapped</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#181;L universal pipet tip</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>T-300-L-R</td>
			<td>RNase, DNase free and nonpyrogenic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#181;L universal pipet tip</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>T-300-R-S</td>
			<td>RNase, DNase free and nonpyrogenic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 &#181;L universal pipet tip</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>T-1000-B-R</td>
			<td>RNase, DNase free and nonpyrogenic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.0 mL microcentrifuge tube</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-200-C</td>
			<td>RNase, DNase free and nonpyrogenic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#181;L universal pipet tip</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>T-200-Y-R</td>
			<td>RNase, DNase free and nonpyrogenic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2100 Bioanalyzer Instrument</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2939BA</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2101 Bioanalyzer PC</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2953CA</td>
			<td>2100 Expert Software pre-installed in PC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml Round Bottom Polystyrene Test Tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352003&#160;</td>
			<td>Snap cap, sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS430828-100EA</td>
			<td>Polipropilene, conical bottom and sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acid-guanidinium-phenol based reagent</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>R2050-1-200</td>
			<td>TRI Reagent or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent RNA 6000 Nano Kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-1511</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent Small RNA Kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-1548</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC/Cy7 anti-human CD14 Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>325620</td>
			<td>0.4 mg/106 cells, present on monocytes/macrophages, clone HCD14</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Baker</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>250 ml, non sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3912-100G</td>
			<td>Heat shock fraction, pH 5.2, &#8805;96%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chip priming station</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5065-9951</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase type II</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17101-015</td>
			<td>Powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270-100G</td>
			<td>Powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Direct-zol RNA Miniprep</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>R2051</td>
			<td>Supplied with 50 mL TRI reagen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting forceps</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Steel, serrated jaws and round ends</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection tray</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Stainless steel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl alcohol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E7023-500ML</td>
			<td>200&#160;proof, for molecular biology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS Flow Sheath Fluid</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>342003</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS Lysing Solution</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>349202</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSAria III Flow Cytometer/Cell Sorter</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>648282</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FASCDiva Software</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>642868</td>
			<td>Software v6.0 pre-installed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z359629-1EA</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manual cell counter</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mayo dissecting scisors</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Stainless steel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Adjustable temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ND2000LAPTOP</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Adjustable temperature and speed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P10&#160;variable volume&#160;micropipette&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific-Finnpipette</td>
			<td>4642040</td>
			<td>1 to 10 &#956;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P1000&#160;variable volume&#160;micropipette&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific-Finnpipette</td>
			<td>4642090</td>
			<td>100 to 1000 &#956;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P2&#160;variable volume&#160;micropipette&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific-Finnpipette</td>
			<td>4642010</td>
			<td>0.2 to 2 &#956;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P200&#160;variable volume&#160;micropipette&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific-Finnpipette</td>
			<td>4642080</td>
			<td>20 to 200 &#956;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR tube storage rack</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>R96PCRFSP</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE/Cy5 anti-human HLA-DR Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>307608</td>
			<td>0.0625 mg/106 cells, present on macrophages, clone L243</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE/Cy7 anti-human CD45 Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>304016</td>
			<td>0.1 mg/106 cells, present on leukocytes, clone H130</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3813-10PAK</td>
			<td>Powder, pH 7.4, for preparing 1 L solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette controller</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red Blood Cells Lysis Buffer</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11 814 389 001</td>
			<td>For preferential lysis of red blood cells from human whole blood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated centrifuge</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Whit adapter for 50 mL conical tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Specimen container</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipette</td>
			<td>Thermo Scientific-Samco</td>
			<td>204-1S</td>
			<td>Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250-061</td>
			<td>0.4% Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube racks</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>For different tube sizes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex Mini Shaker</td>
			<td>Cientifica SENNA</td>
			<td>BV101</td>
			<td>-</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of viable adipocytes and stromal vascular fraction from human visceral adipose tissue suitable for rna analysis and macrophage phenotyping

Il tessuto adiposo viscerale (VAT) è un organo metabolico attivo composto principalmente da adipociti maturi e cellule della frazione vascolare stromale (SVF), che rilasciano diverse molecole bioattive che controllano i processi metabolici, ormonali e immunitari; Attualmente, non è chiaro come questi processi siano regolati all'interno del tessuto adiposo. Pertanto, lo sviluppo di metodi che valutino il contributo di ciascuna popolazione cellulare alla fisiopatologia del tessuto adiposo è cruciale. Questo protocollo descrive le fasi di isolamento e fornisce le linee guida necessarie per la risoluzione dei problemi per un isolamento efficiente di adipociti maturi vitali e SVF da biopsie umane di VAT in un unico processo, utilizzando una tecnica di digestione enzimatica della collagenasi. Inoltre, il protocollo è anche ottimizzato per identificare sottogruppi di macrofagi ed eseguire l'isolamento dell'RNA degli adipociti maturi per studi di espressione genica, che consente di eseguire studi che sezionano l'interazione tra queste popolazioni cellulari. In breve, le biopsie VAT vengono lavate, tritate meccanicamente e digerite per generare una sospensione unicellulare. Dopo la centrifugazione, gli adipociti maturi vengono isolati mediante flottazione dal pellet SVF. Il protocollo di estrazione dell'RNA garantisce un'elevata resa di RNA totale (compresi i miRNA) dagli adipociti per i saggi di espressione a valle. Allo stesso tempo, le cellule SVF vengono utilizzate per caratterizzare sottogruppi di macrofagi (fenotipo pro- e anti-infiammatorio) attraverso l'analisi della citometria a flusso.

Questo protocollo descrive un metodo enzimatico che utilizza la digestione della collagenasi seguita da centrifugazione differenziale per isolare, in un unico processo, adipociti maturi vitali e cellule SVF da biopsie VAT ottenute da donne in gravidanza sane dopo omentectomia parziale. In questo caso, utilizziamo gli adipociti per l'estrazione dell'RNA e la SVF per la fenotipizzazione dei macrofagi.
Il protocollo di estrazione dell'RNA ha permesso di ottenere RNA con un'elevata integrità, e R...

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Isolation of Viable Adipocytes and Stromal Vascular Fraction from Human Visceral Adipose Tissue Suitable for RNA Analysis and Macrophage Phenotyping

Questo protocollo fornisce un metodo efficiente di digestione della collagenasi per l'isolamento di adipociti vitali e cellule di frazione vascolare stromale-SVF dal grasso viscerale umano in un unico processo, compresa la metodologia per ottenere RNA di alta qualità dagli adipociti e la fenotipizzazione dei macrofagi SVF attraverso la colorazione di più marcatori legati alla membrana per l'analisi mediante citometria a flusso.

Isolamento di adipociti vitali e frazione vascolare stromale dal tessuto adiposo viscerale umano adatto per l'analisi dell'RNA e la fenotipizzazione dei macrofagi

Visceral adipose tissue (VAT) is an active metabolic organ composed mainly of mature adipocytes and stromal vascular fraction (SVF) cells, which release ...

This protocol allows for isolation and study of viable adipocytes and stromal vascular fraction SVF cells from human visceral fat. Enzymatic digestion using collagenase ensures high yields of total RNA from mature adipocytes, including microRNAs suitable for expression analysis. Simultaneously, the method is optimized to identify macrophages by flow cytometry.This protocol provides fundamental troubleshooting guidelines for easy and efficient isolation of viable mature adipocytes and SVF cells from human VAT biopsies in a single process. After the uterine closure and hemostasis, identify greater omentum and extend it on a wet compress. Identify an avascular zone and use Kelly forceps to drill the outer side of visceral adipose tissue, or VAT.Use Ochsner forceps to clamp the proximal and distal side in the zone where VAT was drilled, and used Metzenbaum scissors to cut the tissue. Tie the greater omentum with black silk number one, then remove the Ochsner forceps and evaluate the hemostasis. To perform enzymatic digestion, cut four grams of VAT and use scissors to mince the tissue into small pieces in a dissection tray.Transfer the pieces to a new sterile 50-milliliter centrifuge tube and add 25 milliliters of digestion solution. Incubate the tube at 37 degrees Celsius for 60 minutes in an orbital shaker at 125 RPM. Then filter the digested tissue through three layers of gauze into a new sterile 50-milliliter centrifuge tube.Centrifuge the tube at 200 G for five minutes at four degrees Celsius. After centrifugation, two phases should be visible. The upper phase corresponds to mature adipocytes while SVF cells remain in the pellet.Transfer the mature adipocytes to a tube. Lyse cells by adding 1000 microliters of acid-guanidinium-phenol-based reagent and mix thoroughly with a P1000 micropipette to homogenize. Incubate the mixture for five minutes at room temperature to boost dissociation of nucleo-protein complexes.Centrifuge the cell lysate for five minutes at 12, 000 G to obtain three phases, an upper yellow phase corresponding to adipocyte lipids, a middle pink phase corresponding to nucleic acids, and a pellet with cellular debris. Carefully remove the lipid layer with a P200 micro pipette. Then transfer the middle phase into a new two-milliliter tube, taking care not to disturb the other phases.After purifying the RNA and measuring the concentration with a UV visible spectrophotometer, use an RNA integrity kit to determine the RNA integrity number. Then use the small RNA kit to determine the concentration and percent of microRNAs. Place the clip into a bioanalyzer.Dilute 10 microliters of SVF cell suspension into 90 microliters of 0.4%trypan blue solution, and apply 10 microliters to a standard hemocytometer. Count the viable cells carefully, excluding the dead cells, in four squares at the corner of the counting chamber. Transfer a total of 1 million SVF cells per milliliter to a five-milliliter round-bottom polypropylene test tube for flow cytometry and pellet the cells by centrifugation at 800 G for five minutes at four degrees Celsius.Vortex carefully to loosen the pellet and resuspend the cells in 100 microliters of PBS. Add the pre-titrated optimal concentration of each fluorochrome-conjugated monoclonal antibody specific for a cell surface antigen and mix gently, then incubate the cells for 15 minutes in the dark. Add an excess of cold PBS.And centrifuge the SVF at 400 G for five minutes at four degrees Celsius. Decant the supernatant, taking care to not disturb the pellet. Resuspend the pellet in five milliliters of sheath fluid.Then filter the cells through three layers of gauze into a new five-milliliter round-bottom polypropylene test tube. Vortex each tube briefly before analysis and count a minimum of 10, 000 events for flow analysis. This RNA extraction protocol was used to obtain adequate purity and high integrity RNA and microRNAs from mature adipocytes.The RNA integrity was assessed by an RNA quality control analyzer. Approximately 2.8 times 10 to the six nucleated cells were present per gram of visceral adipose tissue. The stromal vascular fraction cells were labeled with fluorophore-conjugated primary antibodies to identify and characterize 18 macrophages by fluorescence-activated cell-sorting analysis.Cell aggregates were eliminated from analysis by plotting the forward scatter area versus forward scatter height. Then cellular debris was excluded by gating the cells, based on the correct size and complexity, using forward scatter area and the side scatter area. To analyze macrophages, the monocyte and macrophage lineage cells were selected using CD45 and CD14 markers.Subsequently, the CD45-CD14 double positive cells were separated based on macrophage marker HLA-DR expression. Two subsets of macrophages were identified. In addition to identifying new cell phenotypes, this protocol makes it possible to use purified cell populations for future analyses, such as DNA methylation, post-translational modifications, and signaling pathways.

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