Name: isolation of viable adipocytes and stromal vascular fraction from human visceral adipose tissue suitable for rna analysis and macrophage phenotyping
Uploaded: 2020-10-27T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Viable Adipocytes and Stromal Vascular Fraction from Human Visceral Adipose Tissue Suitable for RNA Analysis and Macrophage Phenotyping at JoVE.c

本研究は、Instituto Nacional de Perinatologia(助成金番号:3300-11402-01-575-17および212250-3210-21002-06-15)およびCONACyT, Fondo Sectorial de Investigacion en Salud y Seguridad Social(FOSISS)(認可番号2015-3-2-61661)の支援を受けて行われました。

このプロトコルは、Instituto Nacional de Perinatologia (212250-3210-21002-06-15) の IRB によって承認されました。参加は任意であり、登録されたすべての女性がインフォームドコンセントフォームに署名しました。
1. 内臓脂肪組織採取
<ol><li>分娩のない正期産の単胎妊娠の健康な成人女性から帝王切開中の部分的大網切除術を通じてVAT生検を取得します。</li>
	<li>子宮閉鎖と止血の後...

VATは、代謝調節と炎症に重要な役割を果たします。肥満に伴う慢性炎症における脂肪細胞と免疫細胞の役割への関心の高まりにより、ATに存在するSVF細胞と脂肪細胞を分離するためのさまざまな技術が開発されています。しかし、ほとんどの技術では、脂肪細胞とSVF細胞の相互作用に関する研究に不可欠な、同じVAT生検から下流のアプリケーションに有効なこれら2つの異なる細胞セットを1回...

白色脂肪組織は、脂肪細胞や脂肪細胞だけでなく、マクロファージ、制御性T細胞(Treg)としての免疫細胞、好酸球、前駆脂肪細胞、線維芽細胞からなる不均一な細胞集団を含む間質血管分画(SVF)と呼ばれる非脂肪細胞分画で構成されており、血管組織や結合組織に囲まれています1,2。.現在、脂肪組織(AT)は、アディポカイン、サイトカイン、マイクロRNAを介して代謝と炎症に関連する生理学的プロセスを調節する器官と見なされており、さまざまな細胞によって組織に生成および放出され、自己分泌、パラクリン、および内分泌の影響を受けます3,4。ヒトでは、白色脂肪組織は皮下脂肪組織(SAT)と内臓脂肪組織(VAT)で構成され、それらの間には重要な解剖学的、分子的、細胞的、および生理学的違いがあります2,5。SATはヒトのATの最大80%を占めていますが、VATは腹腔内、主に腸間膜と大網にあり、代謝的により活発です6。さらに、VATはメディエーターを分泌する内分泌器官であり、体重、インスリン感受性、脂質代謝、炎症に大きな影響を与えます。その結果、VATの蓄積は、腹部肥満や、2型糖尿病、メタボリックシンドローム、高血圧、心血管疾患リスクなどの肥満関連疾患につながり、肥満関連死亡率のより良い予測因子となります6,7,8,9。
恒常性維持状態では、脂肪細胞、マクロファージ、およびその他の免疫細胞が協力して、抗炎症メディエーターの分泌を介してVAT代謝を維持します10。しかし、VATを過度に拡大すると、活性化T細胞、NK細胞、マクロファージの動員が促進されます。実際、除脂肪VATでは、マクロファージの比率は5%ですが、肥満ではこの比率が最大50%まで上昇し、マクロファージが抗炎症性から炎症誘発性の表現型に二極化し、慢性炎症環境を生成します10,11。
肥満のパンデミックの結果として、脂肪細胞生物学、エピジェネティクス、炎症、内分泌特性、細胞外小胞などの新興領域など、さまざまなVAT研究トピックを扱う驚くべき数の報告が発生しています8,10,12,13。しかし、VAT環境は脂肪細胞と常在マクロファージまたは到着マクロファージとの間のクロストークによって定義されますが、ほとんどの研究は1つの細胞集団のみに焦点を当てており、VATにおけるこれらの細胞の相互作用とその病態生理学的影響に関する情報はほとんどありません11,14。さらに、ATにおける脂肪細胞とマクロファージの相互作用に対処する貴重な研究は、in vivoプライミング条件を欠いた細胞株を使用して行われました11,14,15。VATにおけるこれらの細胞の相互作用または特定の寄与を解剖する適切な戦略では、VAT代謝を調節するin vivo特性を可能な限り類似したin vitroアッセイを実施するために、同じ脂肪生検から両方の細胞タイプを単離する必要があります。
ATを破壊する機械的力に基づく非酵素的解離法は、最小限の操作を保証しますが、酵素法と比較して細胞回収効率が低く、細胞生存率が低く、より多くの組織が必要になるため、SVF細胞を研究することを目的としている場合は使用できません16,17。.コラゲナーゼを用いた酵素消化は、WAT18などの線維組織のコラーゲンや細胞外マトリックスタンパク質を適切に消化できる穏やかな方法であり、トリプシンが効果がない、または損傷を与える場合によく使用される19。プロトコルはコラゲナーゼの酵素の消化力の技術を使用して単一のプロセスの人間のVATのバイオプシーから実行可能な成長した脂肪細胞そしてSVFのセルの有効な隔離のための基本的なトラブルシューティングの指針を、与える下流の表現の適用のためのmicroRNAsを含む成長した脂肪細胞からの総RNAの高収率(量、純度および完全性)を、保障するために情報を提供する。同時に、プロトコルは、フローサイトメトリー20によるさらなる分析のために、複数の膜結合マーカーの染色を通じてSVF細胞からのマクロファージサブセットを識別するように最適化されています。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 mL PCR tubes</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>PCR-02-C</td>
			<td>RNase, DNase free and nonpyrogenic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-150-C</td>
			<td>RNase, DNase free and nonpyrogenic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL serological pipettes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS4101-50EA</td>
			<td>Individually plastic wrapped</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#181;L universal pipet tip</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>T-300-L-R</td>
			<td>RNase, DNase free and nonpyrogenic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#181;L universal pipet tip</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>T-300-R-S</td>
			<td>RNase, DNase free and nonpyrogenic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 &#181;L universal pipet tip</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>T-1000-B-R</td>
			<td>RNase, DNase free and nonpyrogenic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.0 mL microcentrifuge tube</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-200-C</td>
			<td>RNase, DNase free and nonpyrogenic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#181;L universal pipet tip</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>T-200-Y-R</td>
			<td>RNase, DNase free and nonpyrogenic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2100 Bioanalyzer Instrument</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2939BA</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2101 Bioanalyzer PC</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2953CA</td>
			<td>2100 Expert Software pre-installed in PC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml Round Bottom Polystyrene Test Tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352003&#160;</td>
			<td>Snap cap, sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS430828-100EA</td>
			<td>Polipropilene, conical bottom and sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acid-guanidinium-phenol based reagent</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>R2050-1-200</td>
			<td>TRI Reagent or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent RNA 6000 Nano Kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-1511</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent Small RNA Kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-1548</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC/Cy7 anti-human CD14 Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>325620</td>
			<td>0.4 mg/106 cells, present on monocytes/macrophages, clone HCD14</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Baker</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>250 ml, non sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3912-100G</td>
			<td>Heat shock fraction, pH 5.2, &#8805;96%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chip priming station</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5065-9951</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase type II</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17101-015</td>
			<td>Powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270-100G</td>
			<td>Powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Direct-zol RNA Miniprep</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>R2051</td>
			<td>Supplied with 50 mL TRI reagen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting forceps</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Steel, serrated jaws and round ends</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection tray</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Stainless steel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl alcohol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E7023-500ML</td>
			<td>200&#160;proof, for molecular biology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS Flow Sheath Fluid</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>342003</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS Lysing Solution</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>349202</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSAria III Flow Cytometer/Cell Sorter</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>648282</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FASCDiva Software</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>642868</td>
			<td>Software v6.0 pre-installed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z359629-1EA</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manual cell counter</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mayo dissecting scisors</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Stainless steel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Adjustable temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ND2000LAPTOP</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Adjustable temperature and speed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P10&#160;variable volume&#160;micropipette&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific-Finnpipette</td>
			<td>4642040</td>
			<td>1 to 10 &#956;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P1000&#160;variable volume&#160;micropipette&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific-Finnpipette</td>
			<td>4642090</td>
			<td>100 to 1000 &#956;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P2&#160;variable volume&#160;micropipette&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific-Finnpipette</td>
			<td>4642010</td>
			<td>0.2 to 2 &#956;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P200&#160;variable volume&#160;micropipette&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific-Finnpipette</td>
			<td>4642080</td>
			<td>20 to 200 &#956;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR tube storage rack</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>R96PCRFSP</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE/Cy5 anti-human HLA-DR Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>307608</td>
			<td>0.0625 mg/106 cells, present on macrophages, clone L243</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE/Cy7 anti-human CD45 Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>304016</td>
			<td>0.1 mg/106 cells, present on leukocytes, clone H130</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3813-10PAK</td>
			<td>Powder, pH 7.4, for preparing 1 L solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette controller</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red Blood Cells Lysis Buffer</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11 814 389 001</td>
			<td>For preferential lysis of red blood cells from human whole blood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated centrifuge</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Whit adapter for 50 mL conical tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Specimen container</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipette</td>
			<td>Thermo Scientific-Samco</td>
			<td>204-1S</td>
			<td>Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250-061</td>
			<td>0.4% Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube racks</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>For different tube sizes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex Mini Shaker</td>
			<td>Cientifica SENNA</td>
			<td>BV101</td>
			<td>-</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of viable adipocytes and stromal vascular fraction from human visceral adipose tissue suitable for rna analysis and macrophage phenotyping

内臓脂肪組織(VAT)は、主に成熟脂肪細胞と間質血管分(SVF)細胞で構成される活発な代謝器官であり、代謝、ホルモン、および免疫プロセスを制御するさまざまな生理活性分子を放出します。現在のところ、これらのプロセスが脂肪組織内でどのように制御されているかは不明です。したがって、脂肪組織の病態生理学に対する各細胞集団の寄与を評価する方法の開発は非常に重要です。このプロトコルでは、単離手順を説明し、コラゲナーゼ酵素消化技術を使用して、単一のプロセスでヒトVAT生検から生存可能な成熟脂肪細胞およびSVFを効率的に分離するために必要なトラブルシューティングガイドラインを提供します。さらに、プロトコルはまたマクロファージのサブセットを識別し、これらのセル集団間の相互作用を解剖する調査を行うことを可能にする遺伝子発現の調査のための成熟した脂肪細胞のRNAの隔離を行うために最大限に活用される。簡単に言うと、VAT生検を洗浄し、機械的に細かく刻み、消化して単一細胞懸濁液を生成します。遠心分離後、成熟脂肪細胞は浮遊選鉱によりSVFペレットから単離されます。RNA抽出プロトコルは、下流の発現アッセイのために脂肪細胞からの総RNA(miRNAを含む)の高収率を保証します。同時に、SVF細胞を使用して、フローサイトメトリー解析を通じてマクロファージサブセット(炎症誘発性および抗炎症性表現型)を特徴付けます。

このプロトコルは部分的なomentectomyの後で健康な妊婦から得られるVATのバイオプシーから、単一のプロセスで、実行可能な成熟した脂肪細胞およびSVFのセルを隔離するために差動遠心分離に続くコラゲナーゼの消化力を使用して酵素方法を記述する。この場合、RNA抽出には脂肪細胞を、マクロファージ表現型にはSVFを使用します。
RNA抽出プロトコルにより、成熟脂肪細胞...

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Isolation of Viable Adipocytes and Stromal Vascular Fraction from Human Visceral Adipose Tissue Suitable for RNA Analysis and Macrophage Phenotyping

このプロトコルは脂肪細胞から良質のRNAを得る方法論および流れのcytometryによって分析のための多数の膜区切られたマーカーの汚損によってSVFマクロファージの表現型化を含む単一のプロセスの人間の内臓の脂肪からの生存可能な脂肪細胞そして間質の管の部分SVFのセルの隔離に有効なコラゲナーゼの消化力方法を提供する。

RNA解析およびマクロファージ表現型解析に適したヒト内臓脂肪組織からの生存脂肪細胞および間質血管画分の単離

Visceral adipose tissue (VAT) is an active metabolic organ composed mainly of mature adipocytes and stromal vascular fraction (SVF) cells, which release ...

This protocol allows for isolation and study of viable adipocytes and stromal vascular fraction SVF cells from human visceral fat. Enzymatic digestion using collagenase ensures high yields of total RNA from mature adipocytes, including microRNAs suitable for expression analysis. Simultaneously, the method is optimized to identify macrophages by flow cytometry.This protocol provides fundamental troubleshooting guidelines for easy and efficient isolation of viable mature adipocytes and SVF cells from human VAT biopsies in a single process. After the uterine closure and hemostasis, identify greater omentum and extend it on a wet compress. Identify an avascular zone and use Kelly forceps to drill the outer side of visceral adipose tissue, or VAT.Use Ochsner forceps to clamp the proximal and distal side in the zone where VAT was drilled, and used Metzenbaum scissors to cut the tissue. Tie the greater omentum with black silk number one, then remove the Ochsner forceps and evaluate the hemostasis. To perform enzymatic digestion, cut four grams of VAT and use scissors to mince the tissue into small pieces in a dissection tray.Transfer the pieces to a new sterile 50-milliliter centrifuge tube and add 25 milliliters of digestion solution. Incubate the tube at 37 degrees Celsius for 60 minutes in an orbital shaker at 125 RPM. Then filter the digested tissue through three layers of gauze into a new sterile 50-milliliter centrifuge tube.Centrifuge the tube at 200 G for five minutes at four degrees Celsius. After centrifugation, two phases should be visible. The upper phase corresponds to mature adipocytes while SVF cells remain in the pellet.Transfer the mature adipocytes to a tube. Lyse cells by adding 1000 microliters of acid-guanidinium-phenol-based reagent and mix thoroughly with a P1000 micropipette to homogenize. Incubate the mixture for five minutes at room temperature to boost dissociation of nucleo-protein complexes.Centrifuge the cell lysate for five minutes at 12, 000 G to obtain three phases, an upper yellow phase corresponding to adipocyte lipids, a middle pink phase corresponding to nucleic acids, and a pellet with cellular debris. Carefully remove the lipid layer with a P200 micro pipette. Then transfer the middle phase into a new two-milliliter tube, taking care not to disturb the other phases.After purifying the RNA and measuring the concentration with a UV visible spectrophotometer, use an RNA integrity kit to determine the RNA integrity number. Then use the small RNA kit to determine the concentration and percent of microRNAs. Place the clip into a bioanalyzer.Dilute 10 microliters of SVF cell suspension into 90 microliters of 0.4%trypan blue solution, and apply 10 microliters to a standard hemocytometer. Count the viable cells carefully, excluding the dead cells, in four squares at the corner of the counting chamber. Transfer a total of 1 million SVF cells per milliliter to a five-milliliter round-bottom polypropylene test tube for flow cytometry and pellet the cells by centrifugation at 800 G for five minutes at four degrees Celsius.Vortex carefully to loosen the pellet and resuspend the cells in 100 microliters of PBS. Add the pre-titrated optimal concentration of each fluorochrome-conjugated monoclonal antibody specific for a cell surface antigen and mix gently, then incubate the cells for 15 minutes in the dark. Add an excess of cold PBS.And centrifuge the SVF at 400 G for five minutes at four degrees Celsius. Decant the supernatant, taking care to not disturb the pellet. Resuspend the pellet in five milliliters of sheath fluid.Then filter the cells through three layers of gauze into a new five-milliliter round-bottom polypropylene test tube. Vortex each tube briefly before analysis and count a minimum of 10, 000 events for flow analysis. This RNA extraction protocol was used to obtain adequate purity and high integrity RNA and microRNAs from mature adipocytes.The RNA integrity was assessed by an RNA quality control analyzer. Approximately 2.8 times 10 to the six nucleated cells were present per gram of visceral adipose tissue. The stromal vascular fraction cells were labeled with fluorophore-conjugated primary antibodies to identify and characterize 18 macrophages by fluorescence-activated cell-sorting analysis.Cell aggregates were eliminated from analysis by plotting the forward scatter area versus forward scatter height. Then cellular debris was excluded by gating the cells, based on the correct size and complexity, using forward scatter area and the side scatter area. To analyze macrophages, the monocyte and macrophage lineage cells were selected using CD45 and CD14 markers.Subsequently, the CD45-CD14 double positive cells were separated based on macrophage marker HLA-DR expression. Two subsets of macrophages were identified. In addition to identifying new cell phenotypes, this protocol makes it possible to use purified cell populations for future analyses, such as DNA methylation, post-translational modifications, and signaling pathways.

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