Name: isolation of viable adipocytes and stromal vascular fraction from human visceral adipose tissue suitable for rna analysis and macrophage phenotyping
Uploaded: 2020-10-27T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Viable Adipocytes and Stromal Vascular Fraction from Human Visceral Adipose Tissue Suitable for RNA Analysis and Macrophage Phenotyping at JoVE.c

Denne studien ble støttet fra Instituto Nacional de Perinatologia (tilskuddsnummer: 3300-11402-01-575-17 og 212250-3210-21002-06-15) og CONACyT, Fondo Sectorial de Investigación en Salud y Seguridad Social (FOSISS) (stipendnummer 2015-3-2-61661).

Denne protokollen ble godkjent av IRB ved Instituto Nacional de Perinatologia (212250-3210-21002-06-15). Det var frivillig å delta, og alle de påmeldte kvinnene signerte informert samtykke.
1. Visceral fettvevssamling
<ol><li>Få momsbiopsier gjennom delvis omentektomi under keisersnitt fra friske voksne kvinner med singleton svangerskap på sikt uten arbeidskraft.</li>
	<li>Etter livmorlukking og hemostase, fortsett å identifisere større omentum og utvide det på en våt komprimering. A...

Moms spiller en avgjørende rolle i metabolsk regulering og betennelse. Økende interesse for rollen som adipocytter og immunceller i kronisk betennelse forbundet med fedme har ført til utvikling av ulike teknikker for å skille SVF og fettceller tilstede i AT. Imidlertid tillater de fleste teknikker ikke å oppnå disse to forskjellige settene av celler som er levedyktige for nedstrøms applikasjoner fra samme momsbiopsi i en enkelt prosedyre, noe som kan være avgjørende for studier angående interaksjoner mellom adi...

Hvitt fettvev består ikke bare av fettceller eller adipocytter, men også av en ikke-fettcellefraksjon kjent som stromal vaskulær fraksjon (SVF), som inneholder en heterogen cellepopulasjon bestående av makrofager, andre immunceller som regulatoriske T-celler (Tregs), og eosinofiler, preadipocytter og fibroblaster, omgitt av vaskulært og bindevev 1,2. Fettvev (AT) regnes nå som et organ som regulerer fysiologiske prosesser relatert til metabolisme og betennelse gjennom adipokiner, cytokiner og mikroRNA produsert og frigjort av forskjellige celler i vevet, med autokrine, parakrine og endokrine effekter 3,4. Hos mennesker omfatter hvitt fettvev det subkutane fettvevet (SAT) og det viscerale fettvevet (MVA), med viktige anatomiske, molekylære, cellulære og fysiologiske forskjeller mellom dem 2,5. SAT representerer opptil 80% av human AT, mens moms ligger i bukhulen, hovedsakelig i mesenteri og omentum, og er metabolsk mer aktiv6. Videre er moms et endokrint organ som utskiller mediatorer med betydelig innvirkning på kroppsvekt, insulinfølsomhet, lipidmetabolisme og betennelse. Følgelig fører momsakkumulering til abdominal fedme og fedmerelaterte sykdommer som type-2 diabetes, metabolsk syndrom, hypertensjon og kardiovaskulær sykdomsrisiko, noe som representerer en bedre prediktor for fedmeassosiert dødelighet 6,7,8,9.
Under homeostatiske forhold samarbeider adipocytter, makrofager og de andre immuncellene for å opprettholde momsmetabolismen gjennom utskillelse av antiinflammatoriske mediatorer10. Imidlertid fremmer overdreven momsutvidelse rekrutteringen av aktiverte T-celler, NK-celler og makrofager. Faktisk, i magert moms, er forholdet mellom makrofagene 5%, mens dette forholdet stiger opp til 50% i fedme, med makrofagpolarisering fra antiinflammatorisk til proinflammatorisk fenotype, og genererer et kronisk inflammatorisk miljø10,11.
Som en konsekvens av fedmepandemien har det oppstått et forbløffende antall rapporter som omhandler ulike momsforskningsemner, inkludert adipocytbiologi, epigenetikk, betennelse, endokrine egenskaper og nye områder som ekstracellulære vesikler, blant annet 8,10,12,13. Men selv om merverdiavgiftsmiljøet er definert av krysssnakk mellom adipocytter og de fastboende eller ankommende makrofagene, har de fleste studier fokusert på bare én cellepopulasjon, og det er lite informasjon om samspillet mellom disse cellene i merverdiavgift og deres patofysiologiske konsekvenser 11,14. Videre ble verdifulle studier som adresserte adipocytt-makrofag-samspillet i AT utført ved bruk av cellelinjer, uten in vivo primingbetingelser 11,14,15. En egnet strategi for å dissekere samspillet eller det spesielle bidraget fra disse cellene i merverdiavgift krever isolering av begge celletyper fra samme fettbiopsi for å utføre in vitro-analyser som speiler så like in vivo-egenskapene som regulerer momsmetabolismen.
Selv om de ikke-enzymatiske dissosiasjonsmetodene basert på mekaniske krefter for å bryte AT, sikrer minimal manipulasjon, kan disse metodene ikke brukes hvis målet er å studere SVF-celler, da de har lavere effektivitet i celleutvinning og lav celle levedyktighet sammenlignet med enzymatiske metoder, og et større volum vev er nødvendig16,17. Enzymatisk fordøyelse ved bruk av kollagenase er en mild metode som tillater tilstrekkelig fordøyelse av kollagen og ekstracellulære matriksproteiner av fibrøst vev som WAT18 og brukes ofte når trypsin er ineffektivt eller skadelig19. Protokollen gir grunnleggende feilsøkingsretningslinjer for effektiv isolering av levedyktige modne adipocytter og SVF-celler fra humane VAT-biopsier i en enkelt prosess, ved hjelp av en kollagenase-enzymatisk fordøyelsesteknikk, og gir informasjon for å sikre høye utbytter (mengde, renhet og integritet) av totalt RNA fra modne adipocytter, inkludert mikroRNA, for nedstrøms ekspresjonsapplikasjoner. Samtidig er protokollen optimalisert for å identifisere makrofagundergrupper fra SVF-celler gjennom farging av flere membranbundne markører for videre analyse ved flowcytometri20.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 mL PCR tubes</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>PCR-02-C</td>
			<td>RNase, DNase free and nonpyrogenic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-150-C</td>
			<td>RNase, DNase free and nonpyrogenic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL serological pipettes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS4101-50EA</td>
			<td>Individually plastic wrapped</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#181;L universal pipet tip</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>T-300-L-R</td>
			<td>RNase, DNase free and nonpyrogenic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#181;L universal pipet tip</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>T-300-R-S</td>
			<td>RNase, DNase free and nonpyrogenic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 &#181;L universal pipet tip</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>T-1000-B-R</td>
			<td>RNase, DNase free and nonpyrogenic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.0 mL microcentrifuge tube</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-200-C</td>
			<td>RNase, DNase free and nonpyrogenic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#181;L universal pipet tip</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>T-200-Y-R</td>
			<td>RNase, DNase free and nonpyrogenic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2100 Bioanalyzer Instrument</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2939BA</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2101 Bioanalyzer PC</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2953CA</td>
			<td>2100 Expert Software pre-installed in PC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml Round Bottom Polystyrene Test Tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352003&#160;</td>
			<td>Snap cap, sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS430828-100EA</td>
			<td>Polipropilene, conical bottom and sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acid-guanidinium-phenol based reagent</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>R2050-1-200</td>
			<td>TRI Reagent or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent RNA 6000 Nano Kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-1511</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent Small RNA Kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-1548</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC/Cy7 anti-human CD14 Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>325620</td>
			<td>0.4 mg/106 cells, present on monocytes/macrophages, clone HCD14</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Baker</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>250 ml, non sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3912-100G</td>
			<td>Heat shock fraction, pH 5.2, &#8805;96%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chip priming station</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5065-9951</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase type II</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17101-015</td>
			<td>Powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270-100G</td>
			<td>Powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Direct-zol RNA Miniprep</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>R2051</td>
			<td>Supplied with 50 mL TRI reagen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting forceps</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Steel, serrated jaws and round ends</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection tray</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Stainless steel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl alcohol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E7023-500ML</td>
			<td>200&#160;proof, for molecular biology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS Flow Sheath Fluid</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>342003</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS Lysing Solution</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>349202</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSAria III Flow Cytometer/Cell Sorter</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>648282</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FASCDiva Software</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>642868</td>
			<td>Software v6.0 pre-installed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z359629-1EA</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manual cell counter</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mayo dissecting scisors</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Stainless steel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Adjustable temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ND2000LAPTOP</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Adjustable temperature and speed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P10&#160;variable volume&#160;micropipette&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific-Finnpipette</td>
			<td>4642040</td>
			<td>1 to 10 &#956;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P1000&#160;variable volume&#160;micropipette&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific-Finnpipette</td>
			<td>4642090</td>
			<td>100 to 1000 &#956;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P2&#160;variable volume&#160;micropipette&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific-Finnpipette</td>
			<td>4642010</td>
			<td>0.2 to 2 &#956;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P200&#160;variable volume&#160;micropipette&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific-Finnpipette</td>
			<td>4642080</td>
			<td>20 to 200 &#956;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR tube storage rack</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>R96PCRFSP</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE/Cy5 anti-human HLA-DR Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>307608</td>
			<td>0.0625 mg/106 cells, present on macrophages, clone L243</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE/Cy7 anti-human CD45 Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>304016</td>
			<td>0.1 mg/106 cells, present on leukocytes, clone H130</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3813-10PAK</td>
			<td>Powder, pH 7.4, for preparing 1 L solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette controller</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red Blood Cells Lysis Buffer</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11 814 389 001</td>
			<td>For preferential lysis of red blood cells from human whole blood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated centrifuge</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Whit adapter for 50 mL conical tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Specimen container</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipette</td>
			<td>Thermo Scientific-Samco</td>
			<td>204-1S</td>
			<td>Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250-061</td>
			<td>0.4% Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube racks</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>For different tube sizes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex Mini Shaker</td>
			<td>Cientifica SENNA</td>
			<td>BV101</td>
			<td>-</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of viable adipocytes and stromal vascular fraction from human visceral adipose tissue suitable for rna analysis and macrophage phenotyping

Visceralt fettvev (VAT) er et aktivt metabolsk organ som hovedsakelig består av modne adipocytter og stromale vaskulære fraksjonsceller (SVF), som frigjør forskjellige bioaktive molekyler som styrer metabolske, hormonelle og immunprosesser; Foreløpig er det uklart hvordan disse prosessene reguleres i fettvevet. Derfor er utviklingen av metoder som evaluerer bidraget fra hver cellepopulasjon til patofysiologien til fettvev avgjørende. Denne protokollen beskriver isolasjonstrinnene og gir de nødvendige feilsøkingsretningslinjene for effektiv isolering av levedyktige modne adipocytter og SVF fra humane VAT-biopsier i en enkelt prosess, ved hjelp av en enzymatisk fordøyelsesteknikk for kollagenase. Videre er protokollen også optimalisert for å identifisere makrofagundergrupper og utføre moden adipocyt-RNA-isolasjon for genuttrykksstudier, noe som gjør det mulig å utføre studier som dissekerer samspillet mellom disse cellepopulasjonene. Kort fortalt vaskes momsbiopsier, hakkes mekanisk og fordøyes for å generere en enkeltcellesuspensjon. Etter sentrifugering isoleres modne adipocytter ved flotasjon fra SVF-pelleten. RNA-ekstraksjonsprotokollen sikrer et høyt utbytte av totalt RNA (inkludert miRNA) fra adipocytter for nedstrøms ekspresjonsanalyser. Samtidig brukes SVF-celler til å karakterisere makrofagundergrupper (pro- og antiinflammatorisk fenotype) gjennom flowcytometrianalyse.

Denne protokollen beskriver en enzymatisk metode ved bruk av kollagenasefordøyelse etterfulgt av differensiell sentrifugering for å isolere, i en enkelt prosess, levedyktige modne adipocytter og SVF-celler fra momsbiopsier oppnådd fra friske gravide kvinner etter delvis omentektomi. I dette tilfellet bruker vi adipocytter for RNA-ekstraksjon og SVF for makrofagfenotyping.
RNA-ekstraksjonsprotokollen gjorde det mulig å oppnå RNA med tilstrekkelig renhet, høy integritet og mikroRNA fra mod...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Viable Adipocytes and Stromal Vascular Fraction from Human Visceral Adipose Tissue Suitable for RNA Analysis and Macrophage Phenotyping at JoVE.c

Isolation of Viable Adipocytes and Stromal Vascular Fraction from Human Visceral Adipose Tissue Suitable for RNA Analysis and Macrophage Phenotyping

Denne protokollen gir en effektiv kollagenasefordøyelsesmetode for isolering av levedyktige adipocytter og stromale vaskulære fraksjon-SVF-celler fra humant visceralt fett i en enkelt prosess, inkludert metodikk for å oppnå høyverdig RNA fra adipocytter og fenotypifisering av SVF-makrofager gjennom farging av flere membranbundne markører for analyse ved flowcytometri.

Isolering av levedyktige adipocytter og stromalvaskulær fraksjon fra humant visceralt fettvev egnet for RNA-analyse og makrofagfenotyping

Visceral adipose tissue (VAT) is an active metabolic organ composed mainly of mature adipocytes and stromal vascular fraction (SVF) cells, which release ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Isolation of Human Islets from Partially Pancreatectomized Patients

Investigations into the pathogenesis of type 2 diabetes and islets of Langerhans malfunction 1 have been hampered by the limited availability of type 2 ...

Experimental Generation of Carcinoma-Associated Fibroblasts (CAFs) from Human Mammary Fibroblasts

Experimental Generation of Carcinoma-Associated Fibroblasts CAFs from Human Mammary Fibroblasts

Eksperimentell Generation of Karsinom-Associated Fibroblaster (kafeer) fra Human mammary Fibroblaster

Carcinomas are complex tissues comprised of neoplastic cells and a non-cancerous compartment referred to as the 'stroma'. The stroma consists of ...

Isolation of Cardiomyocyte Nuclei from Post-mortem Tissue

Isolering av Cardiomyocyte kjerner fra Post-mortem Tissue

Identification of cardiomyocyte nuclei has been challenging in tissue sections as most strategies rely only on cytoplasmic marker proteins1. Rare events ...

Encapsulation Thermogenic Preadipocytes for Transplantation into Adipose Tissue Depots

Innkapsling Thermogenic preadipocytes for Transplantasjon inn fettvev depoter

Cell encapsulation was developed to entrap viable cells within semi-permeable membranes. The engrafted encapsulated cells can exchange low molecular ...

Isolation and Cellular Phenotyping of Mesenchymal Stem Cells Derived from Synovial Fluid and Bone Marrow of Minipigs

Isolasjon og Cellular fenotyping av stamceller Avledet fra leddvæske og benmarg av minigriser

Mesenchymal stem cells (MSCs) have been established after isolation from various tissue sources, including bone marrow and synovial fluid. Recently, ...

Stromal Vascular Fraction-enriched Fat Grafting for the Treatment of Symptomatic End-neuromata

Stromal vaskulær brøk-beriket fett pode for behandling av symptomatisk slutten-neuromata

The purpose of this study was to methodically illustrate and highlight the crucial steps of stromal vascular fraction (SVF)-enriched fat grafting as a ...

Assessment of Human Adipose Tissue Microvascular Function Using Videomicroscopy

Vurdering av menneskelig fettvev mikrovaskulær funksjon med Videomicroscopy

While obesity is closely linked to the development of metabolic and cardiovascular disease, little is known about mechanisms that govern these processes. ...

Isolation of Atrial Cardiomyocytes from a Rat Model of Metabolic Syndrome-related Heart Failure with Preserved Ejection Fraction

Isolering av Atrial Cardiomyocytes fra en rotte modell av Metabolsk syndrom-relaterte hjertesvikt med bevarte utstøting brøk

In this article, we describe an optimized, Langendorff-based procedure for the isolation of single-cell atrial cardiomyocytes (ACMs) from a rat model of ...

Clinical Protocol of Producing Adipose Tissue-Derived Stromal Vascular Fraction for Potential Cartilage Regeneration

Klinisk protokollen produsere fettvev-avledet pancreatic for potensielle brusk gjenfødelse

Osteoarthritis (OA) is one of the most common debilitating disorders.&#160;Recently, numerous attempts have been made to improve the functions of the ...

Isolation of Adipose Derived Regenerative Cells for the Treatment of Erectile Dysfunction Following Radical Prostatectomy

Isolering av adipose avledede regenerative celler for behandling av erektil dysfunksjon etter radikal prostatektomi

Stem cells are used in many research areas within regenerative medicine in part because these treatments can be curative rather than symptomatic. Stem ...