Name: isolation of viable adipocytes and stromal vascular fraction from human visceral adipose tissue suitable for rna analysis and macrophage phenotyping
Uploaded: 2020-10-27T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Viable Adipocytes and Stromal Vascular Fraction from Human Visceral Adipose Tissue Suitable for RNA Analysis and Macrophage Phenotyping at JoVE.c

Este estudo foi financiado pelo Instituto Nacional de Perinatologia (números do processo: 3300-11402-01-575-17 e 212250-3210-21002-06-15) e CONACyT, Fondo Sectorial de Investigacion en Salud y Seguridad Social (FOSISS) (processo número 2015-3-2-61661).

Este protocolo foi aprovado pelo CEP do Instituto Nacional de Perinatologia (212250-3210-21002-06-15). A participação foi voluntária e todas as mulheres inscritas assinaram o termo de consentimento livre e esclarecido.
1. Coleção de tecido adiposo visceral
<ol><li>Obter biópsias de IVA através de omentectomia parcial durante cesariana de mulheres adultas saudáveis com gravidez única a termo sem trabalho de parto.</li>
	<li>Após o fechamento uterino e hemostasia, proceder à identif...

O IVA desempenha um papel crucial na regulação metabólica e inflamação. O crescente interesse no papel dos adipócitos e das células imunes na inflamação crônica associada à obesidade levou ao desenvolvimento de diferentes técnicas para separar a FVS das células adiposas presentes na TA. No entanto, a maioria das técnicas não permite obter esses dois diferentes conjuntos de células viáveis para aplicações a jusante a partir de uma mesma biópsia de TAV em um único procedimento, o que poderia ser crucia...

O tecido adiposo branco é composto não apenas por células adiposas ou adipócitos, mas também por uma fração de células não adiposas conhecida como fração vascular estromal (FVS), que contém uma população celular heterogênea constituída por macrófagos, outras células imunes como células T reguladoras (Tregs), eosinófilos, pré-adipócitos e fibroblastos, circundados por tecido vascular e conjuntivo 1,2. O tecido adiposo (TA) é hoje considerado um órgão que regula processos fisiológicos relacionados ao metabolismo e à inflamação por meio de adipocinas, citocinas e microRNAs produzidos e liberados por diferentes células no tecido, com efeitos autócrinos, parácrinos e endócrinos 3,4. Em humanos, o tecido adiposo branco compreende o tecido adiposo subcutâneo (TAS) e o tecido adiposo visceral (TAV), com importantes diferenças anatômicas, moleculares, celulares e fisiológicas entre eles 2,5. O TSA representa até 80% do TA humano, enquanto o TAA localiza-se dentro da cavidade abdominal, principalmente no mesentério e omento, sendo metabolicamente maisativo6. Além disso, o TAV é um órgão endócrino que secreta mediadores com impacto substancial no peso corporal, sensibilidade à insulina, metabolismo lipídico e inflamação. Consequentemente, o acúmulo de TAV leva à obesidade abdominal e a doenças relacionadas à obesidade, como diabetes tipo 2, síndrome metabólica, hipertensão e risco de doença cardiovascular, representando um melhor preditor de mortalidade associada à obesidade 6,7,8,9.
Em condições homeostáticas, adipócitos, macrófagos e outras células imunes cooperam para manter o metabolismo do LV através da secreção de mediadores anti-inflamatórios10. No entanto, a expansão excessiva do TAV promove o recrutamento de células T ativadas, células NK e macrófagos. De fato, no LV magro, a proporção de macrófagos é de 5%, enquanto na obesidade essa relação sobe até 50%, com polarização dos macrófagos do fenótipo anti-inflamatório para o pró-inflamatório, gerando um ambiente inflamatório crônico10,11.
Como consequência da pandemia de obesidade, um número surpreendente de relatos tem surgido abordando diferentes tópicos de pesquisa em TAV, incluindo biologia de adipócitos, epigenética, inflamação, propriedades endócrinas, áreas emergentes como vesículas extracelulares, entre outros 8,10,12,13. No entanto, embora o ambiente de LV seja definido pelo crosstalk entre adipócitos e macrófagos residentes ou chegantes, a maioria dos estudos tem focado em apenas uma população celular, e há poucas informações sobre a interação dessas células no TAV e suas consequências fisiopatológicas11,14. Além disso, estudos valiosos abordando a interação adipócito-macrófago no TA foram realizados utilizando linhagens celulares, sem as condições de priming in vivo 11,14,15. Uma estratégia adequada para dissecar a interação ou a contribuição particular dessas células no TAV requer o isolamento de ambos os tipos celulares da mesma biópsia de gordura para realizar ensaios in vitro que espelhem o mais semelhante possível as propriedades in vivo que regulam o metabolismo do TAV.
Embora os métodos de dissociação não enzimática baseados em forças mecânicas para quebrar o TA garantam mínima manipulação, esses métodos não podem ser utilizados se o objetivo for estudar as células da FVS, pois apresentam menor eficiência na recuperação celular e baixa viabilidade celular em comparação aos métodos enzimáticos, sendo necessário maior volume de tecido16,17. A digestão enzimática com colagenase é um método suave que permite a digestão adequada do colágeno e das proteínas da matriz extracelular de tecidos fibrosos, como o WAT18, e é frequentemente utilizada quando a tripsina é ineficaz ou lesiva19. O protocolo fornece diretrizes fundamentais de solução de problemas para o isolamento eficiente de adipócitos maduros viáveis e células SVF de biópsias humanas de IVA em um único processo, usando uma técnica de digestão enzimática de colagenase, fornecendo informações para garantir altos rendimentos (quantidade, pureza e integridade) de RNA total de adipócitos maduros, incluindo microRNAs, para aplicações de expressão a jusante. Simultaneamente, o protocolo é otimizado para identificar subtipos de macrófagos de células SVF através da coloração de múltiplos marcadores ligados à membrana para posterior análise por citometria de fluxo20.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 mL PCR tubes</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>PCR-02-C</td>
			<td>RNase, DNase free and nonpyrogenic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-150-C</td>
			<td>RNase, DNase free and nonpyrogenic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL serological pipettes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS4101-50EA</td>
			<td>Individually plastic wrapped</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#181;L universal pipet tip</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>T-300-L-R</td>
			<td>RNase, DNase free and nonpyrogenic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#181;L universal pipet tip</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>T-300-R-S</td>
			<td>RNase, DNase free and nonpyrogenic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 &#181;L universal pipet tip</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>T-1000-B-R</td>
			<td>RNase, DNase free and nonpyrogenic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.0 mL microcentrifuge tube</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-200-C</td>
			<td>RNase, DNase free and nonpyrogenic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#181;L universal pipet tip</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>T-200-Y-R</td>
			<td>RNase, DNase free and nonpyrogenic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2100 Bioanalyzer Instrument</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2939BA</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2101 Bioanalyzer PC</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2953CA</td>
			<td>2100 Expert Software pre-installed in PC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml Round Bottom Polystyrene Test Tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352003&#160;</td>
			<td>Snap cap, sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS430828-100EA</td>
			<td>Polipropilene, conical bottom and sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acid-guanidinium-phenol based reagent</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>R2050-1-200</td>
			<td>TRI Reagent or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent RNA 6000 Nano Kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-1511</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent Small RNA Kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-1548</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC/Cy7 anti-human CD14 Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>325620</td>
			<td>0.4 mg/106 cells, present on monocytes/macrophages, clone HCD14</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Baker</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>250 ml, non sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3912-100G</td>
			<td>Heat shock fraction, pH 5.2, &#8805;96%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chip priming station</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5065-9951</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase type II</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17101-015</td>
			<td>Powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270-100G</td>
			<td>Powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Direct-zol RNA Miniprep</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>R2051</td>
			<td>Supplied with 50 mL TRI reagen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting forceps</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Steel, serrated jaws and round ends</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection tray</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Stainless steel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl alcohol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E7023-500ML</td>
			<td>200&#160;proof, for molecular biology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS Flow Sheath Fluid</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>342003</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS Lysing Solution</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>349202</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSAria III Flow Cytometer/Cell Sorter</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>648282</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FASCDiva Software</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>642868</td>
			<td>Software v6.0 pre-installed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z359629-1EA</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manual cell counter</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mayo dissecting scisors</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Stainless steel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Adjustable temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ND2000LAPTOP</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Adjustable temperature and speed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P10&#160;variable volume&#160;micropipette&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific-Finnpipette</td>
			<td>4642040</td>
			<td>1 to 10 &#956;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P1000&#160;variable volume&#160;micropipette&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific-Finnpipette</td>
			<td>4642090</td>
			<td>100 to 1000 &#956;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P2&#160;variable volume&#160;micropipette&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific-Finnpipette</td>
			<td>4642010</td>
			<td>0.2 to 2 &#956;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P200&#160;variable volume&#160;micropipette&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific-Finnpipette</td>
			<td>4642080</td>
			<td>20 to 200 &#956;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR tube storage rack</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>R96PCRFSP</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE/Cy5 anti-human HLA-DR Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>307608</td>
			<td>0.0625 mg/106 cells, present on macrophages, clone L243</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE/Cy7 anti-human CD45 Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>304016</td>
			<td>0.1 mg/106 cells, present on leukocytes, clone H130</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3813-10PAK</td>
			<td>Powder, pH 7.4, for preparing 1 L solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette controller</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red Blood Cells Lysis Buffer</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11 814 389 001</td>
			<td>For preferential lysis of red blood cells from human whole blood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated centrifuge</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Whit adapter for 50 mL conical tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Specimen container</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipette</td>
			<td>Thermo Scientific-Samco</td>
			<td>204-1S</td>
			<td>Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250-061</td>
			<td>0.4% Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube racks</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>For different tube sizes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex Mini Shaker</td>
			<td>Cientifica SENNA</td>
			<td>BV101</td>
			<td>-</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of viable adipocytes and stromal vascular fraction from human visceral adipose tissue suitable for rna analysis and macrophage phenotyping

O tecido adiposo visceral (TAV) é um órgão metabólico ativo composto principalmente por adipócitos maduros e células da fração vascular estromal (FRS), que liberam diferentes moléculas bioativas que controlam processos metabólicos, hormonais e imunológicos; Atualmente, não está claro como esses processos são regulados dentro do tecido adiposo. Portanto, o desenvolvimento de métodos que avaliem a contribuição de cada população celular para a fisiopatologia do tecido adiposo é crucial. Este protocolo descreve as etapas de isolamento e fornece as diretrizes de solução de problemas necessárias para o isolamento eficiente de adipócitos maduros viáveis e SVF de biópsias de TAV humano em um único processo, usando uma técnica de digestão enzimática de colagenase. Além disso, o protocolo também é otimizado para identificar subgrupos de macrófagos e realizar isolamento de RNA de adipócitos maduros para estudos de expressão gênica, o que permite a realização de estudos dissecando a interação entre essas populações celulares. Resumidamente, as biópsias de IVA são lavadas, picadas mecanicamente e digeridas para gerar uma suspensão de célula única. Após a centrifugação, adipócitos maduros são isolados por flutuação do pellet de SVF. O protocolo de extração de RNA garante um alto rendimento de RNA total (incluindo miRNAs) de adipócitos para ensaios de expressão a jusante. Simultaneamente, as células SVF são usadas para caracterizar subtipos de macrófagos (fenótipo pró e anti-inflamatório) por meio da análise por citometria de fluxo.

Este protocolo descreve um método enzimático utilizando digestão de colagenase seguida de centrifugação diferencial para isolar, em um único processo, adipócitos maduros viáveis e células SVF de biópsias de TAV obtidas de gestantes saudáveis após omentectomia parcial. Neste caso, utilizamos os adipócitos para extração de RNA e a FVA para fenotipagem de macrófagos.
O protocolo de extração de RNA permitiu a obtenção de RNA com pureza adequada, alta integridade e microRNAs de ...

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Isolation of Viable Adipocytes and Stromal Vascular Fraction from Human Visceral Adipose Tissue Suitable for RNA Analysis and Macrophage Phenotyping

Este protocolo fornece um método eficiente de digestão de colagenase para isolamento de adipócitos viáveis e células da fração vascular estromal-SVF da gordura visceral humana em um único processo, incluindo metodologia para obtenção de RNA de alta qualidade a partir de adipócitos e fenotipificação de macrófagos SVF através da coloração de múltiplos marcadores ligados à membrana para análise por citometria de fluxo.

Isolamento de Adipócitos Viáveis e Fração Vascular Estromal do Tecido Adiposo Visceral Humano Adequado para Análise de RNA e Fenotipagem de Macrófagos

Visceral adipose tissue (VAT) is an active metabolic organ composed mainly of mature adipocytes and stromal vascular fraction (SVF) cells, which release ...

This protocol allows for isolation and study of viable adipocytes and stromal vascular fraction SVF cells from human visceral fat. Enzymatic digestion using collagenase ensures high yields of total RNA from mature adipocytes, including microRNAs suitable for expression analysis. Simultaneously, the method is optimized to identify macrophages by flow cytometry.This protocol provides fundamental troubleshooting guidelines for easy and efficient isolation of viable mature adipocytes and SVF cells from human VAT biopsies in a single process. After the uterine closure and hemostasis, identify greater omentum and extend it on a wet compress. Identify an avascular zone and use Kelly forceps to drill the outer side of visceral adipose tissue, or VAT.Use Ochsner forceps to clamp the proximal and distal side in the zone where VAT was drilled, and used Metzenbaum scissors to cut the tissue. Tie the greater omentum with black silk number one, then remove the Ochsner forceps and evaluate the hemostasis. To perform enzymatic digestion, cut four grams of VAT and use scissors to mince the tissue into small pieces in a dissection tray.Transfer the pieces to a new sterile 50-milliliter centrifuge tube and add 25 milliliters of digestion solution. Incubate the tube at 37 degrees Celsius for 60 minutes in an orbital shaker at 125 RPM. Then filter the digested tissue through three layers of gauze into a new sterile 50-milliliter centrifuge tube.Centrifuge the tube at 200 G for five minutes at four degrees Celsius. After centrifugation, two phases should be visible. The upper phase corresponds to mature adipocytes while SVF cells remain in the pellet.Transfer the mature adipocytes to a tube. Lyse cells by adding 1000 microliters of acid-guanidinium-phenol-based reagent and mix thoroughly with a P1000 micropipette to homogenize. Incubate the mixture for five minutes at room temperature to boost dissociation of nucleo-protein complexes.Centrifuge the cell lysate for five minutes at 12, 000 G to obtain three phases, an upper yellow phase corresponding to adipocyte lipids, a middle pink phase corresponding to nucleic acids, and a pellet with cellular debris. Carefully remove the lipid layer with a P200 micro pipette. Then transfer the middle phase into a new two-milliliter tube, taking care not to disturb the other phases.After purifying the RNA and measuring the concentration with a UV visible spectrophotometer, use an RNA integrity kit to determine the RNA integrity number. Then use the small RNA kit to determine the concentration and percent of microRNAs. Place the clip into a bioanalyzer.Dilute 10 microliters of SVF cell suspension into 90 microliters of 0.4%trypan blue solution, and apply 10 microliters to a standard hemocytometer. Count the viable cells carefully, excluding the dead cells, in four squares at the corner of the counting chamber. Transfer a total of 1 million SVF cells per milliliter to a five-milliliter round-bottom polypropylene test tube for flow cytometry and pellet the cells by centrifugation at 800 G for five minutes at four degrees Celsius.Vortex carefully to loosen the pellet and resuspend the cells in 100 microliters of PBS. Add the pre-titrated optimal concentration of each fluorochrome-conjugated monoclonal antibody specific for a cell surface antigen and mix gently, then incubate the cells for 15 minutes in the dark. Add an excess of cold PBS.And centrifuge the SVF at 400 G for five minutes at four degrees Celsius. Decant the supernatant, taking care to not disturb the pellet. Resuspend the pellet in five milliliters of sheath fluid.Then filter the cells through three layers of gauze into a new five-milliliter round-bottom polypropylene test tube. Vortex each tube briefly before analysis and count a minimum of 10, 000 events for flow analysis. This RNA extraction protocol was used to obtain adequate purity and high integrity RNA and microRNAs from mature adipocytes.The RNA integrity was assessed by an RNA quality control analyzer. Approximately 2.8 times 10 to the six nucleated cells were present per gram of visceral adipose tissue. The stromal vascular fraction cells were labeled with fluorophore-conjugated primary antibodies to identify and characterize 18 macrophages by fluorescence-activated cell-sorting analysis.Cell aggregates were eliminated from analysis by plotting the forward scatter area versus forward scatter height. Then cellular debris was excluded by gating the cells, based on the correct size and complexity, using forward scatter area and the side scatter area. To analyze macrophages, the monocyte and macrophage lineage cells were selected using CD45 and CD14 markers.Subsequently, the CD45-CD14 double positive cells were separated based on macrophage marker HLA-DR expression. Two subsets of macrophages were identified. In addition to identifying new cell phenotypes, this protocol makes it possible to use purified cell populations for future analyses, such as DNA methylation, post-translational modifications, and signaling pathways.

Research

JoVE Journal

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