Name: isolation of viable adipocytes and stromal vascular fraction from human visceral adipose tissue suitable for rna analysis and macrophage phenotyping
Uploaded: 2020-10-27T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Viable Adipocytes and Stromal Vascular Fraction from Human Visceral Adipose Tissue Suitable for RNA Analysis and Macrophage Phenotyping at JoVE.c

Исследование выполнено при поддержке Национального института перинатологии (номера грантов: 3300-11402-01-575-17 и 212250-3210-21002-06-15) и CONACyT, Fondo Sectorial de Investigación en Salud y Seguridad Social (FOSISS) (номер гранта 2015-3-2-61661).

Этот протокол был одобрен IRB Национального института перинатологии (212250-3210-21002-06-15). Участие было добровольным, и все зарегистрированные женщины подписали форму информированного согласия.
1. Забор висцеральной жировой ткани
<ol><li>Получение биопсии с НДС путем частичной ом...

НДС играет решающую роль в регуляции обмена веществ и воспалении. Растущий интерес к роли адипоцитов и иммунных клеток в хроническом воспалении, связанном с ожирением, привел к разработке различных методов разделения SVF и жировых клеток, присутствующих в АТ. Тем не менее, большинство ме...

Белая жировая ткань состоит не только из жировых клеток или адипоцитов, но и из фракции нежировых клеток, известной как стромально-васкулярная фракция (SVF), которая содержит гетерогенную клеточную популяцию, состоящую из макрофагов, других иммунных клеток, таких как регуляторные Т-клетки (Tregs), а также эозинофилов, преадипоцитов и фибробластов, окруженных сосудистой и соединительной тканью 1,2. Жировая ткань (АТ) в настоящее время считается органом, который регулирует физиологические процессы, связанные с метаболизмом и воспалением, с помощью адипокинов, цитокинов и микроРНК, продуцируемых и высвобождаемых различными клетками в ткани, с аутокринным, паракринным и эндокринным эффектами 3,4. У человека белая жировая ткань состоит из подкожной жировой клетчатки (САТ) и висцеральной жировой ткани (ВАТ) с важными анатомическими, молекулярными, клеточными и физиологическими различиями между ними 2,5. САТ составляет до 80% АТ человека, в то время как АТ находится в брюшной полости, преимущественно в брыжейке и сальнике, будучи метаболически более активными6. Кроме того, НДС является эндокринным органом, выделяющим медиаторы, оказывающие существенное влияние на массу тела, чувствительность к инсулину, липидный обмен и воспаление. Следовательно, накопление НДС приводит к абдоминальному ожирению и связанным с ожирением заболеваниям, таким как диабет 2 типа, метаболический синдром, гипертония и риск сердечно-сосудистых заболеваний, что является лучшим предиктором смертности, связанной с ожирением 6,7,8,9.
В гомеостатических условиях адипоциты, макрофаги и другие иммунные клетки взаимодействуют для поддержания метаболизма НДС посредством секреции противовоспалительных медиаторов10. Однако чрезмерное увеличение НДС способствует рекрутированию активированных Т-клеток, NK-клеток и макрофагов. Фактически, при постном НДС соотношение макрофагов составляет 5%, в то время как при ожирении это соотношение возрастает до 50%, при этом поляризация макрофагов от противовоспалительного к провоспалительному фенотипу, генерирует хроническую воспалительную среду10,11.
В результате пандемии ожирения появилось поразительное количество отчетов, посвященных различным темам исследований НДС, включая биологию адипоцитов, эпигенетику, воспаление, эндокринные свойства и новые области, такие как внеклеточные везикулы, среди прочего 8,10,12,13. Однако, несмотря на то, что среда НДС определяется перекрестными помехами между адипоцитами и резидентными или прибывающими макрофагами, большинство исследований были сосредоточены только на одной популяции клеток, и существует скудная информация о взаимодействии этих клеток в НДС и их патофизиологических последствиях11,14. Кроме того, ценные исследования, посвященные взаимодействию адипоцитов и макрофагов при АТ, были проведены с использованием клеточных линий, в которых отсутствовали условия прайминга in vivo 11,14,15. Подходящая стратегия для анализа взаимодействия или конкретного вклада этих клеток в НДС требует выделения обоих типов клеток из одной и той же биопсии жира для проведения анализов in vitro, которые отражают как можно более схожие свойства in vivo, регулирующие метаболизм НДС.
Несмотря на то, что методы неферментативной диссоциации, основанные на механических силах для разрушения АТ, обеспечивают минимальные манипуляции, эти методы не могут быть использованы, если целью является изучение SVF-клеток, так как они имеют меньшую эффективность в восстановлении клеток и низкую жизнеспособность клеток по сравнению с ферментативными методами, а также требуется больший объем ткани16,17. Ферментативное расщепление с использованием коллагеназы является щадящим методом, который обеспечивает адекватное переваривание белков коллагена и внеклеточного матрикса волокнистых тканей, таких как WAT18, и часто используется, когда трипсин неэффективен или повреждает19. Протокол содержит фундаментальные рекомендации по устранению неполадок для эффективного выделения жизнеспособных зрелых адипоцитов и SVF-клеток из биопсии человека с НДС в одном процессе с использованием метода ферментативного расщепления коллагеназы, предоставляя информацию для обеспечения высокого выхода (количество, чистота и целостность) общей РНК из зрелых адипоцитов, включая микроРНК, для последующих применений экспрессии. В то же время протокол оптимизирован для идентификации субпопуляций макрофагов из SVF-клеток путем окрашивания нескольких мембраносвязанных маркеров для дальнейшего анализа методом проточной цитометрии20.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 mL PCR tubes</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>PCR-02-C</td>
			<td>RNase, DNase free and nonpyrogenic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-150-C</td>
			<td>RNase, DNase free and nonpyrogenic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL serological pipettes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS4101-50EA</td>
			<td>Individually plastic wrapped</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#181;L universal pipet tip</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>T-300-L-R</td>
			<td>RNase, DNase free and nonpyrogenic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#181;L universal pipet tip</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>T-300-R-S</td>
			<td>RNase, DNase free and nonpyrogenic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 &#181;L universal pipet tip</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>T-1000-B-R</td>
			<td>RNase, DNase free and nonpyrogenic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.0 mL microcentrifuge tube</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-200-C</td>
			<td>RNase, DNase free and nonpyrogenic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#181;L universal pipet tip</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>T-200-Y-R</td>
			<td>RNase, DNase free and nonpyrogenic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2100 Bioanalyzer Instrument</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2939BA</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2101 Bioanalyzer PC</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2953CA</td>
			<td>2100 Expert Software pre-installed in PC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml Round Bottom Polystyrene Test Tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352003&#160;</td>
			<td>Snap cap, sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS430828-100EA</td>
			<td>Polipropilene, conical bottom and sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acid-guanidinium-phenol based reagent</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>R2050-1-200</td>
			<td>TRI Reagent or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent RNA 6000 Nano Kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-1511</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent Small RNA Kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-1548</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC/Cy7 anti-human CD14 Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>325620</td>
			<td>0.4 mg/106 cells, present on monocytes/macrophages, clone HCD14</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Baker</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>250 ml, non sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3912-100G</td>
			<td>Heat shock fraction, pH 5.2, &#8805;96%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chip priming station</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5065-9951</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase type II</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17101-015</td>
			<td>Powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270-100G</td>
			<td>Powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Direct-zol RNA Miniprep</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>R2051</td>
			<td>Supplied with 50 mL TRI reagen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting forceps</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Steel, serrated jaws and round ends</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection tray</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Stainless steel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl alcohol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E7023-500ML</td>
			<td>200&#160;proof, for molecular biology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS Flow Sheath Fluid</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>342003</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS Lysing Solution</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>349202</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSAria III Flow Cytometer/Cell Sorter</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>648282</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FASCDiva Software</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>642868</td>
			<td>Software v6.0 pre-installed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z359629-1EA</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manual cell counter</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mayo dissecting scisors</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Stainless steel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Adjustable temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ND2000LAPTOP</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Adjustable temperature and speed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P10&#160;variable volume&#160;micropipette&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific-Finnpipette</td>
			<td>4642040</td>
			<td>1 to 10 &#956;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P1000&#160;variable volume&#160;micropipette&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific-Finnpipette</td>
			<td>4642090</td>
			<td>100 to 1000 &#956;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P2&#160;variable volume&#160;micropipette&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific-Finnpipette</td>
			<td>4642010</td>
			<td>0.2 to 2 &#956;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P200&#160;variable volume&#160;micropipette&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific-Finnpipette</td>
			<td>4642080</td>
			<td>20 to 200 &#956;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR tube storage rack</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>R96PCRFSP</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE/Cy5 anti-human HLA-DR Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>307608</td>
			<td>0.0625 mg/106 cells, present on macrophages, clone L243</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE/Cy7 anti-human CD45 Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>304016</td>
			<td>0.1 mg/106 cells, present on leukocytes, clone H130</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3813-10PAK</td>
			<td>Powder, pH 7.4, for preparing 1 L solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette controller</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red Blood Cells Lysis Buffer</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11 814 389 001</td>
			<td>For preferential lysis of red blood cells from human whole blood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated centrifuge</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Whit adapter for 50 mL conical tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Specimen container</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipette</td>
			<td>Thermo Scientific-Samco</td>
			<td>204-1S</td>
			<td>Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250-061</td>
			<td>0.4% Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube racks</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>For different tube sizes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex Mini Shaker</td>
			<td>Cientifica SENNA</td>
			<td>BV101</td>
			<td>-</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of viable adipocytes and stromal vascular fraction from human visceral adipose tissue suitable for rna analysis and macrophage phenotyping

Висцеральная жировая ткань (VAT) — это активный метаболический орган, состоящий в основном из зрелых адипоцитов и клеток стромально-васкулярной фракции (SVF), которые выделяют различные биологически активные молекулы, контролирующие метаболические, гормональные и иммунные процессы; В настоящее время неясно, как эти процессы регулируются в жировой ткани. Поэтому разработка методов, оценивающих вклад каждой клеточной популяции в патофизиологию жировой ткани, имеет решающее значение. Этот протокол описывает этапы выделения и предоставляет необходимые рекомендации по устранению неполадок для эффективного выделения жизнеспособных зрелых адипоцитов и SVF из биопсии НДС человека в одном процессе с использованием метода ферментативного расщепления коллагеназы. Кроме того, протокол оптимизирован для идентификации субпопуляций макрофагов и выделения зрелой РНК адипоцитов для исследований экспрессии генов, что позволяет проводить исследования по анализу взаимодействия между этими клеточными популяциями. Вкратце, биопсии с НДС промывают, измельчают механическим способом и переваривают для получения одноклеточной суспензии. После центрифугирования зрелые адипоциты выделяют флотацией из гранулы SVF. Протокол экстракции РНК обеспечивает высокий выход общей РНК (включая микроРНК) из адипоцитов для последующего анализа экспрессии. Одновременно SVF-клетки используются для характеристики субпопуляций макрофагов (про- и противовоспалительный фенотип) с помощью анализа методом проточной цитометрии.

В этом протоколе описывается ферментативный метод с использованием расщепления коллагеназы с последующим дифференциальным центрифугированием для выделения в одном процессе жизнеспособных зрелых адипоцитов и SVF-клеток из биопсии НДС, полученной от здоровых беременных женщин после ч...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Viable Adipocytes and Stromal Vascular Fraction from Human Visceral Adipose Tissue Suitable for RNA Analysis and Macrophage Phenotyping at JoVE.c

Isolation of Viable Adipocytes and Stromal Vascular Fraction from Human Visceral Adipose Tissue Suitable for RNA Analysis and Macrophage Phenotyping

Данный протокол обеспечивает эффективный метод расщепления коллагеназы для выделения жизнеспособных адипоцитов и клеток стромально-васкулярной фракции-SVF из висцерального жира человека в рамках одного процесса, включая методологию получения высококачественной РНК из адипоцитов и фенотипирование SVF-макрофагов путем окрашивания нескольких мембраносвязанных маркеров для анализа методом проточной цитометрии.

Выделение жизнеспособных адипоцитов и стромально-васкулярной фракции из висцеральной жировой ткани человека, пригодных для анализа РНК и фенотипирования макрофагов

Visceral adipose tissue (VAT) is an active metabolic organ composed mainly of mature adipocytes and stromal vascular fraction (SVF) cells, which release ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Isolation of Human Islets from Partially Pancreatectomized Patients

Изоляция по правам островки из не вполне Pancreatectomized Пациенты

Investigations into the pathogenesis of type 2 diabetes and islets of Langerhans malfunction 1 have been hampered by the limited availability of type 2 ...

Experimental Generation of Carcinoma-Associated Fibroblasts (CAFs) from Human Mammary Fibroblasts

Experimental Generation of Carcinoma-Associated Fibroblasts CAFs from Human Mammary Fibroblasts

Экспериментальные Генерация Карцинома-Associated Фибробласты (CAFS) из молочной железы человека Фибробласты

Carcinomas are complex tissues comprised of neoplastic cells and a non-cancerous compartment referred to as the 'stroma'. The stroma consists of ...

Isolation of Cardiomyocyte Nuclei from Post-mortem Tissue

Выделение ядер кардиомиоцитов с Посмертные тканей

Identification of cardiomyocyte nuclei has been challenging in tissue sections as most strategies rely only on cytoplasmic marker proteins1. Rare events ...

Encapsulation Thermogenic Preadipocytes for Transplantation into Adipose Tissue Depots

Инкапсуляция Термогенный преадипоциты для трансплантации в жировой ткани депо

Cell encapsulation was developed to entrap viable cells within semi-permeable membranes. The engrafted encapsulated cells can exchange low molecular ...

Isolation and Cellular Phenotyping of Mesenchymal Stem Cells Derived from Synovial Fluid and Bone Marrow of Minipigs

Выделение и клеточная Фенотипирование мезенхимальных стволовых клеток, полученных из синовиальной жидкости и костного мозга карликовых свиней

Mesenchymal stem cells (MSCs) have been established after isolation from various tissue sources, including bone marrow and synovial fluid. Recently, ...

Stromal Vascular Fraction-enriched Fat Grafting for the Treatment of Symptomatic End-neuromata

Стромальные сосудистой фракция обогащенный жира прививки для лечения симптоматических конец neuromata

The purpose of this study was to methodically illustrate and highlight the crucial steps of stromal vascular fraction (SVF)-enriched fat grafting as a ...

Assessment of Human Adipose Tissue Microvascular Function Using Videomicroscopy

Оценка микрососудистой функции человека жировой ткани с помощью Videomicroscopy

While obesity is closely linked to the development of metabolic and cardiovascular disease, little is known about mechanisms that govern these processes. ...

Isolation of Atrial Cardiomyocytes from a Rat Model of Metabolic Syndrome-related Heart Failure with Preserved Ejection Fraction

Изоляция предсердий кардиомиоцитов из крыса модели метаболических связанных с синдром сердечной недостаточности с фракция изгнания сохранившихся

In this article, we describe an optimized, Langendorff-based procedure for the isolation of single-cell atrial cardiomyocytes (ACMs) from a rat model of ...

Clinical Protocol of Producing Adipose Tissue-Derived Stromal Vascular Fraction for Potential Cartilage Regeneration

Клинический протокол производства жировой ткани производные стромальные сосудистой дроби для потенциальных регенерации хряща

Osteoarthritis (OA) is one of the most common debilitating disorders.&#160;Recently, numerous attempts have been made to improve the functions of the ...

Isolation of Adipose Derived Regenerative Cells for the Treatment of Erectile Dysfunction Following Radical Prostatectomy

Выделение регенеративных клеток жирового происхождения для лечения эректильной дисфункции после радикальной простатэктомии

Stem cells are used in many research areas within regenerative medicine in part because these treatments can be curative rather than symptomatic. Stem ...